Live-Imaging av<em> Drosophila</em> Larve neuroblasts

Summary

Denne protokollen detaljer en strømlinjeformet metode som brukes til å gjennomføre levende celle bildebehandling i sammenheng med en intakt larve hjernen. Live-cell imaging-tilnærminger er uvurderlig for studiet av asymmetriske nevrale stamceller divisjoner samt andre nevrogene og utviklingsprosesser, konsekvent avdekke mekanismene som tidligere ble oversett.

Abstract

Stamceller dele asymmetrisk å generere to avkom celler med ulik skjebne potensial: en selvfornyende stamcelle og en differensierende celle. Gitt deres relevans for utvikling og sykdom, forstå mekanismene som styrer asymmetrisk stamcelle divisjon har vært en robust fagområde. Fordi de er genetisk medgjørlig og gjennomgår suksessive runder av celledeling omtrent en gang hver time, stamcellene i Drosophila sentralnervesystemet, eller neuroblasts, er uunnværlig modeller for studier av stammen celledeling. Rundt 100 nevrale stamceller er plassert i nærheten av overflaten av hvert av de to larvehjernelapper, noe som gjør dette modellsystemet er spesielt nyttig for direkte avbildning mikros studier. I dette arbeidet, vurderer vi flere tilnærminger mye brukt for å visualisere stamcelle divisjoner, og vi adressere de relative fordeler og ulemper ved de teknikker som ansetter dissosiert versus intakte hjernen vev. Vi har også detalj vår simplifIED protokoll som brukes eksplanterer Hjernene fra tredje stadiums larver for live cell imaging og faste analyse applikasjoner.

Introduction

Stamceller opprettholde en balanse mellom differensiering og selvfornyelse for å generere mobil mangfold under tidlig utvikling og erstatte skadede celler i voksen vev. Regulering av dette homeostase hindrer både tap og over-utvidelse av stamcelle befolkningen, noe som kan resultere i skadelig vev degenerasjon eller tumorigenesis.

Neuroblasts (NBS) er de mye studert neural stamceller i Drosophila sentralnervesystemet (figur 1A), som først dannes ved embryonale trinn ^{1, 2.} NBs gjennomgå gjentatte runder med asymmetrisk celledeling (ACD) til å produsere to ulikt skjebnebestemt celler: en selvfornyende stamcelle og en differensierende celle. ACD styres av centrosomes, de ikke-membran organeller som fungerer som de mikrotubulus-organiseringssenter av de fleste cellene ^tre. Under mitose, NB centrosomes organisere og orientere bipolar mitotisk spindel langs den apikale-basal polarligheten aksen. Ved spalting av å dele NB, apikale skjebne determinants som angir stamcelle skjebne, og basal skjebne determinants som angir differensiering, er adskilt i den skjeve datterceller.

I larve sentrale hjernen, kan to typer NBS være preget av deres antall, posisjon, transkripsjonsfaktor uttrykket, og celle avstamning (figur 1A) ^4-6. Type I NBS er de mest tallrike, og om lag 90 av dem fylle de fremre og bakre sidene av hver optisk flik av hjernen ^7.. Disse NBs uttrykke transkripsjonsfaktor Asense (Åse), og de ​​karakteristiske dele inn i en selvfornyende NB og en mindre ganglion mor celle (GMC, figur 1B). Hver GMC gjennomgår en enkelt terminal divisjon til å generere to nevroner eller gliaceller (Figur 1B). I kontrast, de åtte Type II NBs som befolker den bakre side av hver optisk lapp mangler Ase uttrykk ^fem. De gjennomgår ACDå produsere en selvfornyende NB og en mellomliggende nevrale stamceller (INP).

Den INP i sin tur skiller asymmetrisk tre til fem ganger. Hver av disse avdelinger resulterer i regenerering av INP og produksjonen av en enkelt GMC ^4.. Kollektivt, den spesifikke NB identitet og tidsmessige rekkefølgen av GMC fødsel gir opphav til den forbløffende nevronale mangfold av voksne sentralnervesystemet.

Forstå cellebiologi som ligger til grunn NB ACD er blitt vesentlig forbedret gjennom bruk av levende celle imaging teknikker. Publisert protokollene som brukes av forskere til bilde levende NBs varierer mye. Samlet, men disse metodene kan grupperes i to generelle kategorier preget av hvorvidt larve hjernen er intakt eller mekanisk dissosiert. Begge teknikkene har klare fordeler og ulemper avhengig av forskerens søknad.

Tidlige rapporter avslører levende NB celle utbytteutslipp innebære en viss grad av manuell dissosiasjon av larve hjernen. Disse protokollene detalj smøre ⁸ eller erting hverandre ⁿⁱ hjernen for å vokse kortsiktige primærkulturer av NBS på glass dekkglass. For å bedre bildebehandling, er de runde NBs vanligvis flatet på Dekkglass med enten glassplater ⁸ eller agarose pads ^ni. Selv om flate celler har forbedret optikk, er disse teknikker fører ofte til NB mitotiske defekter, herunder regresjon av spalting furen og manglende evne til å dele seg mer enn en gang. Derfor er protokoller som involverer både manuell dissosiasjon og fysisk forvrengning av larve hjernevev vanligvis bare egnet til svært kortsiktig (dvs.., En cellesyklus eller mindre) applikasjoner. Likeledes, begrenser semi-squashing eller helt flate intakte hjerne mellom glassplater og dekk den tid en kan bruke imaging en gitt prøven til en ca 30 min perioden ^10. Til tross for denne begrensningen, this tilnærming har vært brukt med hell ^11-14.

Siste innsats til bilde levende dissociated NBS grense fysisk forvrengning av de isolerte celler. Disse teknikkene er spesielt nyttige for anvendelser hvor det er nødvendig for å opprettholde cellekulturer for flere celledeling sykluser. For eksempel kan dispergerte celler fra manuelt dissosierte hjerner være delvis innleiret i en blodpropp laget av en blanding av fibrinogen og trombin ¹⁵ for langvarig avbildning ^16.. Alternativt kan eksplanterte hjerner være første kjemisk dissosiert med enzymet collagenase, neste manuelt avbrutt av gjentatte passasje gjennom en pipette tips, og deretter belagt på poly-L-lysin-belagt glassbunn retter ^{17, 18.} Coating glass retter med enten fibrinogen eller poly-L-lysin fremmer vedlegget og svak spredning av runde celler, og bringer dem så nær dekkglass som mulig uten store fysiske forvrengning. I tilpå disse metoder involverer dyrkning av NBS i medium som lett kan byttes mot farmakologiske perturbasjons eksperimenter ^18. Overall, direkte plating spredt NBS forbedrer bilde optikk uten å ofre langsiktige imaging evner. Nylig, har en protokoll som beskriver den langsiktige dyrking av dissociated NBS blitt beskrevet ^19.

Imidlertid er denne metode ikke uten begrensninger. Det er flere begrensninger til bildebehandling levende dissosiert NBs. I et felt av dispergerte celler, for eksempel, er det vanskelig å identifisere spesifikke NB linjene som er romlig organisert i intakte hjerne ^1.. Likeledes, skille Type I versus Type II NBs innenfor dissociated vev er også utfordrende uten uttrykk for avstamning sporstoff eller subtype spesifikke transgener, slik som worniu-Gal4, asense-GAL80 ^20. Selv om disse transgener er ganske nyttig for enkelte programmer, de begrense forskerne til de transgener extrykket under kontroll av UAS forsterkerelement ²¹ og krever mer kompliserte genetiske ordninger. Studier som angår den romlige eller tidsmessig utvikling av NBS, derfor krever in vivo avbildning i sammenheng med en intakt vev.

Videre studier av dissosiert embryonale NBS tyder på at den fysiske kontakt mellom tilstøtende celler, er kritisk for den inter lokalisering av nøkkelen polaritet determinanter ^{22, 23.} Disse studiene viser helt isolert NBS ikke lenger opprettholde invariant mitotisk spindel aksen. I stedet, disse cellene vise en mer randomiserte spindel aksen og brede vinkler av separasjon mellom påfølgende GMC knopper, kanskje på grunn av tap av apikale sentrosomen posisjonering ^22. Selv om forholdet mellom larve NBs og deres nabocellene ikke har blitt grundig studert, er det verdt å vurdere at larvestamcellemikromiljøet kan skje på bekostning celle polaritet eller annenatferd. For å opprettholde den fysiologiske sammenheng med larve NBS, vi image ACD fra hele hjerner.

Gitt den iboende begrensninger knyttet til bildebehandling dissosiert NBs, har vår lab og andre etablerte protokoller til bilde suksessive runder med NB ACD fra hele larve hjerner. Teknikker til bilde intakte hjerne ofte erstatte den stive overflate av glasset på den ene side av kulturkammer med en fleksibel membran for å hindre at vevet forvrengning eller skade og tillate for gassutveksling. Noen metoder innebærer montering eksplanterte hjernene i en blanding av insekt dyrking medium, serum og askorbinsyre med fett organer isolert fra ti larver ^24.. De isolerte fete kropper er lagt fordi de skiller ut en mitogen kjent for å stimulere NB celledeling ^25. Denne protokollen bevarer integriteten av vev på over 3 timer, og er derfor mottagelig for langvarig avbildning ^{24, 26-28.} Nylig har en protokoll beskriver long-term avbildning av intakte larve hjerner i nærvær av askorbinsyre, serum, organer og fett er blitt beskrevet ^29. Viktigere, fordi vevet er verken utsettes eller immobilisert, er denne tilnærmingen mindre nyttig for applikasjoner der dyrking medium utveksles (f.eks medikamentstudier, immunodepletion, osv..).

Vårt laboratorium har forenklet hele fjellet utarbeidelse av levende larve hjerner for langsiktig bildebehandling ^{30, 31.} Den største fordelen til vår protokoll over andre er dens enkelhet: våre observasjoner tyder på verken serum, askorbinsyre, insulin, og heller ikke fett kropper er nødvendige tilsetningsstoffer til bilde suksessive runder med NB ACD. Selv om tilsetninger, som for eksempel insulin, har vært anvendelige for langvarig avbildning av stammen celledelinger ³² og samlecellemigrering in Drosophila eggstokkene ^33, synes de å være unnværlig for NB ACD, som vår bildedannende medium består av en enkel blanding av standard insektcelle dyrkningsmedium supplert med antibiotisk-antimykotisk for å unngå forurensning. Gjennom bruk av gjenbrukbare gass-permeable eller glassbunn kultur retter, har vi vært i stand til å opprettholde flere runder med påfølgende NB ACDs. De samme eksplanterte prøver kan lett brukes for immunfluorescens og andre prosedyrer med fast vev. I denne protokoll har vi detalj disseksjon av intakte larve hjernen, så vel som fremstillingen av hjernen for både direkte og fast-analyse.

Protocol

En. Utarbeidelse av Materialer som er nødvendige for å Eksplanter Tredje Instar Larve Brains Forbered verktøy som kreves for microdissection. Smi to dissekere verktøy (en skalpell og en krok) ved først å plassere en enkelt dissekere pin hver pin holderen inn. Fest pinnene tett for hånd eller med en tang (figur 1C). Bruk et par gamle pinsett til å bøye en dissekere pin til en ca 120 ° vinkel. Gjør dette under et dissekere mikroskop for å sikre at den øverste hal…

Representative Results

Live-imaging har belyst en rekke mekanismer som regulerer NB ACD. Før bilde oppkjøpet, er det nødvendig å bestemme optimale bildeforhold. Det er nødvendig å balansere ramme fange sats med varigheten av levende celle bildebehandling. For fin cellulær analyse, for eksempel økt temporal-og optisk oppløsning kan være nødvendig. Ved å visualisere en enkelt NB cellesyklus (figur 4A), vil hastigheten ved hvilken bildene blir tatt økes uten å innføre photodamage. Vanligvis kan enkelt celledeling …

Discussion

Live-cell imaging er en uvurderlig metode som brukes for å studere mekanismene som regulerer ACD av stamceller, differensiering av celle linjene, og morphogenesis av komplekse vev. Selv forskningsgrupper har historisk sett benyttet en rekke teknikker for å visualisere NB ACD, kan disse metodene bli generelt grupperes i to kategorier som primært skiller seg med hensyn til hvorvidt hjernevev er intakt eller dissosiert.

Imaging dissociated NBS har sine fordeler. For ett, dissosiert NBs er le…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.