Summary
Det finns en märkbar behov av förbättrad information om molekylära förare av Barretts esofagus. Immunofluorescens-färgning är en användbar teknik för att förstå effekterna av cellsignalering på cellmorfologi. Vi presenterar ett enkelt, effektivt protokoll för användning av immunofluorescerande färgning för att utvärdera terapeutisk behandling i Barretts esophagus celler.
Abstract
Esofagus adenocarcinom (EAC) har en total överlevnad på mindre än 17% och förekomsten av EAC har ökat dramatiskt under de senaste två decennierna. En av de primära riskfaktorerna för EAC är Barretts esofagus (BE), en metaplastisk förändring av den normala skvamösa esophagus som svar på kronisk halsbränna. Trots den väl etablerade samband mellan EAC och BE, förhör av de molekylära händelser, särskilt förändrade signalsystem som involverar utvecklingen av BE till EAC, är dåligt kända. Mycket av detta beror på avsaknaden av lämpliga in vitro-modeller finns tillgängliga för att studera dessa sjukdomar. Nyligen har förevigat BE cellinjer blivit kommersiellt tillgängliga som medger in vitro-studier av BE. Här presenterar vi en metod för immunofluorescens färgning av odödliga BE cellinjer, vilket gör in vitro karaktärisering av cellsignalering och struktur efter exponering för terapeutiska föreningar. Tillämpning av dessa tekniker kommer att HELp utvecklar insikt i de mekanismer som är involverade i BE till EAC progression och ge potentiella vägar för behandling och förebyggande av EAC.
Introduction
Barretts esofagus (BE) är en metaplastisk förändring i den normala skivepitel av matstrupen och en följd av kronisk exponering för maginnehåll följer av gastroesofageal refluxsjukdom (GERD) 1. BE är tänkt att vara en skyddande mekanism som svar på GERD emellertid närvaron av BE förlänar en ökad risk för esofagusadenokarcinom (EAC), en sjukdom som uppbär en signifikant dålig överlevnad 1. Aktuella uppskattningar tyder på att upp till 5,6% av den amerikanska befolkningen har BE, men som BE är ofta symptomfri, är det tänkt att majoriteten av BE förblir odiagnostiserade 2. Eftersom incidensen av både GERD och EAC har sett fortsatt tillväxt 3, har det blivit viktigt att förstå de molekylära mekanismer som är inblandade i utvecklingen av BE till EAC, särskilt eftersom denna information skulle kunna ge terapeutiska strategier för att förhindra progression av BE till EAC.
1. Kronisk inflammation, skada, och genotoxiska skador till följd av långvarig exponering för maginnehåll utövar selektivt tryck på BE lesionen främja neoplastisk progression till EAC. Ett antal genetiska förändringar har identifierats under BE till EAC progression. Trots detta finns det en tydlig brist på förståelse om de exakta förändringarna i cellsignalering och efterföljande effekter på cellstruktur och funktion.
Förevigat in vitro cellinjer är användbara verktyg för att studera effekter av cellsignalering, särskilt i att undersöka effekterna av riktade terapeutiska föreningar. Den senaste tidens kommersiella tillgängligheten av odödliga BE cellinjer möjliggör sådana studier. Trots hög kapacitet analyser, såsom de allmänt använda lönsamhetsanalyser, kan vara värdefull för bedömningen av effekterna av riktade terapier vid celldelning och survival 4-6, dessa analyser inte är användbara för att förhöra effekterna av cellsignalering vid cell morfologi. Immunofluorescerande färgning (IF) är en användbar teknik för att undersöka effekterna av riktade terapier vid de egenskaper morfologiska, tillväxt och överlevnad av celler och proteiner som är involverade. Vårt laboratorium har anpassat dessa metoder mot odödliga BE cellinjer, med hjälp av IF för att utvärdera effekterna av ett kliniskt tillgängliga läkemedel på BE cellinjer i hopp om att avgränsa en eventuell chemopreventative behandling och biomarkör för läkemedelsbehandling 7. På samma sätt, tillämpning av dessa tekniker i EAC, BE och förevigade esofagus cellinjer har avgränsat kritiska rön angående BE till EAC progression 8-10. Vi finner IF analys av BE celler som behandlats med riktade terapier har värde, vilket möjliggör karakterisering av förändringar i cellstruktur och protein lokalisering. Här presenterar vi våra metoder för IF av odödliga BE celler till characterize drogbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Line Maintenance
- Immortaliserad human BE höggradiga dysplastiska (CP-B-, CP-C, CP-D) och metaplastisk (CP-A)-cellinjer genom stabil transfektion av den humana telomeras-omvänt transkriptas (TERT)-protein 11.
- Bibehåll BE cellinjer i keratinocyt-medium kompletterat med bovint hypofysextrakt (BPE), epidermal tillväxtfaktor (EGF), 5% fetalt bovint serum (FBS), icke-essentiella aminosyror (NEAA), penicillin-streptomycin-neomycin (PSN) och standard vävnadsodlingsförhållanden (37 ° C, 5% CO2, 98% fuktighet).
2. BE Cell Plating
- Beredning av 12-brunnar / täckglas. Placera 18 mm täckglas i ett glas petriskål och autoklav. Transfer autoklaveras 18 mm glastäckglas i en 12-brunnars vävnadsodlingsplatta med en steril glaspipett fäst vid ett vakuumrör. Tvätta täckglas med steril PBS och media.
- Trypsinize och räkna immortaliserade vara celler. Räkna celler USIng en automatiserad cellräknare eller en hemocytometer. Späd celler i odlingsmedium till en koncentration av 20,000-40,000 celler / ml.
- Placera 1 ml celler i varje brunn innehållande ett täckglas för totalt cellantal av 20,000-40,000 celler / brunn.
- Använd en steril pipettspets för att försiktigt pressa täckglas till botten av brunnen för att säkerställa att celler fäster vid täckglas.
3. Läkemedelsbehandling av BE celler
- Späd valda läkemedlet i varma (37 ° C) media till önskad koncentration och blanda väl genom att vända röret flera gånger eller genom att använda en vortexblandare. Avgörs läkemedelskoncentrationer empiriskt. Börja behandling 24 timmar efter den första sådd av BE cellerna för att låta celler fastsättning på till täckglas
- För jämförelse och kontroll, behandla en extra täckglas av BE celler med 0,1% fordon (dimetylsulfoxid [DMSO] eller medel som används för att lösa förening) utspädd i odlingsmedia. Etikett tallrik med ett labb penna för att identifiera narkotika och vedonet behandlade prover. Placera cellerna i en cellkultur inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2, 98% fuktighet och inkubera önskade tidpunkter.
4. Immunofluorescerande färgning
- Fixering
- Efter önskad inkubationstid på läkemedelsbehandling, aspirera media och tvätta täck snabbt med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur (RT, 25 ° C).
- Aspirera PBS och tillsätt 1 ml av PBS innehållande 4% PFA [4% PFA / PBS] till varje brunn och inkubera vid RT i 30 min.
- Aspirera 4% PFA / PBS och tvätta täck 3x, 5 min vardera med PBS vid RT. Store täckglas för en vecka i PBS/0.1% PFA vid 4 ° C om så önskas.
- Permeabilization / Blockering
Permeabilisera fixerade PFA celler så att antikroppen för att få tillgång till intracellulära mål. För cellulära dykt proteiner, utföra alla efterföljande steg utan saponin läggs till BSA-lösningen 1x PBS/0.5%.- Minska bakgrund genom inkubation med 50 mM NH4CI utspädd i PBS under 10 min vid RT och tvätta med RT PBS en gång under 5 min.
- Inkubera vara celler under 30 min i 100 till 300 | il av PBS innehållande 0,1% saponin och 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Späd saponin från filtersteriliserad 10% lager, beredas i vatten och förvaras vid 4 ° C.
- Framställning av humant avdelningen
- Förbered en kvadrat bioanalys skålen genom skiktning i botten av kammare med våta pappershanddukar och placera ett skikt av Parafilm ovanpå.
- Överföra försiktigt täckglas, celler uppåt, på Parafilm med hjälp av pincett och en injektionsnål.
- Markera Parafilm med en labb penna för att identifiera täckglas.
- Primär Antikropp Inkubation
- Späd den primära antikroppen i PBS innehållande både 0,5% BSA och 0,1% saponin.
- Blot försiktigt av den blockerande lösningen med användning av en laboratorie-vävnad och tillsätt 100 | il av den primära antikroppen lösningen. Inkubera den primära antikroppen på de vara celler över natten vid 4 ° C.
- Sekundär antikropp Inkubation
- Tvätta bilderna 3x med PBS/0.5% BSA/0.1% saponin under 5 min vardera vid RT.
- Späd sekundär antikropp konjugerad med en fluorescerande tagg i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin som den sekundära antikroppen känner igen de arter där den primära antikroppen upp.
- Addera 100 pl av utspädd antikropp till varje täckglas. Inkubera den sekundära antikroppen under 2 h vid RT.
- Tvätt och Montering av Täck
- Tvätta täck 3x, 5 min vardera i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Avlägsna tvättbufferten och till 100-300 l PBS till täckglas.
OBS: För dubbel antikropps färgning, upprepa steg från 4,4 till 4,5 med den önskade ytterligare primär och sekundär antikropp enligt uppgifter beskrivs i diskussionen. - Använd pincett, försiktigt lyfta upp täckglas och torka bort PBS med hjälp av ett laboratorium vävnad eller pappershandduk.
- Tillsätt 15 l av en lämplig anti-fade montering media innehållande 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) till täckglas och invertera täckglas, celler nedåt, på ett glas objektglas.
- Placera glasen i en bild mapp och inkubera borta från direkt ljus över natten vid rumstemperatur för att låta den hårda set mot blekna medium för att bota, enligt tillverkarens instruktioner. När anti-fade medium har satt kan diabilder förvaras vid antingen 4 ° C eller -20 ° C tills mikroskopisk visualisering.
- Tvätta täck 3x, 5 min vardera i PBS/0.5% BSA/0.1% saponin. Avlägsna tvättbufferten och till 100-300 l PBS till täckglas.
5. Mikroskopisk Visualisering av Täck
Färgade celler kan avbildas via antingen konfokalmikroskopi eller IF kapabla upprätt microscope. Även konfokalmikroskopi ger högupplösta bilder med diskreta djup, är en upprätt mikroskop som kan producera användbara bilder snabbare. För korthets skull färgades ett förfarande för avbildning BE celler med användning av standard-mikroskopi presenteras. I allmänhet, för att visuellt fluoresceinisotiocyanat (FITC) eller liknande fluoroforer (dvs grönt fluorescerande protein), Texas Red och DAPI, kräver ett mikroskop med filter med förmåga att särskilja dessa fluoroforer. Kontrollera mikroskop innan protokollet för att fastställa kompatibla fluoroforer.
- Imaging på en standard IF Mikroskop
- Ta bort lagrade diabilder / täckglas från -20 ° C eller 4 ° C och tillåta dem att värmas till rumstemperatur. Ström på mikroskop och kvicksilverbåglampa.
- Placera objektglas med täck vänd mot målet på mikroskop scenen. För användning av oljeimmersionsobjektiv, tillsätt en droppe immersionsolja på täckglas.
- Markera DAPI filtret och öppna slutaren. Fokusera på målet samtidigt som du tittar genom okularen tills bilden visas. Eftersom alla celler kommer att färgas med DAPI bör kärnorna vara lätt att observera.
- Samla bilder med hjälp av respektive bildbehandlingsprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på de resultat som uppnåtts genom tillämpning av de beskrivna förfarandena illustreras i figurerna 1A-D. Täckglas med CP-D och CP-C-BE celler behandlades under 24 timmar med 1 ^ M av Src familjen hämmare, SKI-606, eller fordon (DMSO) och färgas med hjälp av ovanstående procedurer för adherens och Wnt signalering protein, β -catenin. Visualisering av β-catenin uppnåddes genom märkning med ett anti-kanin-IgG kopplat till en grön fluorofor, medan märkning av cellkärnan åstadkoms genom märkning med DAPI (blå). Täckglas monterades på objektglas med hjälp av hårt satt montering och celler avbildas med laserskanning konfokalmikroskop med hjälp av en 63X/1.4N plan Apochromat mål. Den valda gröna fluoroforen var upphetsad vid 488 nm och visualiseras med hjälp av ett emissionsfilter vid 505-525 nm. På samma sätt var DAPI upphetsad vid 405 nm och emissions samlas med hjälp av ett filter vid 410-460 nm. Aktivitet hos tyrosinkinas, Src is ökade i BE, särskilt i höggradig dysplasi 12. I samstämmighet med observationer i kolorektala och prostatacancerceller 13-15, hämning av Src leder relocalization av β-catenin från cytoplasman / kärnan (pilar, figur 1A, 1C och 1E) till cellmembranet (pilspetsar, figurerna 1B, 1D och 1F). Med hjälp av dessa tekniker, har vi och andra tidigare visat att hämning av Src förändrar också uttryck och lokalisering av tumören dämpare, p27 kip1 7,16 och dessa metoder används idag inom vårt laboratorium.
μ
Figur 1. IF på immortaliserade vara celler efter behandling med en hämmare av Src-kinas CP-C (AD). Och CP-D (E, F) Behandlades med vehikel (DMSO, vänstra panelen) eller 1 ^ M av den Src-hämmare, SKI-606, under 24 h (högra fälten). BE-celler fixerades och färgades i enlighet med den beskrivna protokollet. β-catenin (grön) visualiserades med användning av en specifik antikropp och en sekundär antikropp kopplad till Alexa Fluro 488, medan kärnan färgades med DAPI (blå). Observera ändringen i lokalisering för β-catenin från kärnan (pilar) till cellmembranet (pilspetsar) efter behandling med SKI-606. C, D) Förstorade bilder av vita rutorna i A och B, vidare belysa de förändringar i β- catenin lokalisering. Dessa bilder representerar ideal färgning med minimal bakgrund och tydlig färgning för det valda målet. Barer, 7 m (A, B, D, F), 0,5 m (C, D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har beskrivit en metod för tillämpning av IF av BE celler till att belysa de fysiologiska effekterna av riktade terapier vid dessa celler. Samtidigt som vi har beskrivit användningen av dessa förfaranden mot BE celler, har vi funnit att dessa metoder är också tillämpliga på en mängd olika celltyper 13,17,18. Vidare kan dessa förfaranden kan ändras på flera sätt för att optimera färgning för specifika mål.
Vi hittar en parameter som har en direkt effekt på riktig IF är valet av fixering. Vi har beskrivit användning av 4% PFA / PBS för fixering i de ovan angivna förfarandena men alternativa fixativ är också tillämpliga. Fixering med kall metanol (-20 ° C) under 20 min efter tvättning med PBS är lämplig för vissa proteiner / antikroppar 13. Användning av kall metanol för fixering eliminerar behovet att permeabilize celler. Emellertid, är valet av fixativ (4% PFA / PBS eller kall metanol) måste bestämmas empiriskt. De förfaranden som beskrivs ovan beskriver visualisering av ett enda protein; Men denna metod är lätt att anpassa till identifiering av ett ytterligare mål 13. För optimal IF av två proteiner, primära antikroppar som tas upp i två olika arter (t.ex. en upp i kanin och en i mus) och sekundära antikroppar som specifikt känner igen varje art, kopplade till olika fluoroforer, är nödvändiga. Sekundära antikroppar kopplade till gröna och röda fluoroforer, i kombination med DAPI ger en utmärkt kontrast mellan mål, förutom att allmänt undvika störningar från de multipla fluoroforer. För IF på två mål i BE celler, utför sekventiell inkubation av två primära och deras respektive sekundära antikroppar efter fixering. Steg för tvättning och montering av objektglas förblir desamma.
I sammanfattning, tillhandahåller vi ett enkelt och användbart protokoll för IF av BE-celler. Tillämpning av dessa förfaranden kan ge information om effekterna av läkemedelsbehandling, införande av ektopiska gener av intresse, eller RNAi nedreglering av gener av intresse för BE celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från St Joseph Stiftelse (AJF, Lji) och American Lung Association, RG-224607-N (Lji).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1x), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN antibiotic mixture | Life Technologies | 15640 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18 mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10 cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
