Live-Imaging af<em> Drosophila</em> Larvetilstand neuroblasts

Summary

Denne protokol beskriver en strømlinet metode, der anvendes til at udføre levende celler i forbindelse med en intakt larve hjerne. Live-cell imaging metoder er uvurderlig for studiet af asymmetriske neurale stamceller divisioner samt andre neurogene og udviklingsprocesser, konsekvent afdække mekanismer, der tidligere blev overset.

Abstract

Stamceller opdele asymmetrisk at generere to afkom celler med ulige skæbne potentiale en selvfornyende stamcelle og en differentierende celle. I betragtning af deres relevans for udvikling og sygdom, at forstå de mekanismer, der styrer asymmetriske stamceller division har været et robust område af undersøgelsen. Fordi de er genetisk medgørlig og gennemgå successive runder af celledeling om én gang hver time, stamceller fra Drosophila centralnervesystemet eller neuroblasts, er uundværlige modeller for studiet af stamceller division. Omkring 100 neurale stamceller er placeret nær overfladen af ​​hver af de to larve hjernen lapper, hvilket gør dette modelsystem særligt anvendelige til direkte billeddannelse mikroskopi studier. I dette arbejde, vi gennemgå flere tilgange i vid udstrækning anvendes til at visualisere stamceller celledelinger, og vi tager fat de relative fordele og ulemper ved de teknikker, som anvender dissocieres versus intakte hjernevæv. Vi har også detalje vores simplifIED protokol, der bruges til at eksplanteres hele hjerner fra tredje stadie larver for levende celler og applikationer faste analyse.

Introduction

Stamceller opretholde en balance af differentiering og selvfornyelse at generere cellulær mangfoldighed i den tidlige udvikling og udskift beskadigede celler i voksent væv. Regulering af denne homeostase forhindrer både tab og over-ekspansion af stamceller befolkning, hvilket kan resultere i skadelige vævsdegenerering eller tumorigenese.

Neuroblasts (NBS) er de i vid udstrækning undersøgte neurale stamceller Drosophila centralnervesystemet (figur 1A), der først dannes under fosterstadiet ^{1, 2.} NBs gennemgå gentagne runder af asymmetrisk celledeling (ACD) til at producere to ulige skæbnesvangre celler: en selvfornyende stamceller og en differentierende celle. ACD er styret af centrosomes, ikke-hindeagtige organeller, der fungerer som de mikrotubuli-organiserende centre i de fleste celler ^3.. Under mitosen, NB centrosomes organisere og orientere bipolar mitotiske spindel langs den apikale-basal polarhed akse. Ved spaltning af dividere NB, apikale skæbne determinanter, der angiver stamceller skæbne og basale skæbne determinanter, der angiver differentiering er adskilt i de ulige datter celler.

I larvestadiet centrale hjernen, kan to typer NBS adskiller sig ved deres antal, placering, transskription faktor udtryk, og celleafstamning (figur 1A) ^4-6. Type I NBs er den mest udbredte, og omkring 90 af dem befolke anteriore og posteriore sider af hver optik lap af hjernen ^7. Disse NBs udtrykke transkriptionsfaktoren aSense (ASE), og de ​​typisk opdele i en selvfornyende NB og en mindre ganglion mor celle (GMC, figur 1B). Hver GMC gennemgår en enkelt terminal division at generere to neuroner eller glia (figur 1B). I modsætning hertil otte type II NBs der befolker den bageste side af hvert optisk lap mangler Ase udtrykket ^5. De gennemgår ACDat producere en selvfornyende NB og en mellemliggende neurale stamfader (INP).

INP gengæld sig asymmetrisk tre til fem gange. Hver af disse divisioner resulterer i regenerering af INP og produktionen af en enkelt GMC ^4. Kollektivt specifikke NB identitet og den tidsmæssige rækkefølge af GMC fødsel giver anledning til forbløffende neuronal mangfoldighed voksne centralnervesystemet.

Forstå cellebiologi der ligger til grund NB ACD er blevet kraftigt forbedret gennem brug af levende celle imaging teknikker. Udgivet protokoller, der bruges af forskere til billede levende NBs varierer meget. Samlet, men disse metoder kan inddeles i to overordnede kategorier kendetegnet ved, om den larve hjerne efterlades intakt eller mekanisk dissocieret. Begge teknikker har forskellige fordele og ulemper afhængig af forskerens ansøgning.

Tidlige rapporter afslører levende NB celle udbyttemelser indebærer en vis grad af manuel dissociation af larvestadiet hjernen. Disse protokoller detalje smearing ⁸ eller drille hinanden ⁹ hjernen for at vokse på kort sigt primære kulturer af NBS på dækglas. For at forbedre billeddannelse, er de runde NBs normalt fladtrykt på dækglas med enten glasslides ⁸ eller agarose puder ^9. Selv flade celler har forbedret optik disse teknikker ofte føre til NB mitotiske mangler, herunder regression af spaltning fure og den manglende evne til at opdele mere end én gang. Derfor er protokoller, der involverer både manuel dissociation og fysisk forvrængning af larvestadiet hjernevæv normalt kun velegnet til meget kort sigt (dvs.., En cellecyklus eller mindre) programmer. Ligeledes semi-Squashing eller helt udfladning intakte hjerner mellem glasslides og dækglas begrænser den tid, man kan tilbringe billeddannelse en given prøve til en ca 30 min periode ^10. På trods af denne begrænsning, This tilgang er blevet anvendt med succes ^11-14.

Seneste bestræbelser på at billedet levende dissocieret NBs grænse fysisk forvridning af de isolerede celler. Disse teknikker er særligt nyttige til anvendelser, hvor det er nødvendigt for at opretholde cellekulturer til flere celledeling cyklusser. For eksempel kan dispergerede celler fra manuelt dissocierede hjerner være delvist indlejret i en blodprop lavet af en blanding af fibrinogen og thrombin ¹⁵ til langsigtet billeddannelse ^16. Alternativt kan eksplanterede hjerner være første kemisk dissocieret med enzymet collagenase næste manuelt afbrudt ved gentagen passage gennem en pipettespids, og derefter udpladet på poly-L-lysin-coatede glasbund retter ^{17, 18.} Coating glasskåle med enten fibrinogen eller poly-L-lysin fremmer fastgørelsen og let spredning af runde celler, hvilket bringer dem så tæt på dækglasset som muligt uden store fysiske forvrængning. I additipå disse metoder involverer dyrkning NBS i medium, som let kan udskiftes med farmakologiske perturbations forsøg ^18. Samlet direkte plating spredt NBs forbedrer imaging optik uden at ofre langsigtede billeddannelse kapaciteter. For nylig har en protokol, der beskriver den langsigtede dyrkning af dissocieret NBs været detaljerede ^19.

Men denne fremgangsmåde er ikke uden begrænsninger. Der er flere advarsler billeddannelse levende dissocierede NBs. I et felt af dispergerede celler, for eksempel, er det vanskeligt at identificere specifikke NB slægter, der er rumligt organiseret i den intakte hjerne ^1. Ligeledes skelne type I versus type II NBs inden dissocieret væv er også udfordrende uden udtryk for slægt sporstoffer eller subtypespecifik transgener, såsom worniu-GAL4, aSense-GAL80 ^20. Selv om disse transgener er ganske nyttigt for nogle programmer, de begrænser forskere til dem transgener extrykkes under kontrol af UAS enhancerelement ²¹ og kræver mere komplekse genetiske skemaer. Undersøgelser, der vedrører den rumlige eller tidsmæssige udvikling NBS kræver derfor in vivo billeddannelse i forbindelse med en intakt væv.

Desuden undersøgelser af dissocierede embryonale NBs indikerer, at den fysiske kontakt af tilstødende celler er afgørende for interfase lokalisering af nøgle polaritet determinanter ^{22, 23.} Disse undersøgelser viser helt isoleret NBs ikke længere fastholde den invariante mitotiske spindel akse. I stedet viser disse celler en mere randomiserede spindelaksen og brede vinkler af adskillelse mellem successive GMC knopper, måske på grund af tabet af apikale centrosome positionering ^22. Selvom forholdet mellem larvernes NBs og deres omkringliggende celler ikke er blevet grundigt undersøgt, er det værd at overveje at larve stamceller mikromiljø kan krænkes celle polaritet eller andetadfærd. For at opretholde den fysiologiske sammenhæng larve NBS vi billede ACD fra hele hjerner.

I betragtning af de iboende begrænsninger, der er forbundet med billedbehandling dissocieret bemyndigede organer, har vores laboratorium, og andre etablerede protokoller til billede successive runder af NB ACD fra hele larve hjerner. Teknikker til billede intakte hjerner ofte erstatter den stive overflade af glas på den ene side af kulturen kammer med en fleksibel membran for at forhindre væv eller beskadigelse, og giver mulighed for gasudveksling. Nogle fremgangsmåder involverer montering eksplanterede hjerner i en blanding af insekt dyrkningsmedium, serum og ascorbinsyre med fedt organer isoleret fra ti larver ^24. De isolerede fedt organer er tilføjet, fordi de udskiller et mitogen kendt for at stimulere NB celledeling ^25. Denne protokol bevarer integriteten af vævet i over 3 timer, og er derfor egnede til langvarig billeddannelse ^{24. 26-28.} For nylig, en protokol, der beskriver long sigt billeddannelse af intakte larvestadium hjerner i nærværelse af ascorbinsyre, serum og fedt organer er beskrevet ^29. Vigtigt er det, fordi vævet er hverken udsættes eller immobiliseret, denne metode er mindre nyttigt for applikationer, hvor dyrkning medium udveksles (fx undersøgelser narkotika, immunodepletion osv.).

Vores laboratorium har forenklet hele mount forberedelse af levende larve hjerner for langsigtet billeddannelse ^{30, 31.} Den største fordel ved at vores protokol over andre er dets enkelhed: vores observationer indikerer hverken serum, ascorbinsyre, insulin, ej heller fedt organer er nødvendige tilsætningsstoffer til billede successive runder af NB ACD. Selvom tilsætningsstoffer, såsom insulin, har været nyttige for den forlængede billeddannelse af stamceller celledelinger ³² og kollektiv celle migration i Drosophila æggestokke ^33, de synes at være undværlig til NB ACD, som vores billeddannende medium består af en simpel blanding af standard insekt celledyrkning medium suppleret med antibiotika-antimykotikum at forhindre forurening. Gennem brug af genanvendelige gas-gennemtrængelige eller glasbund kultur retter, har vi været i stand til at opretholde flere runder af successive NB ACD'er. De samme eksplanterede prøver kan let bruges til immunfluorescens og andre procedurer med faste væv. I denne protokol, vi detalje dissektion af intakte larve hjerner, samt udarbejdelse af hjerner for både live og fast analyse.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Nødvendige materialer til Eksplanter tredje stadie larve Brains Forbered værktøjer der kræves for mikrodissektion. Forge to dissekere værktøjer (en skalpel og en krog) ved først at placere en enkelt dissekere pin i hver pin holderen. Fastgør benene stramt i hånden eller med en tang (figur 1C). Brug et par gamle tænger til at bøje en dissekere pin til en ca 120 ° vinkel. Gør dette under et dissektionsmikroskop for at sikre, at den øverste ha…

Representative Results

Live-imaging har belyst en række mekanismer, der regulerer NB ACD. Forud for billede erhvervelse, er det nødvendigt at bestemme de optimale billeddiagnostiske forhold. Det er nødvendigt at skabe balance mellem frame capture rate med varigheden af ​​levende celler. For fine celleanalyse, for eksempel forøget tidsmæssig og kan være påkrævet optisk opløsning. Når visualisere et enkelt NB cellecyklus (figur 4A), kan den hastighed, hvormed indfanges øges uden at indføre solskader. Typisk kan …

Discussion

Levende celler er en uvurderlig metode, der anvendes til at undersøge de mekanismer, der regulerer ACD af stamceller differentieringen af ​​cellelinier og morfogenese af komplekse væv. Selv forskergrupper historisk har anvendt en række forskellige teknikker til at visualisere NB ACD, kan disse fremgangsmåder generelt opdeles i to kategorier, som primært adskiller sig med hensyn til, hvorvidt hjernevæv efterlades intakt eller adskilles.

Imaging dissocieret NBs har sine fordele. For …

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.