Live-Imaging von<em> Drosophila</em> Larven Neuroblasten

Summary

Dieses Protokoll Details eine optimierte Methode verwendet, um Live-Cell-Imaging im Rahmen eines intakten Larven Gehirn durchzuführen. Live-Cell-Imaging Ansätze sind von unschätzbarem Wert für die Erforschung der neuronalen Stamm asymmetrische Zellteilungen sowie andere neurogene und Entwicklungsprozesse konsequent aufzudecken Mechanismen, die bisher übersehen wurden.

Abstract

Stammzellen teilen sich asymmetrisch zu zwei Nachkommen Zellen mit ungleichen Schicksal Potenzial generieren: eine sich selbst erneuernde Stammzellen und differenzier Zelle. Angesichts ihrer Bedeutung für die Entwicklung und Krankheit, das Verständnis der Mechanismen, die regeln, asymmetrische Zellteilung Stamm hat eine robuste Bereich der Studie. Weil sie genetisch manipulierbaren und laufen aufeinanderfolgende Runden der Zellteilung etwa einmal pro Stunde, die Stammzellen des Drosophila zentralen Nervensystems, Neuroblasten oder unverzichtbar sind Modelle für die Untersuchung von Stammzellteilung. 100 neurale Stammzellen sind in der Nähe der Oberfläche jedes der beiden Larvenhirnlappen angeordnet, so dass diese Modellsystem insbesondere für die Bildgebung mikroskopische Untersuchungen. In dieser Arbeit untersuchen wir einige Ansätze weit verbreitet, um Stammzell Divisionen zu visualisieren, und wir richten die relativen Vor-und Nachteile dieser Techniken, die im Vergleich zu intakten Hirngewebe dissoziiert beschäftigen. Wir haben auch unsere Detail simplifIED-Protokoll verwendet, um ganze Gehirn aus Drittlarvenstadium für Live-Cell-Imaging-und Festanalyseanwendungen Explantation.

Introduction

Stammzellen ein Gleichgewicht der Differenzierung und Selbsterneuerung an zelluläre Vielfalt während der frühen Entwicklung zu generieren und ersetzen beschädigte Zellen in adulten Geweben. Verordnung dieser Homöostase verhindert sowohl den Verlust und die Überdehnung der Stammzellpopulation, die in schädlichen Gewebedegeneration oder Tumorentstehung führen kann.

Neuroblasten (NBS) sind die häufigsten untersuchten neuralen Stammzellen des zentralen Nervensystems von Drosophila (1A), die erste Form während der embryonalen Stufen ^{1, 2.} NBs unterziehen wiederholte Runden der asymmetrischen Zellteilung (ACD), um zwei ungleich seligen Zellen produzieren: eine sich selbst erneuernde Stammzelle und eine differenzierende Zelle. ACD wird von Zentrosomen, die nicht-membranöse Organellen, die als Mikrotubuli-organisierende Zentren der meisten Zellen ³ handeln geführt. Während der Mitose, NB Zentrosomen zu organisieren und orientieren den bipolaren mitotischen Spindel entlang der apikal-basalen Polarkeit Achse. Nach der Spaltung des Teilungs NB, apikal Schicksal Determinanten, die die Stammzell Schicksal angeben und basalen Schicksal Determinanten, die eine Differenzierung angeben, werden in die ungleiche Tochterzellen getrennt.

Im Larven zentrale Gehirn, können zwei Arten von NBs durch deren Anzahl, Lage, Transkriptionsfaktor-Expression und Zelllinie (Fig. 1A) ^4-6 unterscheiden. Typ-I-BS sind die häufigsten, und etwa 90 von ihnen bevölkern die vorderen und hinteren Seiten jeder Optik Lappen des Gehirns ^7. Diese NBs Ausdruck der Transkriptionsfaktor ASENSE (Ase), und sie charakteristisch in eine sich selbst erneuernde NB teilen und eine kleinere Ganglienmutterzelle (GMC; Abbildung 1B). Jeder GMC erfährt ein einziges Terminal Division zu zwei Neuronen oder Gliazellen (Abbildung 1B) zu generieren. Im Gegensatz dazu sind die acht Typ II NBs, die die hintere Seite jeder optischen Loben bevöl fehlt Ase Ausdruck ^5. Sie durchlaufen ACDauf eine sich selbst erneuernde NB und eine Zwischen neuralen Vorläufer (INP) zu produzieren.

Die INP wiederum teilt asymmetrisch drei-bis fünfmal. Jeder dieser Bereiche ergibt Regeneration des INP und der Herstellung eines einzigen GMC ^4. Zusammen die spezifische NB Identität und die zeitliche Reihenfolge der GMC Geburt führt zur neuronalen erstaunliche Vielfalt der erwachsenen ZNS.

Das Verständnis der Zellbiologie, die NB ACD zugrunde liegt, wurde erheblich durch den Einsatz von Live-Cell-Imaging-Techniken verbessert. Veröffentlicht Protokolle, die von Forschern, Live-Bild verwendet NBs sind sehr unterschiedlich. Insgesamt aber diese Verfahren können in zwei allgemeine Kategorien von, ob die Larven Gehirn intakt gelassen oder mechanisch dissoziiert unterschieden gruppiert werden. Beide Techniken haben unterschiedliche Vor-und Nachteile je nach Anwendung des Forschers.

Frühe Berichte enthüllt Live-NB Zellteilunggen beinhalten ein gewisses Maß an Hand Dissoziation des Larven Gehirn. Diese Protokolle Detail Verschmieren ⁸ oder ⁹ Hänseleien abgesehen, das Gehirn, um kurzfristige Primärkulturen von der NBS auf Deckgläsern wachsen. Um Bildgebung zu verbessern, werden die runden NBs der Regel auf die Deckgläser entweder mit Glasobjektträger ⁸ oder ⁹ Agarose-Pads abgeflacht. Obwohl abgeflachten Zellen Optik verbessert, diese Techniken oft NB mitotischen Defekten führen, einschließlich Regression der Teilungsfurche und die Unfähigkeit, mehr als einmal zu teilen. Daher sind Protokolle, die sowohl manuelle Dissoziation und physische Verzerrung des Larvenhirngewebe beinhalten in der Regel nur geeignet, um sehr kurzfristige (dh., Ein Zellzyklus oder weniger) Anwendungen. Ebenso semi-Quetschen oder vollständig intakten Gehirn Abflachung zwischen Glasobjektträger und Deckgläser begrenzt die Zeit, ein verbringen Abbildung einer gegebenen Probe zu einer etwa 30-minütigen Zeitraum ^10. Trotz dieser Einschränkung thiAnsatz erfolgreich ^11-14 verwendet.

Die jüngsten Bemühungen um Live-Bild dissoziiert NBs Grenze physischen Verzerrung der isolierten Zellen. Diese Techniken sind besonders nützlich für Anwendungen, bei denen es notwendig ist, um die Zellkulturen für mehrere Zellteilungszyklen aufrecht zu erhalten. Beispielsweise kann manuell aus dispergierten Zellen dissoziiert Gehirn teilweise in ein Gerinnsel aus dem Gemisch von Fibrinogen und Thrombin, ¹⁵ für die Langzeitabbildungs ^​​16 eingebettet werden. Alternativ kann explantierten Gehirne zunächst mit dem Enzym Collagenase, neben manuell durch wiederholte Passage durch eine Pipettenspitze aufgebrochen und anschließend auf Poly-L-Lysin beschichteten Glasbodenschalen ^{17, 18} plattiert chemisch getrennt werden. Die Beschichtung Glasschalen entweder mit Fibrinogen oder Poly-L-Lysin fördert die Bindung und leichten Verbreitung von Rundzellen, bringen sie so nah an der Deck wie möglich, ohne große körperliche Verzerrung. In additiauf beinhalten diese Verfahren das Kultivieren der NBS in Medium, das leicht für pharmakologische Experimente Störungs ¹⁸ ausgetauscht werden können. Insgesamt Plattierung direkt verteilt NBs verbessert Abbildungsoptik, ohne dabei langfristigen Imaging-Funktionen. Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die langfristige Kultivierung von dissoziierten NBs wurde ¹⁹ beschrieben.

Jedoch ist dieser Ansatz nicht ohne Einschränkungen. Es gibt mehrere Einschränkungen live dissoziiert NBs Bildgebung. In einem Feld von dispergierten Zellen, beispielsweise ist es schwierig, bestimmte NB Linien, die räumlich in der intakten ¹ organisiert sind, zu identifizieren. Ebenso die Unterscheidung der Typ I gegen Typ-II-NBs in dissoziierten Gewebe ist auch ohne den Ausdruck der Abstammung oder Tracer-Subtyp-spezifischen Transgene, wie worniu-GAL4, asense-GAL80 ²⁰ herausfordernde. Obwohl diese Transgene sind sehr nützlich für einige Anwendungen, sie begrenzen Forscher diejenigen Transgene exunter der Kontrolle von UAS-Enhancer-Element ²¹ gedrückt und erfordern komplexe genetische Systeme. Studien, die die räumliche und zeitliche Entwicklung des NBs betreffen, erfordern daher in vivo-Bildgebung im Kontext eines intakten Gewebes.

Außerdem haben Studien dissoziierter embryonaler NBs anzuzeigen, dass der physische Kontakt benachbarter Zellen ist für die Zwischen Lokalisierung von Schlüsselfaktoren Polarität ^{22, 23.} Diese Studien zeigen, völlig isoliert NBs die invariante mitotischen Spindelachse nicht mehr aufrecht zu erhalten. Stattdessen werden diese Zellen zeigen eine weitere randomisierte Spindelachse und großen Winkeln der Trennung zwischen aufeinander GMC Knospen, vielleicht aufgrund des Verlustes der apikalen Zentrosom Positionierungs ^22. Obwohl die Beziehung zwischen den Larven NBs und ihre Nachbarzellen nicht ausführlich untersucht worden, ist es eine Überlegung wert, dass die Larvenstammzellmikroumgebung kann von Zellpolarität oder andere treffenVerhaltensweisen. Um die physiologischen Kontext der Larven NBs halten wir Bild ACD aus ganzen Gehirne.

Angesichts der inhärenten Einschränkungen mit bildgebenden dissoziiert NBs verbunden sind, haben unser Labor und andere Protokolle für Bild in aufeinanderfolgenden Runden der NB ACD aus ganzen Larven Gehirn etabliert. Techniken zur Bild intakten Gehirn ersetzen häufig die starre Oberfläche aus Glas auf der einen Seite der Kulturkammer mit einer flexiblen Membran, um Gewebe Verformung oder Beschädigung zu verhindern und eine für den Gasaustausch. Einige Verfahren beinhalten Montage explantierten Gehirne in einem Gemisch von Insektenkulturmedium, Serum und Ascorbinsäure mit den Fettkörpern von zehn Larven ²⁴ isoliert. Die isolierten Fettkörper hinzugefügt werden, weil sie eine Mitogen bekannt, NB Zellteilung stimulieren ²⁵ absondern. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität des Gewebes über 3 Stunden und ist daher offen für Langzeitabbildungs ^{​​24, 26-28.} Kürzlich wurde ein Protokoll beschreibt die long fristigen Abbildung des Larven intakten Gehirn in Gegenwart von Ascorbinsäure, Serum und Fettkörper wurde ²⁹ detailliert. Wichtig ist, da das Gewebe nicht ausgesetzt oder immobilisiert ist dieser Ansatz weniger nützlich für Anwendungen, in denen Kulturmedium ausgetauscht wird (z. B. Arzneimittelstudien Immunodepletion usw.).

Unser Labor hat die ganze Vorbereitung der Live-Halterung Larven Gehirne für langfristige Bildgebung ^{30, 31} vereinfacht. Der Hauptvorteil unseres Protokolls über andere ist seine Einfachheit: Unsere Beobachtungen zeigen, weder Serum, Ascorbinsäure, Insulin, noch Fettkörper sind notwendig, Zusatzstoffe Bild aufeinanderfolgende Runden NB ACD. Obwohl Additive, wie Insulin, wurden für die verlängerte Bildgebungs der Stammzellen Abteilungen ³² und kollektive Zellmigration in Drosophila Ovarien ³³ nützlich erscheinen sie entbehrlich für NB ACD sein, wie unsere Abbildungsmedium besteht aus einer einfachen Mischung von STAndard Insektenzellkulturmedium mit Antibiotika-Antimykotikum ergänzt werden, um eine Kontamination zu verhindern. Durch die Verwendung von wiederverwendbaren gasdurchlässige oder Glasboden Kulturschalen, haben wir in der Lage, mehrere Runden von aufeinanderfolgenden NB ACD zu erhalten. Die gleichen explantiert Proben können leicht für Immunfluoreszenz-und andere Verfahren mit festen Gewebe verwendet werden. In diesem Protokoll, die wir ausführlich die Präparation von intakten Larven Gehirn, sowie die Vorbereitung der Gehirne sowohl für Live-und Festanalyse.

Protocol

1. Herstellung von Materialien Erforderlich zum dritten Larven Larven Brains Explantation Bereiten Sie Werkzeuge für die Mikrodissektion erforderlich. Forge sezieren zwei Werkzeuge (ein Skalpell und ein Haken), indem zunächst eine einzelne Sektions Stift in jeder Stifthalter. Sichern Sie sich die Stifte fest mit der Hand oder mit einer Zange (Abbildung 1C). Verwenden Sie ein Paar alte Pinzette, um ein Seziersaal Pin auf einem etwa 120 ° Winkel biegen. Tun Sie dies unter …

Representative Results

Live-Bildgebung hat eine Reihe von Mechanismen, die NB ACD regeln aufgeklärt. Vor der Bildaufnahme ist es erforderlich, die optimalen Bilderzeugungsbedingungen zu bestimmen. Es ist notwendig, um den Rahmen Erfassungsrate mit der Dauer der Live Cell Imaging auszugleichen. Für feine Zellanalyse, zum Beispiel erhöhte zeitliche und optische Auflösung kann erforderlich sein. Bei der Visualisierung einer einzelnen NB Zellzyklus (Fig. 4A) kann die Geschwindigkeit, mit der Bilder aufgenommen werden, ohne da…

Discussion

Live-Cell-Imaging ist eine unschätzbare Ansatz verwendet werden, um die Mechanismen, die ACD von Stammzellen, die Differenzierung von Zelllinien regulieren zu studieren, und die Morphogenese von komplexen Geweben. Obwohl Forschergruppen haben in der Vergangenheit verwendet eine Vielzahl von Techniken, um NB ACD visualisieren können diese Ansätze im Allgemeinen in zwei Kategorien, die in erster Linie mit Bezug darauf, ob das Hirngewebe intakt gelassen oder dissoziiert unterschiedlich gruppiert werden.

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Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.