Summary
Существует заметная потребность в улучшении информации о молекулярных водителей пищевода Барретта. Окрашивание Иммунофлуоресцентное является полезным методом для понимания последствий клеточной сигнализации на морфологии клеток. Мы представляем простой и эффективный протокол для использования иммунофлуоресцентного окрашивания для оценки терапевтического лечения в пищеводе клеток Барретта.
Abstract
Аденокарциномы пищевода (ВАС) имеет общую выживаемость менее 17% и заболеваемость EAC резко возросло за последние два десятилетия. Одним из основных факторов риска EAC является пищевод Барретта (BE), метапластические изменение чешуйчатого пищевода в ответ на хронической изжоги. Несмотря на хорошо установленного соединения между ВАС и BE, допрос молекулярных событий, в частности, измененных сигнальных путей, включающих прогрессирование быть EAC, мало изучены. Во многом это связано с отсутствием подходит в пробирке моделей, доступных для изучения этих болезней. Недавно иммортализованные BE клеточные линии стали коммерчески доступны позволяет исследований в пробирке ВЕ. Здесь мы представляем метод для иммунофлуоресцентного окрашивания увековечены BE клеточных линий, что позволяет в пробирке характеристики сигналов и структуры клеток после воздействия терапевтических соединений. Применение этих методов будет Хельр развивать понимание механизмов, участвующих в ВЕ до прогрессирования EAC и предоставить потенциальным возможности для лечения и профилактики EAC.
Introduction
Пищевод Барретта (BE) является метапластические изменение нормального плоского эпителия пищевода и следствие хронического воздействия желудочного содержимого в результате гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ) 1. BE, как думают, защитный механизм в ответ на ГЭРБ, однако присутствие ВЕ придает повышенный риск аденокарциномы пищевода (ВАС), болезни, которая несет в себе значительно плохое выживание 1. Согласно текущим оценкам, до 5,6% американского населения BE, однако, как BE часто протекает бессимптомно, считается, что большинство ВЕ остается невыявленным 2. Как частота как ГЭРБ и EAC видели постоянный рост 3, стало важно понять молекулярные механизмы, участвующие в прогрессировании BE для ВАС, в частности, эта информация потенциально может обеспечить терапевтические подходы к предотвращению прогрессирования BE для ВАС.
1. Хроническое воспаление, травма, и генотоксичным ущерб в результате длительного воздействия желудочного содержимого оказывают селективное давление на BE поражения, способствующего опухолевой прогрессии в ВАС. Ряд генетических изменений были определены во время BE в EAC прогрессии. Тем не менее, несмотря на это есть явное отсутствие понимания о точных изменений в клеточной сигнализации и последующих воздействий на структуры и функции клеток.
Увековечены в пробирке клеточных линий являются полезными инструментами для изучения эффектов клеточной сигнализации, особенно в расследовании последствий целевых терапевтических соединений. Недавнее коммерческая доступность иммортализованных BE клеточных линий позволяет для таких исследований. Хотя высокой пропускной анализы, такие как широко используемых жизнеспособности анализов, могут оказаться ценными в оценке последствий целевой терапии на клеточной пролиферации и суrvival 4-6, эти анализы не являются полезными для допроса эффекты клеточной сигнализации на морфологии клеток. Иммунофлуоресцентное окрашивание (IF) является полезным методом для изучения влияния целевой терапии от характеристик морфологических, роста и выживаемости клеток и белков, которые участвуют. Наша лаборатория адаптировался эти методы к увековечены BE клеточных линий, используя ЕСЛИ чтобы оценить эффекты клинически доступного препарата при линий BE клеток в надежде разграничения возможного chemopreventative лечение и биомаркеров для лечения наркозависимости 7. Аналогично, применение этих методов в EAC, BE и увековечил пищевода клеточные линии уже очерчены критические выводы относительно BE в EAC прогрессии 8-10. Мы находим ЕСЛИ анализ BE клеток, обработанных целевой терапии имеет значение, что позволяет для характеристики изменений в структуре клеток и локализации белков. Здесь мы представляем наши методы ПЧ иммортализованных BE клеток к сharacterize медикаментозное лечение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Клеточная линия Техническое обслуживание
- Увековеченный человека быть полноценным диспластические (СР-В, CP-C, CP-D) и метапластические (CP-А) клеточные линии по стабильной трансфекции человеческого теломеразы обратной транскриптазы (трет) белок 11.
- Поддержание BE клеточные линии кератиноцитов в средах с добавлением экстракта бычьего гипофиза (BPE), эпидермальный фактор роста (EGF), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), заменимые аминокислоты (NEAA), пенициллин-стрептомицин-неомицин (PSN) и стандарт условия для культивирования тканей (37 ° C, 5% CO 2, 98% влажности).
2. BE сотовый Покрытие
- Получение 12-луночный планшет / покровные. Поместите 18 мм покровные в стеклянную чашку Петри и автоклав. Передача в автоклаве 18 мм покровные стекла в блюдо культуры ткани 12-а, используя стерильную стеклянную пипетку, прикрепленный к вакуумной трубки. Вымойте покровное стерильной PBS и СМИ.
- Trypsinize и считать иммортализованные быть клетки. Граф клеток USIнг автоматизированный счетчик клеток или гемоцитометра. Развести клеток в культуральной среде до концентрации 20,000-40,000 клеток / мл.
- Поместите 1 мл клеток в каждой лунке, содержащей покровное для общего количества клеток в 20,000-40,000 клеток / лунку.
- С помощью стерильной пипетки аккуратно введите покровное в нижней части скважины для того, чтобы клетки приложить к покровное.
3. Медикаментозное лечение быть клетками
- Развести выбранный препарат в теплых (37 ° C) сред в желаемой концентрации и хорошо перемешать путем обращения трубки несколько раз или с помощью вихревой мешалки. Определены концентрации препарата эмпирически. Начать лечение через 24 часа после первоначального посева Бе клеток, чтобы позволить вложение клеток на на покровное
- Для сравнения и контроля, лечения дополнительный покровное Бе клеток с 0,1% транспортного средства (диметилсульфоксид [ДМСО] или агент, используемый для растворения соединения), разведенного в культуральной среде. Этикетка пластина с лабораторной ручкой для выявления наркотиков и ветомобиля обработанных образцов. Поместите клетки в инкубаторе для клеточных культур, установленной до 37 ° С, 5% СО 2, 98% влажности и выдержать в течение желаемых времени.
4. Иммунофлуоресцентное Окрашивание
- Фиксация
- После требуемого времени инкубации лекарственной терапии, аспирация носитель и мыть покровные быстро с 1x забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) при комнатной температуре (КТ, 25 ° С).
- Аспирируйте PBS и добавить 1 мл PBS, содержащие 4% PFA [4% PFA / PBS] в каждую лунку и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Аспирируйте 4% PFA / PBS и мыть покровные 3 раза, 5 мин каждый с PBS при комнатной температуре. Храните покровные в течение одной недели в PBS с 0,1% PFA при 4 ° С, при желании.
- Пермеабилизации / Блокирование
Фиксированные клетки проницаемыми PFA, чтобы позволить антителу для доступа к внутриклеточные мишени. Для внеклеточного всплыли белки, выполните все последующие шаги без сапонин добавляется в 1x PBS/0.5% раствора BSA.- Уменьшение фона путем инкубации с 50 мМ NH 4 Cl, разведенного в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и промывают один раз PBS RT в течение 5 мин.
- Инкубировать быть клетками в течение 30 мин в 100-300 мкл PBS, содержащего 0,1% сапонина и 0,5% бычьего сывороточного альбумина (BSA). Развести сапонин из стерилизованным фильтрацией 10% складе, приготовлены в воде и хранили при 4 ° С.
- Подготовка человека палаты
- Подготовка квадратную биопроб блюдо отводками в нижней части камеры с влажных бумажных полотенец и поместить слой Parafilm сверху.
- Аккуратно перенести покровные, клетки, стоящие вверх, на парафильмом с помощью щипцов и иглы шприца.
- Отметить парафильмом с лабораторной пера выявления покровные.
- Первичных антител Инкубационный
- Развести первичного антитела в PBS, содержащий как 0,5% BSA и 0,1% сапонина.
- Аккуратно промокните блокирующий раствор, используя лабораторную салфетку и добавить 100 мкл раствора первичной антител. Выдержите первичного антитела на BE клеток в течение ночи при 4 ° С.
- Вторичный Инкубационный антител
- Вымойте слайды 3x с PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина в течение 5 мин каждый при комнатной температуре.
- Развести вторичного антитела, конъюгированного с флуоресцентной меткой в PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина, что вторичное антитело распознает видов, в котором первичное антитело, поднятые.
- Добавить 100 мкл разбавленных антител к каждому покровное. Инкубируйте вторичное антитело в течение 2 ч при комнатной температуре.
- Стиральная и Монтаж покровные
- Вымойте покровные 3 раза, 5 мин каждый в PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина. Снимите промывочный буфер и добавить 100-300 мкл PBS, чтобы покровные.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двойная функцияокрашивание кузова, повторите шаги 4,4-4,5 с нужным дополнительного начального и среднего антитела в соответствии с информацией, изложенной в обсуждении. - Использование щипцов, мягко поднимите покровное и промокните от PBS с помощью лабораторной ткань или бумажное полотенце.
- Добавить 15 мкл подходящего анти-Fade монтажа среде, содержащей 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) к покровным и инвертировать покровное клетки вниз, на предметное стекло микроскопа.
- Поместите слайды в папку слайд и инкубировать от прямого света ночи при комнатной температуре, чтобы позволить трудно установить анти-увядает среднего вылечить, в соответствии с инструкциями производителя. После того, как анти-увядает среднего установил, слайды не могут быть сохранены на любом 4 ° С или -20 ° С до микроскопической визуализации.
- Вымойте покровные 3 раза, 5 мин каждый в PBS/0.5% BSA/0.1% сапонина. Снимите промывочный буфер и добавить 100-300 мкл PBS, чтобы покровные.
5. Микроскопическое Визуализация покровные
Окрашенные клетки могут быть отображены либо через конфокальной микроскопии или ЕСЛИ способен вертикально Микроскопэ. Хотя конфокальной микроскопии позволяет получить изображение с высоким разрешением в дискретные глубинах, в вертикальном положении микроскопические способен производить полезные изображения быстрее. Для краткости, метод визуализации, окрашенных BE клетки с использованием стандартной микроскопии представлена. В общем, чтобы изображения флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) или аналогичных флуорофорами (т.е. зеленый флуоресцентный белок), Техас Красный и DAPI, требуется микроскоп с фильтрами, способными различать эти флуорофоры. Проверьте микроскоп перед началом протокола, чтобы определить совместимые флуорофоры.
- Изображений на стандартной, если микроскоп
- Удалить сохраненные слайды / покровные от -20 ° С или 4 ° С и дать им возможность нагреться до комнатной температуры. Включите микроскопа и дуговой ртутной лампы.
- Наведите микроскопа с покровное обращенной к цели на столике микроскопа. Для использования масляного иммерсионного объектива, добавить каплю иммерсионного масла на покровное.
- Выберите DAPI фильтр и открыть затвор. Сфокусируйтесь на цели, глядя через окуляры, пока не появится изображение. Поскольку все клетки будут окрашиваются DAPI, ядра должны быть легко наблюдается.
- Сбор изображений с помощью соответствующего программного обеспечения для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример результатов, полученных с применением описанных процедур показано на фиг.1А-D. Покровные с CP-D и CP-C BE клетки обрабатывали в течение 24 часов с 1 мкМ семейного ингибитора Src, SKI-606, или транспортного средства (ДМСО) и окрашивали с использованием вышеуказанных процедур слипчивых Junction и Wnt сигнализации белок, β -катенин. Визуализация β-катенина было достигнуто за счет маркировки с анти-IgG кролика в сочетании с зеленым флуорофором, в то время как маркировка клеточного ядра было достигнуто путем маркировки с DAPI (синий). Покровные были установлены в микроскопа с использованием трудно установить монтажа и клетки были обследованы с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием 63X/1.4N план-Apochromat цели. Выбранный зеленый флуорофором возбуждался при 488 нм и визуализированы с помощью фильтра выбросов на 505-525 нм. Точно так же, DAPI возбуждался при 405 нм и эмиссии собранной с помощью фильтра на 410-460 нм. Деятельность тирозинкиназы, Src яувеличилась в ВЕ, особенно в тяжелой дисплазии 12. В соответствии с наблюдениями в колоректального и простаты раковых клеток 13-15, ингибирование Src приводит перелокализация β-катенина из цитоплазмы / ядра (стрелки, 1А, 1С, и 1E) к клеточной мембране (наконечники стрел, фиг.1В, 1D и 1F). Используя эти методы, мы и другие ранее показали, что ингибирование Src также изменяет экспрессию и локализацию опухолевого супрессора, p27 Kip1 7,16 и эти методы в настоящее время используются в нашей лаборатории.
μ
Рисунок 1. ПЧ иммортализованных BE клеток после лечения с ингибитором Src киназы. CP-C (AD) и CP-D (E, F) Обрабатывали транспортного средства (ДМСО, левых панелей) или 1 мкМ ингибитора Src, СКИ-606, в течение 24 часов (правая панели). BE клетки фиксировали и окрашивали в соответствии с описанным протоколом. β-катенин (зеленый) визуализировали с использованием специфического антитела и вторичного антитела, соединенный с Alexa Fluro 488, а ядро окрашивали с DAPI (синий). Обратите внимание на изменение локализации для β-катенина из ядра (стрелки) к клеточной мембране (наконечники стрел) после обработки СКИ-606. C, D) увеличенных изображений белые коробки в А и В, в дальнейшем выделить изменения в β- катенин локализации. Эти изображения представляют идеальную окрашивание с минимальным фоном и отличной окрашивания для выбранной цели. Bars, 7 мкм (A, B, D, F), 0,5 мкм (C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы наметили способ применения ИФ BE клеток к выяснению физиологические эффекты целевой терапии на этих клетках. В то время как мы описали использование этих процедур по отношению к быть клетками, мы обнаружили, что эти методы применимы также к различным различных типов клеток 13,17,18. Кроме того, эти процедуры могут быть изменены в нескольких способов оптимизации окрашивание для конкретных задач.
Мы находим один параметр, который имеет прямое влияние на правильной, если это выбор фиксации. Мы описали использование 4% PFA / PBS для фиксации в вышеупомянутых процедур, но альтернативные фиксаторы также применимы. Фиксация холодным метанолом (-20 ° C) в течение 20 мин после промывки PBS подходит для определенных белков / антител 13. Использование холодным метанолом для фиксации исключает необходимость в проницаемыми клеток. Однако выбор фиксатора (4% PFA / PBS или холодный метанол) должны быть определены эмпирически. Процедуры, изложенные выше, описывают визуализацию одного белка; Однако этот метод легко адаптируется к идентификации дополнительного цели 13. Для оптимальной, если из двух белков, первичные антитела, полученные в двух разных видов (например, один поднятой в кролика и один в мышь), либо вторичными антителами, специфически распознающие каждого вида в сочетании с различными флуорофоров, являются необходимыми. Вторичные антитела в сочетании с зеленым и красным флуорофорами, в сочетании с DAPI обеспечивают отличную контраст между целями, в дополнение к обычно исключения помех от нескольких флуорофорами. Для ЕСЛИ двух целей в BE клеток, выполнять последовательное инкубации двух основных и их соответствующих вторичных антител после записи. Шаги для мытья и монтажа слайдов остаются теми же.
Таким образом, мы предоставляем простой и удобный протокол для IF Бе клеток. Применение этих процедур может дать информаионный относительно последствий медикаментозного лечения, внедрение внематочной интересующих генов, или РНК-интерференции подавлением генов, представляющих интерес в BE клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от St, Фонда Иосифа (AJF, LJI) и Американской легочной ассоциации, RG-224 607-N (LJI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
