Imagerie en direct de<em> Drosophila</em> larves Neuroblastes

Summary

Ce protocole détaille une méthode simplifiée utilisée pour effectuer l'imagerie des cellules vivantes dans le cadre d'un cerveau intact larvaire. Approches d'imagerie des cellules vivantes sont très précieux pour l'étude des divisions de cellules souches neurales asymétriques ainsi que d'autres processus neurogène et de développement, les mécanismes qui ont été précédemment négligés découvrant constamment.

Abstract

Les cellules souches se divisent de façon asymétrique pour générer deux cellules filles ayant un potentiel de sort inégal: une cellule souche auto-renouvellement et de différenciation d'une cellule. Compte tenu de leur importance pour le développement et la maladie, la compréhension des mécanismes qui régissent la division des cellules souches asymétrique a été une zone robuste d'étude. Parce qu'ils sont génétiquement docile et soumis à des cycles successifs de la division cellulaire environ une fois toutes les heures, les cellules souches du système nerveux central chez la drosophile, ou neuroblastes, sont des modèles indispensables pour l'étude de la division des cellules souches. Environ 100 cellules souches neurales sont situés près de la surface de chacun des deux lobes du cerveau des larves, ce qui rend ce système modèle particulièrement utile pour des études de microscopie d'imagerie en temps réel. Dans ce travail, nous passons en revue plusieurs approches couramment utilisées pour visualiser les divisions de cellules souches, et nous abordons les avantages et les inconvénients de ces techniques qui emploient indissociables contre tissus cérébraux intacts. Nous avons également en détail notre simplified protocole utilisé pour explantation cerveaux entiers de troisième stade larvaire pour l'imagerie des cellules vivantes et des applications d'analyse fixes.

Introduction

Les cellules souches de maintenir un équilibre de la différenciation et de l'auto-renouvellement pour générer la diversité cellulaire au cours du développement précoce et remplacer les cellules endommagées dans les tissus adultes. Le règlement de cette homéostasie empêche à la fois la perte et la sur-expansion de la population de cellules souches, ce qui peut entraîner une dégénérescence tissulaire néfaste ou la tumorigenèse.

Neuroblastes (NBS) sont les cellules souches neurales largement étudiés du système nerveux central chez la drosophile (figure 1A) que première forme embryonnaire pendant ^{1, 2.} NBs subissent des cycles répétés de la division cellulaire asymétrique (ACD) pour produire deux cellules inégalement malheureuse: une cellule souche auto-renouvellement et une cellule de différenciation. ACD est guidé par centrosomes, les organites non-membraneux qui agissent comme des centres microtubules organisation de la plupart des cellules ^3. Au cours de la mitose, centrosomes NB organisent et orientent le fuseau mitotique bipolaire long de la polaire apicale-basaleaxe lité. Lors du clivage de la division NB, les déterminants du devenir apical qui spécifient le destin des cellules souches, et les déterminants du devenir basales qui spécifient la différenciation, sont séparés dans les cellules filles inégales.

Dans le cerveau des larves central, deux types de NBs peuvent être distingués par leur nombre, la position, l'expression du facteur de transcription, et la lignée cellulaire (figure 1A) ^6.4. Type I ON sont les plus abondants, et environ 90 d'entre eux peuplent les côtés antérieur et postérieur de chaque lobe optique du cerveau ^7. Ces organismes notifiés expriment le facteur de transcription Asense (Ase), et ils se divisent caractéristique dans un auto-renouvellement NB et un plus petit ganglion cellule mère (GMC, figure 1B). Chaque GMC subit une seule division borne à générer deux neurones ou des cellules gliales (figure 1B). En revanche, les organismes notifiés huit de type II qui peuplent la face postérieure de chaque lobe optique manquent Ase expression ^5. Ils subissent ACDpour produire une auto-renouvellement NB et un progéniteur neural intermédiaire (INP).

Le INP, à son tour, se divise de manière asymétrique trois à cinq fois. Chacun de ces résultats des divisions dans la régénération de l'INP et la production d'un seul GMC ^4. Collectivement, l'identité spécifique NB et l'ordre temporel de naissance GMC donne lieu à la diversité étonnante de neurones du système nerveux central adulte.

Compréhension de la biologie cellulaire qui sous-tend NB ACD a été grandement améliorée par l'utilisation de techniques d'imagerie des cellules. Protocoles publiés utilisées par les chercheurs à l'image NBs vivants varient considérablement. Dans l'ensemble, cependant, ces méthodes peuvent être regroupées en deux catégories générales se distinguent par le fait que le cerveau larvaire est laissé intact ou mécaniquement dissocié. Les deux techniques ont des avantages et des inconvénients distincts en fonction de la demande du chercheur.

Les premiers rapports révélant en direct division cellulaire NBsions impliquent un certain degré de dissociation manuel du cerveau larvaire. Ces protocoles détail bavures ⁸ ou ⁹ taquiner à part le cerveau afin de développer des cultures primaires à court terme de la BNS sur des lamelles de verre. Pour améliorer l'imagerie, les organismes notifiés rondes sont généralement aplatis sur les lamelles soit avec des lames de verre ⁸ ou ⁹ pads agarose. Bien que les cellules aplaties ont amélioré l'optique, ces techniques entraînent souvent des défauts NB mitotiques, y compris la régression du sillon de clivage et l'incapacité à diviser plus d'une fois. Par conséquent, les protocoles qui impliquent à la fois manuel et la distorsion dissociation physique du tissu cérébral larves ne sont généralement adaptés à court terme (c.-à-., Un cycle cellulaire ou moins) très applications. De même, semi-écrasement ou aplatissement complètement cerveaux intacts entre des lames de verre et des lamelles limite le temps on peut passer imagerie un échantillon donné, à une période d'environ 30 min ^10. Malgré cette limitation, this approche a été utilisée avec succès ^11-14.

Les efforts récents de l'image en direct dissociés limite NBs distorsion physique des cellules isolées. Ces techniques sont particulièrement utiles pour des applications où il est nécessaire de maintenir des cultures de cellules pour plusieurs cycles de division cellulaire. Par exemple, les cellules dispersées dans des cerveaux dissociées manuellement peuvent être partiellement noyés dans un caillot fabriqué à partir du mélange de fibrinogène et de la thrombine ¹⁵ pour l'imagerie à long terme ^16. En variante, les cerveaux explantées peuvent être dissociées premier chimiquement avec l'enzyme collagénase, la prochaine perturbation manuellement par passage répété à travers un embout de pipette, et ensuite étalées sur des boîtes de poly-L-lysine à fond de verre ^{17, 18.} Revêtement plats en verre avec soit fibrinogène ou poly-L-lysine favorise l'attachement et légère propagation des cellules rondes, leur apportant le plus près de la lamelle possible sans distorsion majeure physique. En additisur, ces méthodes impliquent la culture de la notifiés dans un milieu qui peut être facilement échangé des expériences de perturbation pharmacologiques ^18. Dans l'ensemble, le placage directement dispersé NBs améliore optique d'imagerie sans sacrifier les capacités d'imagerie à long terme. Récemment, un protocole décrivant la culture à long terme des organismes notifiés dissocié a été détaillé ^19.

Cependant, cette approche n'est pas sans limites. Il ya plusieurs mises en garde à l'imagerie NBs direct dissociées. Dans un champ de cellules dispersées, par exemple, il est difficile d'identifier des lignées de NB spécifiques qui sont organisées spatialement dans le cerveau intact ^1. De même, la distinction du type I par rapport type II notifiés dans le tissu dissocié est également difficile sans l'expression de marqueurs de la lignée ou transgènes spécifiques des sous-types, tels que worniu-GAL4, GAL80 ^aSENSE-20. Bien que ces transgènes sont très utiles pour certaines applications, ils ne limitent les chercheurs à ceux transgènes expressé sous le contrôle de l'élément UAS d'activateur ²¹ et nécessitent des systèmes génétiques complexes. Les études qui concernent la mise au point spatial ou temporel du NB, par conséquent, nécessitent l'imagerie in vivo dans le cadre d'un tissu intact.

En outre, des études sur les ON embryonnaires dissociées indiquent que le contact physique de cellules adjacentes est critique pour la localisation d'interphase de polarité clé Déterminants ^{22, 23.} Ces études montrent complètement isolé NBs plus maintenir l'axe de fuseau mitotique invariant. Au lieu de cela, ces cellules présentent un axe de broche plus aléatoires et de larges angles de séparation entre les bourgeons GMC successives, peut-être en raison de la perte de positionnement du centrosome apicale ^22. Bien que la relation entre les organismes notifiés larves et leurs cellules voisines n'a pas été étudié, il est intéressant de considérer que le microenvironnement des cellules souches larvaire peut empiéter sur la polarité cellulaire ou autrecomportements. Pour maintenir le contexte physiologique des larves de NB, nous l'image ACD à partir de cerveaux entiers.

Compte tenu des limites inhérentes à l'imagerie dissocié NB, notre laboratoire et d'autres ont établi des protocoles à l'image des cycles successifs de NB ACD du cerveau larves entières. Les techniques à l'image cerveaux intacts remplacent souvent la surface de verre rigide d'un côté de la chambre de culture avec une membrane flexible pour empêcher la déformation ou endommagement des tissus et pour permettre l'échange de gaz. Certains procédés impliquent le montage cerveaux explantées dans un mélange de milieu de culture d'insecte, le sérum, et l'acide ascorbique avec les corps gras isolés à partir de dix larves ^24. Les corps gras isolées sont ajoutés parce qu'ils sécrètent un mitogène connu pour stimuler la division cellulaire NB ^25. Ce protocole préserve l'intégrité du tissu pendant plus de 3 heures et est, par conséquent, se prêtent à l'imagerie à long terme ^{24, 26-28.} Récemment, un protocole décrivant la lonimagerie g terme de cerveaux larves intactes en présence de l'acide ascorbique, le sérum et corps gras a été détaillé ^29. Il est important, parce que le tissu n'est ni exposé ni immobilisé, cette approche est moins utile pour des applications où milieu de culture est échangé (par exemple, des études de médicaments, immunodéplétion, etc.).

Notre laboratoire a simplifié l'ensemble de la préparation de montage de cerveaux de larves vivantes pour l'imagerie à long terme ^{30, 31.} Le principal avantage de notre protocole sur les autres est sa simplicité: nos observations indiquent ni sérum, l'acide ascorbique, de l'insuline, ni corps gras sont les additifs nécessaires à l'image des cycles successifs de NB ACD. Bien que des additifs tels que l'insuline, ont été utiles pour l'imagerie prolongée de divisions de cellules souches ³² et migration collective de cellules dans les ovaires chez la drosophile ^33, ils semblent être indispensables pour NB ACD, comme notre moyen d'imagerie consiste en un simple mélange de standard insecte milieu de culture cellulaire supplémenté avec l'antibiotique-antimycosique pour éviter la contamination. Grâce à l'utilisation de plats gaz-perméables ou en verre réutilisables culture sur le fond, nous avons été en mesure de soutenir plusieurs séries de successives NB ACD. Les mêmes échantillons expiantes peuvent facilement être utilisés pour l'immunofluorescence et d'autres procédures avec tissu fixé. Dans ce protocole, nous détaillons la dissection des cerveaux de larves intactes, ainsi que la préparation des cerveaux pour analyse à la fois en direct et fixe.

Protocol

1. Préparation du matériel requis pour explant Brains troisième stade larvaire Préparer les outils nécessaires pour microdissection. Forge deux outils de dissection (un scalpel et un crochet) en plaçant d'abord un axe de dissection unique dans chaque support de broche. Garantir les broches étroitement main et l'aide de pinces (La figure 1C). Utilisez une paire de vieilles pinces à plier une broche de dissection à un angle d'environ 120 °. Pour ce faire…

Representative Results

Imagerie en temps réel a élucidé un certain nombre de mécanismes qui régulent NB ACD. Avant l'acquisition des images, il est nécessaire de déterminer les conditions optimales d'imagerie. Il est nécessaire d'équilibrer le taux de capture d'image avec la durée d'imagerie des cellules vivantes. Pour l'analyse cellulaire fine, par exemple, a augmenté temporelle et la résolution optique peut être nécessaire. Quand la visualisation d'un cycle cellulaire NB unique (figure 4A),<…

Discussion

Imagerie des cellules vivantes est une approche précieuse utilisée pour étudier les mécanismes qui régulent ACD de cellules souches, la différenciation des lignées cellulaires, et la morphogenèse des tissus complexes. Bien que les groupes de recherche ont toujours utilisé une variété de techniques pour visualiser NB ACD, ces approches peuvent généralement être regroupés en deux catégories qui diffèrent principalement quant à savoir si le tissu cérébral est laissé intact ou dissocié.

<p class="j…

Materials

Lumox Tissue Culture Dish 50X12 mm	Sarstedt	94.6077.410	A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium	Invitrogen	21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x)	Invitrogen	15240-062	A supplement containing penicillin (10,000 U/mL), streptomycin (10,000 mg/mL), and amphotericin B (25 mg/mL) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination.
Glass coverslips, #1.5 22X22 mm	Fisher Scientific	12-541-B
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898	A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long	Fine Science Tools	26018-17
Minutien dissecting pins	Fine Science Tools	26002-10
pair of Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle	Fisher Scientific	08-965-A
Syringe filter, 0.22 mm pore size	Fisher Scientific	09-719A
Syringe 5 mL	BD Biosciences	309646
plastic transfer pipet	Fisher Scientific	S30467-1
paraformaldehyde, 32% EM-grade	Electron Microscopy Sciences	15714	CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride)	Invitrogen	D1306	A dye that labels DNA and is excited by UV light.
Aqua/PolyMount; Polysciences, Inc.	Fisher Scientific	18606-20	A water-soluble mounting medium.