Summary
有一个明显的需要对Barrett食管的分子驱动程序改进的信息。免疫荧光染色对于理解细胞信号转导的对细胞形态的影响的有效技术。我们提出了一个简单，有效的协议，使用免疫荧光染色，以评估在Barrett食管细胞治疗治疗。
Abstract
食管腺癌（EAC）小于17％，总生存率和EAC的发病率急剧上升，在过去的二十年。其中选管会的主要危险因素是Barrett食管（BE），正常食管鳞状在应对慢性胃灼热化生变化。尽管东非共同体之间的行之有效的连接进行的分子事件，涉及的进展特别是改变信号通路的审讯是选管会，了解甚少。这在很大程度上是由于可用来研究这些疾病的体外模型缺乏合适的。最近，永生BE细胞系已成为市售允许在体外研究中BE的。在这里，我们提出了BE永生细胞株的免疫荧光染色的方法，使在细胞信号传导和结构暴露于治疗化合物后体外表征。这些技术的应用将HELp开发洞察参与是EAC的发展机制，并为治疗和预防EAC的潜在途径。
Introduction
巴雷特食管（BE）是在食管的正常鳞状上皮和慢性暴露于胃食管返流疾病（GERD）1得到的胃内容物的结果化生变化。 BE被认为是针对胃食管反流病的一种保护机制，不过需要的存在赋予食管腺癌（EAC），这种疾病它带有一个显著较差生存1的风险增加。目前的估计表明，美国人口最多5.6％的BE，但是因为BE是常无症状，它被认为是被大多数人仍然未确诊2。由于两个GERD和EAC的发病率已经看到了持续增长3，它已成为重要的是了解参与是EAC的发展的分子机制，特别是因为这些信息可能会提供对预防是选管会的进展的治疗方法。
1的当前模式。慢性炎症，损伤，以及长期暴露于胃内容物造成基因毒性损伤施加的BE病灶促进肿瘤进展到选管会选择压力。许多遗传改变已经确定过程中，以选管会的进展。然而，尽管这有一个明显的缺乏了解的细胞信号转导的确切变化，在细胞结构和功能后续影响。
永生体外细胞系是研究细胞信号传导的影响，特别是在调查针对性治疗化合物的作用的有用工具。 BE永生化细胞系的近期商业可用性允许这种研究。虽然高通量测定法，如广泛使用的活力检测，可以在评估靶向疗法后的细胞增殖和苏效果是有价值的rvival 4-6，这些测定是不用于询问细胞信号后的细胞形态的影响是有用的。免疫荧光染色（IF）是用于研究的靶向治疗后细胞的形态学，生长和存活的特性和所涉及的蛋白质的效果的有效技术。我们实验室已经适应了这些方法对永生化BE细胞系，用IF来评价在划定一个可能的化学预防治疗和生物标志物的药物治疗7的希望时BE细胞系在临床可用的药物的作用。同样，在选管会应用这些技术，BE和食管永生化细胞系已划定有关BE选管会的进展8-10关键的发现。我们发现如果用靶向疗法治疗BE细胞的分析具有价值，允许改变细胞结构和蛋白定位的表征。在这里，我们提出我们的方法，如果永生BE细胞的characterize药物治疗。
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Protocol
1。细胞株维护
- 永生化人是高度不典型增生（CP-B，CP-C，CP-D）和化生（CP-）细胞株的端粒酶稳定转染逆转录酶（TERT）蛋白11。
- 维持在补充有牛垂体提取物（BPE），表皮生长因子（EGF），5％胎牛血清（FBS），非必需氨基酸（NEAA），青霉素 - 链霉素 - 新霉素（PSN）角质形成细胞介质的细胞系，以及标准组织培养条件下（37℃，5％CO 2，98％湿度）。
2，BE细胞电镀
- 制备12孔板/盖玻片。放置18毫米盖玻片到玻璃培养皿中并高压灭菌。转让蒸压18毫米盖玻片成使用连接到真空管中的无菌玻璃吸管12孔组织培养皿中。用无菌PBS和媒体冲洗盖玻片。
- 胰蛋白酶消化并计数BE永生细胞。计数细胞USI纳克自动细胞计数器或血球。稀释细胞培养基至20,000-40,000个细胞/ ml的浓度。
- 取1 ml萃取池在每孔中含有盖玻片为20,000-40,000个细胞/孔的细胞总数。
- 使用无菌移液管尖端到盖玻片轻轻推到井的底部，以确保细胞附着在盖玻片上。
3，新药必须经过细胞治疗
- 稀释所选药物在温暖（37℃）介质到所需的浓度和通过反复颠倒试管或用涡旋混合器充分混合。确定药物浓度经验。以下的BE细胞的初始接种，以允许细胞附着在盖玻片开始治疗24小时
- 为了便于比较和对照，治疗BE细胞与0.1％的车辆（二甲基亚砜[DMSO]或代理人用于溶解化合物）稀释培养基附加盖玻片。标牌与实验室用笔来识别药品和VEhicle处理的样品。放置细胞到细胞培养孵化器设置在37℃，5％CO 2，98％湿度下孵育期望的时间点。
4，免疫荧光染色
- 固定术
- 下列药物的治疗所需的温育时间，吸出介质并在室温（RT，25℃）用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）快速洗涤盖玻片。
- 吸出PBS并加入1ml的PBS含4％PFA [4％PFA / PBS]向每个孔中，并在室温下孵育30分钟。
- 吸出4％PFA / PBS中，并用PBS在室温下洗涤盖玻片3次，每次5分钟。店铺盖玻片在PBS/0.1％PFA中于4℃，如果需要一个星期。
- 透/封锁
通透固定PFA细胞，使抗体来访问胞内靶标。对于细胞外蛋白质浮出水面，执行所有后续步骤而无需皂甙添加到1X PBS/0.5％BSA溶液。- 减少背景通过用50mM NH 4 Cl 2稀释在PBS中在RT下10分钟温育和利用RT PBS洗涤一次5分钟。
- 在100-300微升PBS，含0.1％皂角苷和0.5％牛血清白蛋白（BSA）孵育BE细胞30分钟。从过滤灭菌的10％储备稀皂甙，在水中制备并保存于4℃。
- 人力商会的制备
- 通过层叠用湿纸巾的腔室的底部准备一个正方形的生物测定皿，然后将封口膜之上的层。
- 轻轻地用钳子和一个注射器针头朝上盖玻片，细胞，转移到的封口膜。
- 标记的封口膜与实验室笔识别盖玻片。
- 初级抗体孵育
- 稀释的一抗在PBS中含有0.5％BSA和0.1％皂苷。
- 用实验室组织轻轻吸去封闭液，加入100微升的主要抗体溶液。孵育一抗上的BE细胞过夜，在4℃下
- 二抗孵育
- 洗了3倍的幻灯片用PBS/0.5％BSA/0.1％皂素为每5分钟在室温。
- 稀释缀合有荧光标记在PBS/0.5％BSA/0.1％皂苷，二次抗体识别，其中第一抗体升高的物种的二级抗体。
- 加入100μl稀释抗体每个盖玻片。孵育二次抗体为2小时，在室温。
- 洗涤和盖玻片的安装
- 在PBS/0.5％BSA/0.1％皂素的洗涤盖玻片3次，每次5分钟。除去洗涤缓冲液，并加入100-300微升PBS的盖玻片。
注：对于双反体染色，重复根据在讨论中所述的信息的步骤4.4-4.5与所需的额外初级和次级抗体。 - 使用镊子，轻轻抬起盖玻片，吸去PBS的使用实验室组织或纸巾。
- 加入15微升含4的合适的抗褪色封固剂'，6 - 二脒基-2 - 苯基吲哚（DAPI）的盖玻片和反转盖玻片，将细胞下来，到玻璃显微镜载片上。
- 将幻灯片放入幻灯片的文件夹，并培育远离直射光隔夜在室温，使硬盘设置防褪色媒体治愈，根据制造商的说明。一旦防褪色介质已经设置，幻灯片可以存储在任一4℃或-20℃直到显微可视化。
- 在PBS/0.5％BSA/0.1％皂素的洗涤盖玻片3次，每次5分钟。除去洗涤缓冲液，并加入100-300微升PBS的盖玻片。
盖玻片5。微观可视化
染色的细胞可以通过两种共聚焦显微镜或成像如能直立microscopË。虽然激光共聚焦显微镜提供高清晰度图像离散深处，一个堂堂正正的显微镜能够产生有用的图像的速度更快。为了简便起见，成像的方法染色用标准显微镜呈现BE细胞。在一般情况下，对图像异硫氰酸荧光素（FITC）或类似荧光基团（ 即绿色荧光蛋白），德克萨斯红和DAPI，需要有能够识别这些荧光团的过滤器的显微镜。开始协议来确定兼容的荧光团前请检查显微镜。
- 成像上一个标准的IF显微镜
- 从-20℃或4℃保存删除幻灯片/盖玻片，让他们温至室温。上电镜和汞弧灯。
- 将载玻片与盖玻片朝向目标到显微镜的阶段。使用油浸物镜，加一滴浸油的盖玻片上。
- 选择DAPI过滤器，然后打开快门。 专注于目标，同时通过目镜找，直到图像的显示。由于所有细胞将用DAPI染色，细胞核应便于观察。
- 使用相应的图像处理软件采集图像。
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Representative Results
从应用程序的描述的方法获得的结果的一个例子示于图1A-D中 。盖玻片带CP-D和CP-C BE细胞24小时，分别用1微米的Src家族抑制剂，SKI-606，或车辆（DMSO），并使用了粘着连接和Wnt上述程序信号蛋白，β染色-catenin的。 β-连环蛋白的可视化是通过用抗兔IgG结合到绿色荧光标记来实现，而在细胞核的标记是完成了用DAPI（蓝色）标记。盖玻片封片使用硬设置安装并使用激光扫描共聚焦显微镜使用63X/1.4N计划复消色差透镜的目标细胞进行成像，以显微镜载玻片。所选择的绿色荧光团被激发在488 nm和使用发射滤光片在505-525 nm的可视化。同样，DAPI被激发在405nm和发射用的滤波器在410-460 nm处收集。酪氨酸激酶Src的活性我s提高BE，特别是在高级别不典型增生12。在一致性与在大肠癌和前列腺癌的细胞13-15观察，抑制Src通过导致β-连环蛋白的重定位从细胞质/细胞核（箭头， 图1A，1C和1E）在细胞膜上（箭头， 图1B所示， 1D和1F）。使用这些技术，我们和其他人曾表明，抑制Src的也改变了肿瘤抑制基因，P27 KIP1 7,16和这些方法目前正在我们的实验室中使用的表达和定位。
μ
图1。如果永生BE细胞在与Src激酶的抑制剂CP-C（AD）和CP-D（E，F处理）与载体（DMSO，左侧面板）或1微米的Src抑制剂，SKI-606进行了治疗，24小时（右图）。 BE细胞根据所描述的协议固定并染色。使用特异性抗体和连接到Alexa的FLURO 488的第二抗体β-连环蛋白（绿色）中的可视化，而细胞核用DAPI染色（蓝色）。注意：在本地化的变化β-连环蛋白从细胞核（箭头），细胞膜（箭头）在与SKI-606 C，D）治疗白框在A和 B放大图像，进一步突出的变化，β- catenin的定位。这些图像代表以最小的背景和独特的染色所选择的目标理想的染色。酒吧，7微米（A，B，D，F），0.5微米（C，D）。
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Discussion
我们提出的申请，如果来的细胞对阐明在这些细胞的靶向治疗药物的生理效应的方法。尽管我们已经描述了使用对BE细胞这些过程，我们已经发现，这些方法也适用于各种不同类型的细胞13,17,18的。此外，这些程序可以改变多种方式来优化染色的具体目标。
我们发现，在具有适当的中频，直接影响一个参数是固定的选择。我们已经描述了使用4％PFA / PBS中固定在上面的程序，但替代性固定剂也适用。固定用冷甲醇（-20℃）20分钟，用PBS洗涤后，适用于某些蛋白质/抗体13。用冷甲醇为固定否定了需要通透的细胞。然而，固定剂的选择（4％PFA / PBS或冷的甲醇），必须根据经验来确定。 上面所述的程序描述单个蛋白质的可视化;然而，这种方法很容易适应识别的附加 目标13。两种蛋白质以获得最佳的IF，在两个不同的物种（例如，一个在兔凸起，一个在鼠标），并且第二抗体特异性地识别每个物种，其耦合到不同的荧光团提出的主要抗体，是必要的。耦合到绿色和红色荧光，结合DAPI第二抗体提供的目标之间具有优异的对比度，除了通常避免干扰，从多个荧光团。对于在BE细胞若两个目标，执行两个主要和各自的二级抗体的连续培养下固定。用于洗涤和幻灯片的安装步骤是相同的。
综上所述，我们提供了一个简单而有用的协议假如是细胞。这些应用程序可以产生了信息离子有关药物治疗，引进了兴趣异位基因，或在BE细胞目的基因的RNA干扰下调的影响。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是从圣，若瑟基金会（AJF，LJI）和美国肺脏协会，RG-224607-N（LJI）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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