Summary
Existe la necesidad de mejorar la información discernible en los conductores moleculares de esófago de Barrett. La tinción de inmunofluorescencia es una técnica útil para la comprensión de los efectos de la señalización celular en la morfología celular. Se presenta un protocolo simple, efectiva para el uso de la tinción de inmunofluorescencia para evaluar el tratamiento terapéutico en las células del esófago de Barrett.
Abstract
El adenocarcinoma de esófago (EAC) tiene una tasa de supervivencia global de menos del 17% y la incidencia de EAC ha aumentado drásticamente en las últimas dos décadas. Uno de los principales factores de riesgo de EAC es el esófago de Barrett (EB), un cambio metaplásico del esófago escamoso normal en respuesta a la acidez crónica. A pesar de la relación bien establecida entre la CAO y la SER, el interrogatorio de los eventos moleculares, en particular las vías de señalización alteradas involucran progresión de la SER para EAC, son poco conocidos. Mucho de esto es debido a la falta de adecuada en modelos in vitro disponibles para estudiar estas enfermedades. Recientemente, las líneas celulares inmortalizadas BE se han convertido en disponibles en el mercado que permite estudios in vitro de BE. A continuación, presentamos un método para la tinción de inmunofluorescencia de líneas celulares inmortalizadas BE, lo que permite la caracterización in vitro de la señalización celular y la estructura después de la exposición a los compuestos terapéuticos. La aplicación de estas técnicas se help a desarrollar una idea de los mecanismos implicados en BE para EAC progresión y abren una posible vía para el tratamiento y prevención de la EAC.
Introduction
El esófago de Barrett (EB) es un cambio metaplásico en el epitelio escamoso normal del esófago y una consecuencia de la exposición crónica a los contenidos gástricas asociadas a la enfermedad de reflujo gastroesofágico (ERGE) 1. BE se piensa que es un mecanismo de protección en respuesta a la ERGE, sin embargo, la presencia de EB imparte un mayor riesgo de adenocarcinoma de esófago (EAC), una enfermedad que conlleva una significativa baja supervivencia 1. Las estimaciones actuales indican que hasta un 5,6% de la población estadounidense tiene EB, sin embargo, como BE es a menudo asintomática, se piensa que la mayoría de BE no se diagnostica 2. Como las tasas de incidencia tanto de la ERGE y EAC han visto un crecimiento continuo 3, se ha convertido en importante para comprender los mecanismos moleculares implicados en la progresión de la SER para EAC, sobre todo ya que esta información podría potencialmente proporcionar enfoques terapéuticos destinados a prevenir la progresión de la SER para EAC.
1. La inflamación crónica, lesiones y daño genotóxico como resultado de la exposición prolongada a los contenidos gástricos ejercen una presión selectiva sobre la lesión SER promoción de la progresión neoplásica de EAC. Una serie de alteraciones genéticas han sido identificadas durante la BE a la progresión de la CAO. Sin embargo, a pesar de esto hay una clara falta de comprensión acerca de los cambios exactos en la señalización celular y los efectos posteriores sobre la estructura y la función celular.
Inmortalizada en líneas celulares in vitro son herramientas útiles para estudiar los efectos de la señalización celular, sobre todo en la investigación de los efectos de los compuestos terapéuticos dirigidos. La reciente disponibilidad comercial de BE líneas celulares inmortalizadas permite para tales estudios. Aunque los ensayos de alto rendimiento, tales como los ensayos de viabilidad ampliamente usados, pueden ser valiosas para determinar los efectos de las terapias dirigidas sobre la proliferación celular y Dorvival 4-6, estos ensayos no son útiles para interrogar a los efectos de la señalización celular en la morfología celular. La tinción de inmunofluorescencia (IF) es una técnica útil para la investigación de los efectos de las terapias dirigidas en las características morfológicas, crecimiento y supervivencia de las células y las proteínas que están implicadas. Nuestro laboratorio ha adaptado estos métodos hacia líneas celulares inmortalizadas BE, usando IF para evaluar los efectos de un fármaco clínicamente disponibles a líneas celulares de BE con la esperanza de delinear un posible tratamiento quimiopreventivo y biomarcadores para el tratamiento de drogas 7. Del mismo modo, la aplicación de estas técnicas en la EAC, BE y líneas de células esofágicas inmortalizadas ha delineado los hallazgos críticos respecto a BE a EAC progresión 8-10. Hemos de encontrar si el análisis de las células pueden tratar con terapias dirigidas tiene valor, lo que permite la caracterización de los cambios en la estructura celular y localización de la proteína. A continuación, presentamos nuestros métodos de SI de ser células inmortalizadas a characterize tratamiento farmacológico.
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Protocol
1. Línea Celular Mantenimiento
- Humana inmortalizada BE displásicas de alto grado (CP-B, CP-C, CP-D) y de metaplasia (CP-A) líneas celulares mediante transfección estable de la telomerasa transcriptasa inversa humana (ter) de proteínas 11.
- Mantener BE líneas celulares en medios de queratinocitos suplementado con extracto de pituitaria bovina (BPE), factor de crecimiento epidérmico (EGF), suero bovino fetal al 5% (FBS), aminoácidos no esenciales (NEAA), penicilina-estreptomicina neomicina (PSN), y norma las condiciones de cultivo de tejidos (37 ° C, 5% CO 2, 98% de humedad).
2. SER celular Plating
- Preparación de las placas de 12 pocillos / portaobjetos. Coloque 18 mm cubreobjetos en una placa de Petri de vidrio y de autoclave. Transferencia autoclave 18 mm cubreobjetos de vidrio en un 12 pocillos placa de cultivo de tejidos utilizando una pipeta de vidrio estéril conectada a un tubo de vacío. Lavar el portaobjetos con PBS estéril y medios de comunicación.
- Trypsinize y contar las células inmortalizado. Contar las células using de un contador de células automatizado o un hemocitómetro. Diluir las células en medios de cultivo a una concentración de 20.000-40.000 células / ml.
- Coloque 1 ml de células en cada pocillo que contenía un cubreobjetos para un recuento total de 20.000-40.000 células / pocillo.
- Utilice una punta de pipeta estéril para empujar suavemente el cubreobjetos a la parte inferior del pozo para asegurar que las células se adhieren a la cubreobjetos.
3. Tratamiento de Drogas de las células de BE
- Diluir fármaco seleccionado en cálidos medios de comunicación (37 ° C) a la concentración deseada y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces o usando un mezclador de vórtice. Concentraciones de fármaco determinado empíricamente. Empiece el tratamiento 24 horas después de la siembra inicial de las células de BE para permitir que las células apego a la cubreobjetos
- Para la comparación y el control, el tratamiento de un cubreobjetos adicional de células de BE con un 0,1% del vehículo (dimetilsulfóxido [DMSO] o agente utilizado para solubilizar compuestos) diluido en medio de cultivo. Placa de identificación con una pluma de laboratorio para identificar drogas y vehículo muestras tratadas. Colocar las células en una incubadora de cultivo celular ajustado a 37 ° C, 5% de CO 2, 98% de humedad y se incuba durante puntos de tiempo deseados.
4. Inmunofluorescencia La tinción
- Fijación
- Tras el tiempo de incubación deseado de tratamiento de drogas, aspirar los medios y lavar los cubreobjetos rápidamente con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C).
- Aspirar el PBS y añadir 1 ml de PBS que contenía 4% de PFA [PFA al 4% / PBS] a cada pocillo e incubar a TA durante 30 min.
- Aspirar el 4% PFA / PBS y se lava el cubreobjetos 3x, 5 minutos cada uno con PBS a RT. Cubreobjetos tienda durante una semana en PBS/0.1% PFA a 4 ° C si se desea.
- Permeabilización / Bloqueo
Permeabilizar células PFA fijos para permitir que el anticuerpo para acceder a las dianas intracelulares. Para extracelular a la superficie las proteínas, realizar todos los pasos posteriores sin saponina añadido a la solución de BSA 1x PBS/0.5%.- Reducir fondo mediante la incubación con 50 mM de NH4Cl diluido en PBS durante 10 min a temperatura ambiente y lavar con RT PBS una vez durante 5 min.
- Incubar ser células durante 30 min en 100-300 l de PBS que contenía 0,1% de saponina y 0,5% de albúmina de suero bovino (BSA). Diluir saponina de filtro esterilizado 10%, preparada en agua y se almacenaron a 4 ° C.
- Preparación de la Cámara humana
- Preparar un plato cuadrado bioensayo por capas de la parte inferior de la cámara con toallas de papel húmedo y coloque una capa de Parafilm en la parte superior.
- Transferir suavemente el cubreobjetos, células mirando hacia arriba, hacia el Parafilm usando pinzas y una jeringa con aguja.
- Marque el Parafilm con una pluma de laboratorio para identificar cubreobjetos.
- Primaria de anticuerpos de incubación
- Diluir el anticuerpo primario en PBS que contenía tanto BSA 0,5% y 0,1% de saponina.
- Seque suavemente fuera de la solución de bloqueo utilizando un tejido de laboratorio y añadir 100 ml de la solución de anticuerpo primario. Incubar la primaria de anticuerpos en las células de BE durante la noche a 4 ° C.
- La incubación de anticuerpo secundario
- Se lavan los portas 3x con PBS/0.5% BSA/0.1% saponina durante 5 minutos cada uno a temperatura ambiente.
- Diluir anticuerpo secundario conjugado con un marcador fluorescente en PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina que el anticuerpo secundario reconoce las especies en las que se planteó el anticuerpo primario.
- Añadir 100 l de anticuerpo diluido a cada cubreobjetos. Incubar el anticuerpo secundario durante 2 horas a TA.
- Lavado y Montaje del cubreobjetos
- Lavar el portaobjetos 3x, 5 minutos en cada una PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina. Retirar el tampón de lavado y añadir 100-300 l de PBS a los cubreobjetos.
NOTA: Para la doble luchatinción cuerpo, repita los pasos 4.4 hasta 4.5 con el anticuerpo primario y secundario adicional deseado de acuerdo con información que se indica en la discusión. - Con unas pinzas, levante suavemente el cubreobjetos y borra de la PBS utilizando un tejido de laboratorio o toalla de papel.
- Añadir 15 l de un medio de montaje anti-fade adecuado que contiene 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a la cubreobjetos y invertir el cubreobjetos, las células hacia abajo, sobre un portaobjetos de microscopio de vidrio.
- Colocar los portaobjetos en una carpeta porta e incubar fuera de la luz directa durante la noche a temperatura ambiente para permitir que el medio anti-fade establecido difícil de curar, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez que el medio anti-fade ha establecido, las diapositivas se pueden almacenar ya sea en 4 ° C o -20 ° C hasta que la visualización microscópica.
- Lavar el portaobjetos 3x, 5 minutos en cada una PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina. Retirar el tampón de lavado y añadir 100-300 l de PBS a los cubreobjetos.
5. Visualización microscópica de Cubreobjetos
Las células teñidas se pueden visualizar a través de cualquiera de microscopía confocal o un SI microscópicas vertical capaze. Aunque la microscopía confocal proporciona imágenes de alta resolución en profundidades discretas, un microscopio en posición vertical es capaz de producir imágenes útiles más rápido. Por razones de brevedad, un método de formación de imágenes manchado BE células mediante microscopía estándar se presenta. En general, a la imagen isotiocianato de fluoresceína (FITC) o fluoróforos similares (es decir, proteína fluorescente verde), rojo de Texas y DAPI, requiere un microscopio con filtros capaces de discriminar estos fluoróforos. Compruebe el microscopio antes de comenzar el protocolo para determinar fluoróforos compatibles.
- Imaging en un SI Microscopio Estándar
- Retire almacenados diapositivas / cubreobjetos de -20 ° C o 4 ° C y permita que alcancen la temperatura ambiente. Encienda el microscopio y lámpara de arco de mercurio.
- Coloque portaobjetos con cubreobjetos mirando hacia el objetivo en la platina del microscopio. Para el uso de un objetivo de inmersión en aceite, añadir una gota de aceite de inmersión sobre cubreobjetos.
- Seleccione el filtro de DAPI y abrir el obturador. Enfoque el objetivo mientras mira a través de los oculares hasta que aparezca la imagen. Dado que todas las células se mancha con DAPI, los núcleos deben ser fácilmente observable.
- Recoge imágenes utilizando el software de procesamiento de imagen respectiva.
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Representative Results
Un ejemplo de los resultados obtenidos de la aplicación de los procedimientos descritos se ilustra en las Figuras 1A-D. Cubreobjetos con CP-D y ser células CP-C fueron tratados durante 24 horas con 1 mM del inhibidor de Src familia, SKI-606, o vehículo (DMSO) y se tiñeron utilizando los procedimientos anteriores para la unión adherente y Wnt de señalización de proteínas, β -catenina. Visualización de β-catenina se logró mediante el etiquetado con una IgG anti-conejo acoplada a un fluoróforo verde, mientras que el marcado del núcleo celular se llevó a cabo mediante el etiquetado con DAPI (azul). Cubreobjetos fueron montados en portaobjetos de microscopio utilizando establecen duro de montaje y las células fueron imágenes utilizando el escaneo láser confocal microscopio utilizando un objetivo de plan de apochromat 63X/1.4N. El fluoróforo verde elegido estaba emocionado a 488 nm y se visualizó utilizando un filtro de emisión a 505-525 nm. Del mismo modo, DAPI se excitó a 405 nm y emisión recogidos usando un filtro a 410-460 nm. Actividad de la quinasa de tirosina, Src is aumentaron en BE, sobre todo en la displasia de alto grado 12. En concordancia con las observaciones en colorrectales y de próstata células cancerosas 13-15, la inhibición de Src resulta en la relocalización de β-catenina desde el citoplasma / núcleo (flechas, figuras 1A, 1C, y 1E) a la membrana celular (puntas de flecha, las Figuras 1B, 1D, y 1F). El uso de estas técnicas, nosotros y otros han demostrado previamente que la inhibición de Src también altera la expresión y localización de la supresor de tumor, p27 Kip1 7,16 y estos métodos se utilizan actualmente dentro de nuestro laboratorio.
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Figura 1. SI de ser células inmortalizadas después del tratamiento con un inhibidor de Src quinasa. CP-C (AD) y CP-D (E, F) Fueron tratados con vehículo (DMSO, paneles de la izquierda) o 1 mM del inhibidor de Src, SKI-606, durante 24 horas (paneles de la derecha). Ser células fueron fijadas y teñidas de acuerdo con el protocolo descrito. β-catenina (verde) se visualizó utilizando un anticuerpo específico y un anticuerpo secundario acoplado a Alexa Fluro 488, mientras que el núcleo se tiñó con DAPI (azul). Tenga en cuenta el cambio en la localización de β-catenina en el núcleo (flechas) a la membrana celular (puntas de flecha) después del tratamiento con SKI-606. C, D) las imágenes ampliadas de las cajas blancas en A y B, resalte aún más los cambios en β- localización catenina. Estas imágenes representan la tinción de ideales con el fondo mínimo y tinción distinta para el destino elegido. Bares, 7 m (A, B, D, F), 0,5 m (C, D).
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Discussion
Hemos esbozado un método para la aplicación de SI de las células de BE a la aclaración de los efectos fisiológicos de las terapias dirigidas sobre estas células. Aunque se han descrito el uso de estos procedimientos hacia células BE, hemos encontrado que estos métodos son también aplicables a una variedad de diferentes tipos de células 13,17,18. Además, estos procedimientos pueden ser alterados de varias maneras de optimizar la tinción para objetivos específicos.
Nos encontramos con un parámetro que tiene un efecto directo sobre la correcta IF es la elección de la fijación. Hemos descrito el uso de PFA al 4% / PBS durante la fijación en los procedimientos anteriores pero fijadores alternativos también son aplicables. La fijación con metanol frío (-20 ° C) durante 20 min después de lavar con PBS es adecuado para ciertas proteínas / anticuerpos 13. El uso de metanol frío para la fijación niega la necesidad de permeabilizar las células. Sin embargo, la elección de fijador (4% de PFA / PBS o metanol frío) se debe determinar empíricamente. Los procedimientos descritos anteriormente describen la visualización de una única proteína; Sin embargo este método es fácilmente adaptable a la identificación de un objetivo adicional 13. Para una óptima SI de dos proteínas, anticuerpos primarios planteados en dos especies diferentes (por ejemplo, uno en conejo y uno en ratón), y secundaria de anticuerpos que reconocen específicamente cada especie, junto a diferentes fluoróforos, son necesarios. Los anticuerpos secundarios acoplados a fluoróforos verdes y rojos, combinados con DAPI proporcionan un excelente contraste entre objetivos, además de evitar generalmente la interferencia de los múltiples fluoróforos. Para IF de dos blancos en células de BE, lleve a cabo la incubación secuencial de dos anticuerpos primarios, secundarios y sus respectivos después de la fijación. Pasos para el lavado y montaje de diapositivas siguen siendo los mismos.
En resumen, ofrecemos un protocolo sencillo y útil para la SI de las células de BE. La aplicación de estos procedimientos puede producir Information con respecto a los efectos de la farmacoterapia, la introducción de genes ectópicos de interés, o RNAi regulación a la baja de los genes de interés en las células de BE.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de la St, Fundación de José (AJF, LJI) y la Asociación Americana del Pulmón, RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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