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Biology

बैरेट की घुटकी कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए एक Immunofluorescent विधि

Published: July 20, 2014 doi: 10.3791/51741
Automatic Translation
1, 1, 1
1Center for Thoracic Disease and Transplantation, Heart and Lung Institute, St. Joseph's Hospital and Medical Center

Summary

बैरेट की घुटकी के आणविक चालकों पर बेहतर जानकारी के लिए एक प्रत्यक्ष जरूरत नहीं है. Immunofluorescent धुंधला सेल आकारिकी पर संकेतन सेल के प्रभाव को समझने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. हम Barrett घुटकी कोशिकाओं में चिकित्सीय उपचार का आकलन करने के लिए immunofluorescent धुंधला के उपयोग के लिए एक सरल, प्रभावी प्रोटोकॉल उपस्थित थे.

Abstract

Esophageal adenocarcinoma (ईएसी) एक समग्र अस्तित्व कम से कम 17% की दर और पूर्वी वायु कमान की घटनाओं में पिछले दो दशकों में तेजी से बढ़ी है है. पूर्वी वायु कमान के प्राथमिक जोखिम कारकों में से एक है Barrett घुटकी (इ), क्रोनिक नाराज़गी के जवाब में सामान्य स्क्वैमस घुटकी के एक metaplastic परिवर्तन है. पूर्वी वायु कमान और बीच में अच्छी तरह से स्थापित कनेक्शन के बावजूद, आणविक घटनाओं की प्रगति से जुड़े विशेष रूप से बदल संकेत दे रास्ते से पूछताछ के पूर्वी वायु कमान के लिए, खराब समझ रहे हो जाना. इसका एक बड़ा हिस्सा इन रोगों का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध इन विट्रो मॉडल में उपयुक्त की कमी के कारण है. हाल ही में, अमर हो सेल लाइनों की इन विट्रो अध्ययन की अनुमति के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं. यहाँ, हम चिकित्सकीय यौगिकों के लिए जोखिम के बाद सेल संकेतन और संरचना की इन विट्रो लक्षण वर्णन में अनुमति देता है, अमर हो सेल लाइनों की Immunofluorescent धुंधला के लिए एक तरीका मौजूद है. इन तकनीकों के आवेदन हेल होगापी ईएसी प्रगति के लिए किया जा में शामिल तंत्र में अंतर्दृष्टि विकसित करने और उपचार और पूर्वी वायु कमान की रोकथाम के लिए संभावित रास्ते प्रदान करते हैं.

Introduction

बैरेट की घुटकी (इ) घेघा के सामान्य स्क्वैमस उपकला और भाटा रोग (गर्ड) 1 से उत्पन्न आमाशय सामग्री के लिए पुरानी जोखिम का एक परिणाम में एक metaplastic परिवर्तन है. इ गर्ड के जवाब में एक सुरक्षा तंत्र माना जाता है, लेकिन हो की उपस्थिति esophageal adenocarcinoma (ईएसी), एक काफी गरीब अस्तित्व 1 वहन करती है जो एक रोग का एक बढ़ा जोखिम प्रदान करता है. वर्तमान अनुमानों अमेरिकी आबादी के ऊपर से 5.6% हो गए सुझाव है कि बीई अक्सर स्पर्शोन्मुख है के रूप में, हालांकि, यह हो सकता है की बहुमत 2 undiagnosed बनी हुई है कि माना जाता है. गर्ड और पूर्वी वायु कमान दोनों की घटनाओं की दर निरंतर वृद्धि 3 देखा है, यह इस जानकारी को संभावित ईएसी के लिए किया की प्रगति को रोकने की दिशा में चिकित्सकीय दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है, खासकर के रूप ईएसी के लिए किया की प्रगति में शामिल आणविक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण हो गया है.

1 की वर्तमान प्रतिमान में हुई है. जीर्ण सूजन, चोट, और आमाशय सामग्री के लिए लंबे समय तक निवेश से उत्पन्न genotoxic क्षति ईएसी के लिए neoplastic प्रगति को बढ़ावा देने घाव पर चयनात्मक दबाव डालती है. आनुवंशिक परिवर्तन का एक नंबर दौरान ईएसी प्रगति करने के लिए किया गया है की पहचान. हालांकि, इसके बावजूद सेल संकेतन में सटीक परिवर्तन और कोशिका की संरचना और समारोह पर बाद के प्रभाव के बारे में समझने की एक विशिष्ट कमी नहीं है.

विशेष रूप से लक्षित चिकित्सकीय यौगिकों के प्रभाव की जांच में, सेल संकेतन के प्रभावों के अध्ययन के लिए उपयोगी उपकरण विट्रो सेल लाइनों में हैं अमर. अमर हो सेल लाइनों की हाल ही में वाणिज्यिक उपलब्धता इस तरह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है. इस तरह व्यापक रूप से इस्तेमाल व्यवहार्यता assays के रूप में उच्च throughput assays, सेल प्रसार और सु पर लक्षित चिकित्सा के प्रभाव का आकलन करने में मूल्यवान हो सकता हैrvival 4-6, इन assays सेल आकारिकी पर संकेतन सेल के प्रभाव से पूछताछ के लिए उपयोगी नहीं हैं. Immunofluorescent धुंधला (यदि) कोशिकाओं का संयुक्त, विकास, और जीवित रहने की विशेषताओं और शामिल कर रहे हैं कि प्रोटीन पर लक्षित चिकित्सा के प्रभाव की जांच के लिए एक उपयोगी तकनीक है. हमारी प्रयोगशाला दवा इलाज 7 के लिए एक संभव chemopreventative उपचार और biomarker delineating की उम्मीद में हो सेल लाइनों पर एक चिकित्सकीय उपलब्ध दवा के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए यदि का उपयोग, अमर हो सेल लाइनों की दिशा में इन विधियों अनुकूलित है. इसी तरह, पूर्वी वायु कमान में इन तकनीकों का प्रयोग, इ और अमर esophageal सेल लाइनों ईएसी प्रगति 8-10 के लिए किया जा के बारे में महत्वपूर्ण निष्कर्ष चित्रित किया गया है. लक्षित चिकित्सा के साथ इलाज किया कोशिकाओं का विश्लेषण सेल संरचना और प्रोटीन स्थानीयकरण में परिवर्तन के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है, मान है, तो हम पाते हैं. यहाँ, हम के लिए हमारे तरीकों अगर वर्तमान ग के लिए अमर हो कोशिकाओं कीदवा इलाज haracterize.

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Protocol

1. सेल लाइन रखरखाव

  1. अमर मानव ट्रांसक्रिपटेस (Tert) प्रोटीन 11 रिवर्स मानव टेलोमिरेज की स्थिर अभिकर्मक द्वारा उच्च ग्रेड dysplastic (सीपी बी, सी पी सी, सी पी डी) और metaplastic (सीपी-ए) सेल लाइनों.
  2. बनाए रखें सेल गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (BPE), epidermal वृद्धि कारक (EGF), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), nonessential अमीनो एसिड (NEAA), पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन-neomycin (पी एस एन) के साथ पूरक keratinocyte मीडिया में लाइनों, और मानक होना टिशू कल्चर शर्तों (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 98% आर्द्रता).

2. सेल चढ़ाना इ

  1. 12 अच्छी तरह से थाली / coverslips की तैयारी. एक गिलास पेट्री डिश और आटोक्लेव में 18 मिमी coverslips रखें. स्थानांतरण एक वैक्यूम ट्यूब से जुड़ी एक बाँझ गिलास पिपेट का उपयोग कर एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर डिश में 18 मिमी कांच coverslips autoclaved. बाँझ पीबीएस और मीडिया के साथ coverslip धो लें.
  2. Trypsinize और अमर हो कोशिकाओं गिनती. कोशिकाओं USI गणनाएक स्वचालित सेल काउंटर या एक hemocytometer एनजी. 20,000-40,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के लिए संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं पतला.
  3. प्रत्येक अच्छी तरह से 20,000-40,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह के कुल सेल गिनती के लिए एक coverslip युक्त में कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर रखें.
  4. धीरे कोशिकाओं coverslip के लिए देते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से नीचे के लिए coverslip पुश करने के लिए एक बाँझ विंदुक टिप का उपयोग करें.

बीई प्रकोष्ठों के 3. औषध उपचार

  1. वांछित एकाग्रता के लिए गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) मीडिया में चयनित दवा पतला और बार बार ट्यूब inverting या एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके अच्छी तरह से मिश्रण. अनुभव से निर्धारित दवा सांद्रता. Coverslip करने पर कोशिकाओं कुर्की की अनुमति हो कोशिकाओं के प्रारंभिक बोने इलाज के बाद 24 घंटा शुरू करो
  2. तुलना और नियंत्रण के लिए, संस्कृति मीडिया में पतला 0.1% वाहन (डाइमिथाइल sulfoxide [DMSO] या एजेंट यौगिक solubilize लिए इस्तेमाल किया) के साथ हो कोशिकाओं की एक अतिरिक्त coverslip का इलाज. दवा की पहचान और ve के लिए एक प्रयोगशाला कलम से लेबल थालीhicle नमूने का इलाज किया. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 98% आर्द्रता के लिए सेट एक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं प्लेस और वांछित समय अंक के लिए सेते हैं.

4. Immunofluorescent धुंधला

  1. नियतन
    1. दवा इलाज के वांछित ऊष्मायन समय के बाद, मीडिया aspirate और कमरे के तापमान (आर टी, 25 डिग्री सेल्सियस) पर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ जल्दी से coverslips धोने.
    2. पीबीएस Aspirate और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 4% पीएफए ​​[4% पीएफए ​​/ पीबीएस] युक्त पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
    3. 4% पीएफए ​​/ पीबीएस Aspirate और आरटी पर पीबीएस के साथ coverslips 3x, 5 मिनट प्रत्येक धोने. अगर वांछित 4 डिग्री सेल्सियस पर PBS/0.1% पीएफए ​​में एक सप्ताह के लिए स्टोर coverslips.
  2. Permeabilization / अवरुद्ध
    एंटीबॉडी intracellular लक्ष्य तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए तय पीएफए ​​कोशिकाओं permeabilize. बाह्य प्रोटीन सामने के लिए, 1x PBS/0.5% बीएसए समाधान के लिए जोड़ा सैपोनिन बिना बाद के सभी चरणों को पूरा.
    1. आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में पतला 50 मिमी एनएच 4 सीएल के साथ incubating द्वारा पृष्ठभूमि में कमी और 5 मिनट के लिए एक बार आरटी पीबीएस के साथ धो लो.
    2. 0.1% सैपोनिन और 0.5% गोजातीय सीरम albumin (BSA) युक्त पीबीएस के 100-300 μl में 30 मिनट के लिए हो कोशिकाओं को सेते हैं. , फिल्टर निष्फल 10% शेयर से सैपोनिन पतला पानी में तैयार और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत
    नोट: यह 0.5% BSA के अलावा के कारण coverslips अवरुद्ध करके सेलुलर प्रोटीन को एंटीबॉडी के बंधन अविशिष्ट से बचाता है. वैकल्पिक रूप से, एंटीबॉडी के अविशिष्ट बाध्यकारी कम करने में मदद करने के लिए 5% तक पतला बकरी सीरम के साथ बीएसए स्थानापन्न.
  3. मानव चैंबर की तैयारी
    1. गीला कागज तौलिये के साथ कक्ष के नीचे layering द्वारा एक वर्ग bioassay पकवान तैयार है और शीर्ष पर Parafilm की एक परत जगह.
    2. धीरे संदंश और एक सिरिंज सुई का उपयोग Parafilm पर ऊपर की ओर का सामना करना पड़ coverslips, कोशिकाओं हस्तांतरण.
    3. Coverslips की पहचान के लिए एक प्रयोगशाला कलम के साथ Parafilm निशान.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. 0.5% BSA और 0.1% सैपोनिन दोनों युक्त पीबीएस में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला.
    2. धीरे एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग अवरुद्ध समाधान बंद दाग और प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 μl जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बीई कोशिकाओं पर प्राथमिक एंटीबॉडी सेते
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन
    1. स्लाइड आरटी पर 5 मिनट प्रत्येक के लिए PBS/0.5% BSA/0.1% सैपोनिन साथ 3x धो लें.
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी उठाया गया था जिसमें प्रजातियों को पहचानता है कि PBS/0.5% BSA/0.1% सैपोनिन में एक फ्लोरोसेंट टैग के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला.
    3. प्रत्येक coverslip को पतला एंटीबॉडी के 100 μl जोड़ें. आरटी पर 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं.
  6. वॉशिंग और coverslips के बढ़ते
    1. PBS/0.5% BSA/0.1% सैपोनिन में coverslips 3x, 5 मिनट प्रत्येक धो लें. धोने बफर निकालें और coverslips पीबीएस के 100-300 μl जोड़ें.
      नोट: डबल विरोधी के लिएशरीर धुंधला हो जाना, फिर से चर्चा में उल्लिखित जानकारी के अनुसार वांछित अतिरिक्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 4.4-4.5 कदम.
    2. संदंश का प्रयोग, धीरे coverslip उठा और एक प्रयोगशाला ऊतक या कागज तौलिया का उपयोग पीबीएस बंद दाग.
    3. एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर, कोशिकाओं नीचे, coverslip करने के लिए 4 से युक्त एक उपयुक्त विरोधी फीका बढ़ते मीडिया ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के 15 μl जोड़ें और coverslip पलटना.
    4. एक स्लाइड फ़ोल्डर में स्लाइड्स प्लेस और कठिन सेट विरोधी फीका मध्यम इलाज करने के लिए अनुमति देने के लिए आरटी पर रातोंरात दूर प्रत्यक्ष प्रकाश से सेते हैं, निर्माता के निर्देशों के अनुसार. विरोधी फीका मध्यम रखा है एक बार, स्लाइड सूक्ष्म दृश्य तक डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस या -20 या तो पर संग्रहित किया जा सकता है.

Coverslips के 5. सूक्ष्म दृश्य

दाग कोशिकाओं confocal माइक्रोस्कोपी या एक या तो के माध्यम से imaged किया जा सकता है, तो सक्षम ईमानदार microscopई. Confocal माइक्रोस्कोपी असतत गहराई में उच्च संकल्प छवियों को प्रदान करता है, एक ईमानदार सूक्ष्म तेजी से उपयोगी छवियों का निर्माण करने में सक्षम है. संक्षिप्तता के लिए, इमेजिंग की एक विधि मानक माइक्रोस्कोपी प्रस्तुत किया जाता है का उपयोग कोशिकाओं इ दाग. सामान्य में, छवि fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) या इसी तरह fluorophores (यानी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के लिए, टेक्सास लाल और DAPI, इन fluorophores भेदभाव करने में सक्षम फिल्टर के साथ एक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता है. संगत fluorophores निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल की शुरुआत से पहले माइक्रोस्कोप की जाँच करें.

  1. एक मानक यदि खुर्दबीन पर इमेजिंग
    1. -20 डिग्री सेल्सियस या 4 डिग्री सेल्सियस से संग्रहीत स्लाइड्स / coverslips निकालें और उन्हें कमरे के तापमान को गर्म करने के लिए अनुमति देते हैं. माइक्रोस्कोप और पारा आर्क दीपक पर पावर.
    2. Coverslip खुर्दबीन मंच पर उद्देश्य की ओर का सामना करना पड़ के साथ खुर्दबीन स्लाइड रखें. एक तेल विसर्जन उद्देश्य के उपयोग के लिए, coverslip पर विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें.
    3. DAPI फिल्टर का चयन करें और शटर खुला. छवि दिखाई देती है जब तक eyepieces के माध्यम से देख रहे हैं, जबकि उद्देश्य ध्यान दें. सभी कोशिकाओं DAPI के साथ दाग होगा, नाभिक आसानी से नमूदार होना चाहिए.
    4. संबंधित छवि संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों लीजिए.

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Representative Results

वर्णित प्रक्रियाओं के आवेदन से प्राप्त परिणामों का एक उदाहरण आंकड़े 1 ए डी में सचित्र है. सी.पी. डी और सी पी सी इ कोशिकाओं के साथ coverslips एसआरसी परिवार अवरोध करनेवाला, स्की 606, या वाहन (DMSO) की 1 माइक्रोन के साथ 24 घंटे के लिए इलाज और प्रोटीन, β संकेत adherens जंक्शन और Wnt के लिए ऊपर प्रक्रियाओं का उपयोग दाग रहे थे catenin के. सेल नाभिक की लेबलिंग DAPI (नीला) के साथ लेबलिंग द्वारा पूरा किया गया है, जबकि β-catenin के दृश्य, एक हरे रंग की fluorophore करने के लिए मिलकर एक विरोधी खरगोश आईजीजी साथ लेबलिंग के द्वारा प्राप्त किया गया था. Coverslips कठिन बढ़ते सेट और कोशिकाओं को एक 63X/1.4N योजना Apochromat उद्देश्य का उपयोग लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged थे उपयोग कर स्लाइड खुर्दबीन के लिए बढ़ रहे थे. चुना हरी फ्लोरोफोरे 488 एनएम पर उत्साहित और 505-525 एनएम पर एक उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कल्पना की गई थी. इसी तरह, DAPI 405 एनएम और 410-460 एनएम पर एक फिल्टर का उपयोग कर एकत्र उत्सर्जन में उत्साहित किया गया था. Tyrosine kinase, एसआरसी की गतिविधि मैंएस विशेष रूप से उच्च ग्रेड dysplasia 12 में हो सकता है, में वृद्धि हुई है. कोलोरेक्टल और प्रोस्टेट कैंसर की कोशिकाओं को 13-15 में टिप्पणियों के साथ सामंजस्य में, एसआरसी के निषेध, कोशिका द्रव्य / नाभिक (तीर, 1 सी 1 ए आंकड़े, और 1E) कोशिका झिल्ली को (तीर, 1B आंकड़े से β-catenin की relocalization में परिणाम -1 डी, और 1F). इन तकनीकों का प्रयोग, हम और दूसरों को पहले से एसआरसी का निषेध भी ट्यूमर शमन, p27 kip1 7,16 और इन तरीकों वर्तमान में हमारी प्रयोगशाला के भीतर उपयोग किया जाता है की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण परिवर्तित कर देता है कि पता चला है.

चित्रा 1 μ
चित्रा 1. एक एसआरसी kinase के अवरोध करनेवाला. सी.पी. सी (ई.) और सी.पी. डी (ई, एफ के साथ इलाज के बाद अमर हो कोशिकाओं की अगर) 24 घंटे (सही पैनल) के लिए, वाहन (DMSO, बाएं पैनल) या एसआरसी अवरोध करनेवाला के 1 माइक्रोन, स्की 606 के साथ इलाज किया गया. इ कोशिकाओं वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार तय की और दाग रहे थे. नाभिक DAPI (नीला) के साथ सना हुआ था, जबकि β-catenin (हरा), एक विशिष्ट एंटीबॉडी और एलेक्सा Fluro 488 करने के लिए मिलकर एक माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग कल्पना की गई थी. स्की 606. सी, डी) के साथ इलाज के बाद कोशिका झिल्ली (तीर) के नाभिक (तीर) से β-catenin के लिए स्थानीयकरण में परिवर्तन नोट ए और बी में सफेद बक्से का बढ़ाया छवियों, आगे β में परिवर्तन पर प्रकाश डाला catenin स्थानीयकरण. इन छवियों को चुना लक्ष्य के लिए कम से कम पृष्ठभूमि और विशिष्ट धुंधला के साथ आदर्श धुंधला प्रतिनिधित्व करते हैं. बार्स, 7 माइक्रोन (ए, बी, डी, एफ), 0.5 माइक्रोन (सी, डी).

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Discussion

हम इन कोशिकाओं पर लक्षित चिकित्सा के मनोवैज्ञानिक प्रभाव elucidating की ओर होना कोशिकाओं की अगर आवेदन के लिए एक विधि रेखांकित किया है. हम होना कोशिकाओं की दिशा में इन प्रक्रियाओं के उपयोग का वर्णन किया है, वहीं हम इन तरीकों में भी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 13,17,18 की एक किस्म के लिए लागू हो पाया है. इसके अलावा, इन प्रक्रियाओं के विशिष्ट लक्ष्यों के लिए धुंधला अनुकूलन करने के लिए कई मायनों में बदला जा सकता है.

हम उचित अगर पर सीधा प्रभाव पड़ता है कि एक पैरामीटर के निर्धारण की पसंद है लगता है. हम ऊपर प्रक्रियाओं में निर्धारण के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस के उपयोग का वर्णन किया है, लेकिन वैकल्पिक fixatives भी लागू कर रहे हैं. ठंड मेथनॉल के साथ फिक्सेशन (-20 डिग्री सेल्सियस) 20 मिनट के लिए पीबीएस के साथ धोने के बाद कुछ प्रोटीन / एंटीबॉडी 13 के लिए उपयुक्त है. निर्धारण के लिए ठंड मेथनॉल के इस्तेमाल की कोशिकाओं permeabilize करने की जरूरत नकारती है. हालांकि, लगानेवाला की पसंद (4% पीएफए ​​/ पीबीएस या ठंड मेथनॉल) अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए. ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाओं एक प्रोटीन के दृश्य का वर्णन; हालांकि इस पद्धति का एक अतिरिक्त लक्ष्य 13 की पहचान करने के लिए आसानी से अनुकूल है. इष्टतम के लिए दो प्रोटीन की, विशेष रूप से विभिन्न fluorophores के लिए युग्मित प्रत्येक प्रजाति, पहचानने दो अलग अलग प्रजातियों (जैसे, खरगोश में उठाया एक और माउस में से एक), और माध्यमिक एंटीबॉडी में उठाया प्राथमिक एंटीबॉडी, आवश्यक कर रहे हैं. DAPI के साथ संयुक्त हरी और लाल fluorophores, के लिए युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी आम तौर पर कई fluorophores से हस्तक्षेप से बचने के अलावा लक्ष्यों के बीच एक उत्कृष्ट इसके विपरीत, प्रदान करते हैं. बीई की कोशिकाओं में अगर दो लक्ष्यों के लिए, निर्धारण निम्न दो प्राथमिक और उनके संबंधित माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुक्रमिक ऊष्मायन प्रदर्शन करते हैं. धोने और स्लाइड के बढ़ते कदम ही रहते हैं.

संक्षेप में, हम कोशिकाओं के लिए अगर एक सरल और उपयोगी प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. इन प्रक्रियाओं के आवेदन informat प्राप्ति कर सकते हैंदवा इलाज, ब्याज की अस्थानिक जीन की शुरूआत, या कोशिकाओं में ब्याज की जीन की आरएनएआई डाउनरेगुलेशन के प्रभाव के बारे में आयन.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के सेंट यूसुफ के फाउंडेशन (AJF, LJI) और अमेरिकन लंग एसोसिएशन, आरजी 224607-N (LJI) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CP-A (Metaplastic Cell Line) ATCC CRL-4027
CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) ATCC CRL-4028
CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) ATCC CRL-4029
CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) ATCC CRL-4030
Keratinocyte-SFM (1x), Liquid Life Technologies 17005-042
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red  Life Technologies 25200056
Fetal Bovine Serum, Qualified, HI Life Technologies 10438026
PSN antibiotic mixture Life Technologies 15640
PBS - Phosphate-Buffered Saline Life Technologies 10010049
Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI  Life Technologies P36931
Circular Glass Coverslip 18 mm Fisher Scientific 15-183-86
β-catenin Primary Antibody (Rabbit) Cell Signaling 9562S
Alexa Fluor 488 (Goat Anti-Rabbit) Life Technologies A11008
10 cm TC treated PS dish, sterile USA Scientific CC7682-3394
12-well TC treated PS plate, sterile USA Scientific 5666-5180
DMSO Sigma-Aldrich 276855
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Ammonium chloride Sigma-Aldrich A9434
Saponin Sigma-Aldrich 47036
Bovine Serum Albumin - Fraction V Sigma-Aldrich 85040C
SKI-606 (Bosutinib) Selleck Chemicals S1014
Square Bioassay Dish  Thermo Scientific 240835
Parafilm  VWR 82024-546
Disposable Pasteur Pipettes, Flint Glass VWR 14672-380
Nexcelom Mini Cell Counter Nexcelom
Cellometer Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100-014
Zeiss Apotome microscope  Zeiss

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References

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बैरेट की घुटकी कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए एक Immunofluorescent विधि
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Inge, L. J., Fowler, A. J., Bremner, … More

Inge, L. J., Fowler, A. J., Bremner, R. M. An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett’s Esophagus Cells. J. Vis. Exp. (89), e51741, doi:10.3791/51741 (2014).

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