Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Живая съемка doi: 10.3791/51756 Published: July 7, 2014

Summary

Этот протокол детали обтекаемый метод, используемый для проведения изображений живых клеток в контексте интактной личиночной мозга. Подходы изображений живых клеток имеют неоценимое значение для изучения асимметричных делений нейронных стволовых клеток, а также других нейрогенных и развития процессов, последовательно раскрывая механизмы, которые ранее были замечены.

Abstract

Стволовые клетки делятся асимметрично для создания двух потомство клеток с неравной судьба потенциала: в самообновляющейся стволовых клеток и дифференциации клетки. Учитывая их актуальность для развития и болезни, понимание механизмов, которые регулируют деление асимметричный стволовых клеток была надежной областью исследования. Потому что они генетически послушный и пройти последовательных раундов деления клеток примерно раз каждый час, стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы, или нейробластах, являются незаменимыми моделями для изучения деления стволовых клеток. Около 100 нервные стволовые клетки находятся вблизи поверхности каждого из двух личинок долей головного мозга, что делает эту модель система особенно полезна для живых изображений микроскопических исследований. В этой работе мы рассмотрим несколько подходов, широко используемые для визуализации стволовых клеток подразделения, и мы обращаемся относительные преимущества и недостатки этих методов, которые используют диссоциированных против здоровых тканей мозга. Мы также подробно наш simplifIED протокол, используемый для эксплантата целые мозги от третьего возраста личинок для изображений живых клеток и приложений фиксированных анализа.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Стволовые клетки поддерживать баланс дифференциации и самообновление генерировать сотовой разнообразие во время раннего развития и заменить поврежденные клетки во взрослых тканях. Регулирование этого гомеостаза предотвращает как потери и над-расширение популяции стволовых клеток, что может привести к вредным дегенерации тканей или опухолей.

Нейробластов (NBS) являются широко изучены нервные стволовые клетки Drosophila центральной нервной системы (рис. 1А), что первые формы во время эмбриональных стадий 1, 2. NBs пройти неоднократные вспышки асимметричных клеточных делений (ACD) для получения двух неравномерно суждено клетки: самообновлению стволовых клеток и дифференциации клеток. ACD руководствуется центросомах, не-мембранных органелл, которые действуют как микротрубочки организующих центрах большинства клеток 3. Во время митоза, NB центросомы организовать и ориентировать биполярного митотическое веретено вдоль апикально-базальной полярнаяОсь ность. При отщеплении разделяющей NB, верхушечные судьба детерминанты, определяющие судьбу стволовых клеток и базальных судьба детерминанты, определяющие дифференциацию, выделяются в неравных дочерних клеток.

В личиночной центральной мозга, два типа NBs можно отличить по их числу, должность, выражения фактора транскрипции, и клеточной линии (рис. 1А) 4-6. Тип I NBs являются наиболее распространенными, и около 90 из них заполнить переднюю и заднюю стороны каждого зрительного доли головного мозга 7. Эти NBs выразить транскрипционный фактор Asense (ASE), и они характерно разделить на одной самообновляющейся NB и один меньше ганглий материнская клетка (GMC; рис. 1В). Каждый GMC подвергается одной дивизии терминала генерировать два нейрона или глии (рис. 1b). В отличие от этого, НБС восемь Type II, которые населяют заднюю сторону каждой оптической доле хватает ASE выражение 5. Они проходят ACDДля производства одного самообновлению NB и один промежуточный нейронной прародителя (ИЯФ).

ИЯФ, в свою очередь, делит асимметрично три-пять раз. Каждый из этих отделов приводит к регенерации ИЯФ и производства одного GMC 4. В совокупности конкретных идентичность NB и временной порядок GMC рождения приводит к поразительному разнообразию нейронов взрослого центральной нервной системы.

Понимание клеточной биологии, что лежит в основе NB ACD была значительно улучшена за счет использования живых методов визуализации клеток. Опубликованные протоколы, используемые исследователями к фото живых NBs варьироваться в широких пределах. В целом, однако, эти методы могут быть сгруппированы в две основные категории, отличающихся личиночной мозг остается ли нетронутыми или механически диссоциируют. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки в зависимости от применения исследователя.

Ранние сообщения, раскрывающие живой NB клеток DIVIsions подразумевают некоторую степень ручного диссоциации личиночной мозга. Эти протоколы деталь размазывая 8 или дразнить друг от друга 9 мозг, чтобы расти краткосрочные первичных культур НБС на покровные стекла. Для улучшения визуализации, круглые NBs обычно сжатая с покровные с либо стеклах 8 или геле колодки 9. Хотя уплощенных клеток улучшили оптику, эти методы часто приводят к NB митотических дефектов, в том числе регрессии щели расхождения и невозможности разделить более чем один раз. Таким образом, протоколы, связанные как ручной диссоциации и физическое искажение личиночной мозговой ткани, как правило, только подходит для очень краткосрочные (т.е.., Один клеточный цикл или меньше) приложения. Кроме того, полу-недопустимыми или полностью уплощение неповрежденные мозги между стеклах и покровные ограничивает время можно потратить с изображениями данного образца к примерно 30-минутного периода 10. Несмотря на это ограничение, Тхис подход успешно используется 11-14.

Недавние усилия, чтобы жить изображений в отрыве предел NBS физическое искажение изолированных клеток. Эти методы особенно полезны для приложений, где необходимо поддерживать клеточных культур для нескольких циклов деления клеток. Например, диспергированные клетки из диссоциированных вручную мозга может быть частично встроен в сгусток, изготовленного из смеси фибриногена и тромбина 15 для долгосрочного изображений 16. Кроме того, эксплантированной мозг может быть сначала химически диссоциирует с ферментом коллагеназой, следующий вручную путем многократного нарушенного прохождении через концом пипетки, а затем высевали на поли-L-лизин покрытием со стеклянным дном блюда 17, 18. Покрытие стеклянной посуды либо фибриногена или поли-L-лизина способствует прикреплению и небольшое распространение круглых клеток, в результате чего их как можно ближе к покровным как можно без больших физических искажений. В дополнительна эти способы включают культивирование НБС в среде, которая может быть легко обменены на фармакологических экспериментов возмущений 18. В целом, непосредственно покрытие разошлись NBs улучшает изображений оптики без ущерба для долгосрочных возможности визуализации. В последнее время это протокол, описывающий долгосрочную культивирование диссоциированном NBs был подробно описан 19.

Однако этот подход не лишен ограничений. Есть несколько предостережений, чтобы изображений живых разложенных NBs. В поле диспергированных клеток, например, трудно определить конкретные NB клоны, которые пространственно организованных в интактном мозге 1. Кроме того, различия типа я против Тип NBS II в рамках диссоциированном ткани также представляет значительную проблему без выражения клона индикаторов или подтипа конкретных трансгенов, таких как worniu-GAL4, asense-GAL80 20. Хотя эти трансгены весьма полезны для некоторых применений, они ограничивают исследователей тех трансгенов экспрессуют под контролем энхансера UAS элемента 21 и требуют более сложных схем генетические. Исследования, которые касаются пространственного или временного развитие NBs, следовательно, требуют в естественных изображений в контексте интактной ткани.

Более того, исследования диссоциированных эмбриональных NBs показывают, что физический контакт соседних клеток имеет решающее значение для интерфаза локализация ключевых полярности детерминанты 22, 23. Эти исследования показывают, полностью изолированы NBs больше не поддерживать инвариант ось митотического веретена. Вместо этого, эти клетки отображать более рандомизированных оси шпинделя и широкие углы разделения между последовательными почек GMC, возможно, связано с потерей апикальной центросом позиционирования 22. Хотя отношения между личиночной NBs и их соседних клеток не была изучена, стоит учесть, что личинок микросреда стволовых клеток может посягать на клеточной полярности или другихповедения. Для поддержания физиологического контекст личиночной NBs, мы изображение ACD из цельных мозгов.

Учитывая присущие ограничения, связанные с изображениями в отрыве NBs, наша лаборатория и другие разработали протоколы для изображения последовательных раундов NB ACD из целых личинок мозгов. Методы к изображению мозга интактных часто заменять жесткой поверхности стекла на одной стороне культуральной камере с гибкой мембраны, чтобы предотвратить искажение ткани или повреждений и позволяют для газообмена. Некоторые способы включают монтажа эксплантированной мозги в смеси с насекомыми культивирования среды, сыворотка, и аскорбиновой кислоты с жиром органов, выделенных из десять личинок 24. Выделенные жира тела добавляются, потому что они выделяют митоген известно, стимулирует NB деление клеток 25. Этот протокол сохраняет целостность ткани свыше 3 часов, а, следовательно, поддаются долгосрочному изображений 24, 26-28. В последнее время это протокол, описывающий долготаг-термин изображений интактных личинок мозга в присутствии аскорбиновой кислоты, сыворотки и жировых тел была подробно 29. Важно отметить, что, так как ткань не является ни подвергается ни стопорится, такой подход является менее полезны для приложений, где происходит обмен культивирование среднего (например, исследований наркотиков, immunodepletion и др.).

Наша лаборатория упростил всю подготовку монтирования живых личинок мозгов для долгосрочного изображений 30, 31. Главное преимущество нашего протокола над другими является его простота: наши наблюдения показывают, ни сыворотку, аскорбиновую кислоту, инсулин, ни жира тела являются необходимые добавки к фото последовательных раундов NB ACD. Хотя добавки, такие как инсулин, были полезны для длительного визуализации стволовых клеточных делений 32 и коллективной миграции клеток в дрозофилы яичников 33, они, кажется, безразличен для NB ACD, как наш изображений среда состоит из простой смеси станцийndard насекомое культивирования клеток, дополненной антибиотика-противогрибкового для предотвращения загрязнения. Благодаря использованию многоразовых газопроницаемой или стеклянным дном чашки для культивирования, мы были в состоянии выдержать несколько раундов последовательных NB ACDS. Те же образцы эксплантированной легко может быть использован для иммунофлуоресценции и других процедур с фиксированной ткани. В этом протоколе, мы подробно рассечение интактных личинок мозгов, а также подготовка мозги как для живой и фиксированной анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка материалов для эксплантата третьего возраста личинок Brains

  1. Подготовьте инструменты, необходимые для микродиссекции.
    1. Кузница два рассекает инструменты (скальпель и крюк), разместив один рассекает штифт в каждого держателя контактный. Закрепите флажки плотно вручную или с помощью плоскогубцев (рис. 1в).
    2. Используйте пару старых щипцов согнуть одну рассекает штифт к примерно 120 углом °. Сделайте это при вскрытии микроскопом, чтобы убедиться, что верхняя половина штифта находится квартира, когда держатель штифт в руке. Этот инструмент будет использоваться в качестве скальпелем провести вниз или срез через ткань.
    3. Используйте пару старых щипцов согнуть второй палец в крюк, который будет использоваться для хранения и соскрести ткани.
    4. Обложка каждого рассекает инструмент с кончика пипетки, чтобы защитить инструмент от повреждений. С осторожностью, хорошо сформированные инструменты могут быть использованы для рассечения до бесконечности. Замените поврежденные или деформированные флажки по мере необходимости.
    </ Li>
  2. Подготовка рассекает среду.
    1. В капот культуры ткани, разбавить антибиотик противогрибкового дополнение в культивирования среды в Шнайдера. Вихревой СМИ включить дополнение.
    2. Подготовьте несколько 5 мл аликвоты дополненных средствами массовой информации. Храните все средства массовой информации при 4 ° С до готовности к использованию.
    3. Теплый в 5 мл аликвоты дополненной среде до комнатной температуры. Нарисуйте среду в стерильный 5 мл шприц и винт на стерильной шприцевой фильтр 0,2 мкм.
  3. Выберите личинок для вскрытия. Используйте рассекает зонд для выбора ползком третий личинок Instar как мозг будет легче анализировать. Дополнительно: депозит личинки на виноград агаром.
    Примечание: Не используйте чрезмерно переполненные флаконы или бутылки с «мокрой пищи", как они, как правило, чтобы заставить вторую или первую личинок возраста в выползти преждевременно.
    Примечание: Некоторые генетические фоны потребует использования более молодых личинок. Это не влияет на протокол, но сделать дissection сложнее.

2. Рассечение центральной нервной системы

  1. На одном стекле, создать два 50 мл пулы теплых рассекая сред, разделенных примерно на 3 см.. Один бассейн будет использоваться для валового вскрытия и других, используемых для тонкой вскрытия (рис. 1в).
  2. Передавать несколько личинок к одному из капель информации.
  3. Перемещение покровное с личинок вскрытии микроскопом. Увеличить в бассейне, содержащей личинки такое, что передняя и задняя концы личинок заметны.
  4. Используйте пары щипцов понять середине область одной личинки. Возьмите вторую пару щипцов, с другой стороны и понять личинку близко к той же области. Потяните две пары щипцов на части, чтобы аккуратно оторвать личинку в два раза. Повторите эти два шага для всех личинок на покровное.
  5. Утилизировать задних половин тела личинки, переводя их в ткани.
  6. Осмотрите личинки так, чтобы йе передние mouthhooks четко видны. Используйте обе пары щипцов для создания небольшой разрез, или вырез, на противоположных сторонах личиночной mouthhooks между третьим грудной и первых передних зубец полос.
  7. Возьмитесь за mouthhooks пинцетом в не доминантной рукой. Используйте пинцет в другой стороны, чтобы мягко удаляйте кутикулу в направлении вперед-назад на-задней. Продолжайте медленно удаляйте кутикулу, пока центральная нервная система не подвергается.
  8. Изолируйте на центральную нервную систему от остальной части личинки на разрыв тканей с щипцами. Будьте осторожны, чтобы не нарушить на центральную нервную систему.
    Критический шаг: Не тащить на центральную нервную систему! Откажитесь поврежденные образцы с разорванной брюшной нервной (рис. 2А) или искаженных оптических долях (рис. 2В и 2В ").
  9. Повторите эти два шага для всех личинок на покровное. Перенести здоровый эксплантированной ткани, чтобыВторой (чистый) бассейн среды на покровное для тонкой стадии вскрытия.
  10. Используйте вскрытие контактов инструменты, чтобы убрать периферических тканей (например, глазные, крыло, и ног дисков) от мозга. Вставьте скальпель между хотел (мозга) и нежелательного ткани, прижав соединительной ткани в покровного стекла. Используйте крюк, чтобы мягко дразнить от нежелательного ткани, одновременно нажав скальпель, чтобы покровное древесными как движений.
  11. Критический шаг: Работа медленно и сознательно, чтобы извлечь все диски из каждого мозга. Будьте осторожны, чтобы не нарушить морфологию мозга. Здоровый мозг будет иметь неповрежденный брюшной нервной и симметрично, круглые оптические доли (рис. 2в).

3. Монтаж эксплантированных Мозги для живых изображений

  1. Переверните 50 мм газопроницаемую культуры блюдо с прозрачной пленкой вверх (рис. 2, г). Нажмите шприц для нанесения небольшую каплю (около 30 мкл) среды на тон центр блюда.
  2. Перенесите отдельные мозги, по одному за раз, к падению среды на блюдо. Используйте инструмент крюк, чтобы зачерпнуть мозг под зрительных долях. Также можно использовать щипцы понять аксоны выступающие из брюшной нервной мозга.
  3. Соберите 5-10 мозги в капле среды. Submerge мозги с помощью вскрытие выводов инструментов толкать отдельные мозги, чтобы в нижней части капли среде, как многие из них будут в ловушке у мениска (рис. 2Е).
  4. Расположите мозги с помощью вскрытие контактов инструменты для выравнивания мозги в зависимости от NBs для включения в образ (рис. 3А). Для изображения спинной НБС, разместить брюшной нервной вниз (вдоль мембраны). Чтобы изображение на anterio-вентральной НБС, разместить мозги с брюшной нервной стороной вверх (по направлению от мембраны). Совместите мозги так, чтобы все брюшные нервные стволы указывают в том же направлении в плоскости ху.
  5. С помощью шприца или пластиковую передачи рipette разместить 4 галоидуглерода (HC) капель масла (около 30 мкл каждый) на мембрану газа. Объем каждой капли масла должны быть эквивалентны друг другу и каплю среды. Космические капель масла, чтобы соответствовать четырем углам покровным центром вокруг капли культивирования среды. После завершения пять капель (четыре капли масла и одну каплю среды в центре) будет напоминать пять граней на западном стиле кости (рис. 3В).
  6. Опустите # 1.5 22 мм покровное на сборке, так что она попадает все 5 капель в то же время. Поддержание равномерное давление по всей образцов снижает вероятность, что они будут нарушены. Подождите около 3 мин, как масло и среднего разгона под весом покровного стекла. Кросс-образную форму носителя будет образовывать (цифры 3С и 3D).
  7. Критический шаг: Опустите покровное на поверхность мозга путем удаления избытка СМИ использовании тонкой бумаги фитиль (FIGUповторно 3C). Сделайте это во время просмотра образца под рассекает сферу. Как СМИ удаляется, покровное снизит. Стоп раз покровное касается мозги. Не более-фитиль, так как это вызовет искажения ткани или мозга взрывы.
  8. Если изображения спинной NBS (Рисунок 3E), переходите к шагу 3.9. Если визуализации anterio-вентральной НБС, покровное должны быть немного смещены (осторожно подталкивая его пинцетом) в направлении вентральной советы нерва мозга. Это заставляет мозг вращаться, который приносит долей головного мозга в непосредственном контакте с покровным для облегчения визуализации (рис. 3F).
  9. Уплотнение камеры на окружающий покровное с небольшими количествами фторо-углеродное масло (рис. 3D). Излишки масла сочилась из покровного стекла должны быть сведены к минимуму и смыл прочь с ткани.

4. Живая съемка Central Brain нейробласты

Примечание: Для этой работы, Nikon Eclipse Ti прядильно-дискконфокальной микроскопии (Инвертированный микроскоп) был использован для живого изображения; Подробная информация о нашей установке были ранее опубликованы 31. Кроме того, образец может быть отображены с помощью вертикально системы.

  1. Добавить каплю иммерсионного масла для покровного стекла чуть выше установленных мозгов. Это поможет центру цели непосредственно над образцом.
  2. Критический шаг: Поддержание мозги при постоянной температуре 25 ° С с этапа инкубатора. Аккуратно поместите установленный образец в стадии инкубатора и самого камеру вместе с крышкой.
  3. Найдите центральные NBs мозга с помощью проходящего света, сосредоточив внимание на крупных, круглых клеток, которые находятся в центральных и медиальных областях зрительных долей, не используйте эпи-флуоресценции. Это становится легче с практикой. Это очень важно подвергнуть образец с наименьшим количеством света, насколько это возможно. Не тратьте мозги визуализации времени, которые были повреждены.
  4. Как только на месте, принимать быстрые воздействия с помощью конфокальной копределить правильное место и глубину. Ограничьте глубину до первого 10-15 мкм. Отрегулируйте при необходимости, и взять другой тестового изображения.
    1. Необязательный шаг: Соберите тестовый фильм брюшной нервной обеспечить нет ху дрейф. Если дрейф обнаруживается, подождите 15-30 минут для образца, чтобы обосноваться. Если дрейф не оседает в 30 мин, подготовить новый образец. Основные дрейф обычно можно проследить до того избытка нефти, или неравное размер капель масла в процессе монтажа.
  5. Для устранения осевого дрейф (г-дрейф) использовать непрерывную автоматическую фокусировку устройство, которое использует инфракрасный светодиод. Кроме того, вручную исправить в фокальной плоскости.
  6. После того, как NB интерес идентифицируется, продолжить режим визуализации. Как и во всех живых клеток изображений, количество лазерного света, время экспозиции, камеры биннинга, объективного увеличения, времени и / или г-ступенчатой ​​интервала все должны быть эмпирически оптимизированы для конкретного эксперимента, чтобы ответить на вопрос, под рукой. Цель состоит в том, чтобы свести к минимуму световое плотинувозраст, все еще собирая полезные данные. См. обсуждение для дополнительных указаний.
    1. Изображение весь объем НБ путем сбора 12-14 фотографий расположенные на 1 мкм оси. Настройте разрешение времени, чтобы захватить один или несколько циклов клеточные одного и того же NB. В качестве общей рекомендации, использовать 10-30 сек интервалы для одного изображения клеточного цикла и 1-3 минутные интервалы для нескольких клеточных циклов.
  7. Критический шаг: Убедитесь, что образец является здоровым путем мониторинга продолжительность митоза. Если митоза занимает более 15 минут, перейти на другой мозг. Здоровый мозг покажет много NBs в том же поле зрения проходит несколько раундов митоза. Заметим, что каждый клеточный цикл немного длиннее, чем предыдущий из-за легкого повреждения.
  8. После того, как изображения завершена, разбирать инкубационный камеру, и отбросить все, кроме газопроницаемыми культивирования блюд. Промыть поверхность культуральной чашке с 95%-ным этанолом и хорошо протереть ткани. Повторите еще два раза.

    5. Подготовка Мозги для иммунофлуоресценции

    1. Сбор 20 или более эксплантированной мозги в 1,5 мл пробирку, содержащую приблизительно 0,2 мл дополненной среде.
    2. Удаление среды из трубки и промыть мозги раз с 0,5 мл PBSTx (забуференный фосфатом физиологический раствор, ЗФР с 0,3% тритона Х-100). Пусть мозги оседают на дне пробирки между всеми обмена жидкости. Triton X-100 моющее средство используется для проницаемыми ткани. Промывка обычно занимает менее 30 сек; просто удалите PBSTx раз мозги, собралась на дне пробирки.
    3. Замените решение с 0,5 мл 9% электронной микроскопии класса параформальдегиде разведенного в PBSTx. Инкубировать с нутации в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Утилизировать фиксатором в соответствии с правилами опасных отходов.
    5. Промыть образцов с 0,5 мл PBSTx течение 15 мин. Повторите шаг мыть пресной PBSTx еще два раза.
    6. Заменить раствор с 0,5 мл PBT (PBS, 1% Бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,1% Твин-20). Инкубировать с нутации в течение 1 часа при комнатной температуре. Этот шаг блоки неспецифического связывания антител к ткани.
    7. Заменить раствор с 0,5 мл первичным антителом, разведенным в PBT с добавлением 4% нормальной козьей сывороткой (NGS). Выдержите с нутации в течение ночи при 4 ° С.
    8. Выбросьте или сохранить разбавленный первичного антитела.
    9. Промыть образцов с 0,5 мл PBT течение 15 мин. Повторите шаг мыть пресной PBT еще два раза.
    10. Заменить раствор 0,5 мл модифицированной PBT (PBS, 2% BSA, 0,1% Твин-20 и 4% NGS). Инкубировать с нутации в течение 1 часа при комнатной температуре.
    11. Заменить раствор с 0,5 мл вторичного антитела, разбавленного в модифицированной PBT. Инкубировать с нутации в течение 2 часов при комнатной температуре.
    12. Заменить раствор 0,5 мл PBST (PBS с 0,1% твина-20). Инкубировать с нутации в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторите шаг мыть пресной ЗФРТ еще два раза.

    1. Тщательно передачи образцов в виде капли на предметное стекло, ограничивая падение в направлении слева от центра слайда.
    2. Добавить большого перепада (около 2 см в диаметре) из монтажной среды (например, Aqua-Poly/Mount) к центру слайда. Избегайте пул PBST, которое влево.
    3. Используйте пинцет для передачи мозги из пула PBST в пул монтажной среды. Добавление монтажную среду непосредственно сверху мозга может нарушить их ориентацию и его следует избегать.
    4. Под световым микроскопом, организовать образцов в монтажную среду с той стороны, которая будет изображена вверх.
    5. С ползуна под световым микроскопом, медленно опускают # 1,5 покровным стеклом поверх образцов. Необязательный шаг: Выбить незначительные пузырьки воздуха, слегка нажав на покровное.
    6. Разрешить гистологическая среда для полимеризации в течение нескольких часов, или на ночь, лежа слайды плоские, светло-защищены, при комнатной температуре.
    7. Слайды могут быть отображены на следующий день, или храниться до визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Онлайн визуализация выяснены ряд механизмов, которые регулируют NB ACD. До захвата изображений, необходимо определить оптимальные условия визуализации. Необходимо сбалансировать скорость захвата кадров с продолжительностью изображений живых клеток. Для тонкой клеточной анализа, например, увеличение временного и может потребоваться оптическое разрешение. При визуализации единого NB клеточный цикл (рис. 4А), скорость, с которой изображения будут захвачены может быть увеличена без введения фотоповреждения. Как правило, единичные события деления клеток могут контролироваться примерно в 10-30 временных интервалов с. Один способ увеличить временное разрешение, не повреждая ткани является модулировать частоту получения изображений. Например, покадровой обработки изображений может быть инициирована по более низкой частотой кадров, которая затем увеличилась на наблюдении интересной особенностью или момент времени (Movie 1).

Визуализации последовательных раундов деления клеток ( (рис. 4б). Как правило, мы несколько изображений (два или более) раунды ACD по всему объему NB клеток в 1-3 минутные интервалы в течение периода 2-3 часов. Как временное разрешение и период сбора формирования изображения может быть улучшена за счет ограничения количества света, который попадает на образец. Например, покадровой визуализации последовательных делений NB может быть продлен свыше 8 часов, если только один оптический самолет изображается. Подборка особенно полезных трансгенных линий для изучения NB ACD котируются (табл. 1) 16, 31, 34-38.

Для анализа большого количества образцов, часто бывает необходимо проанализировать фиксированные NBs. Наш протокол фиксации сохраняет общую морфологию НБС и совместим с иммунофлюоресценции анализов (Цифры 4C-4E). Всего смонтировать фиксированной Braiнс может быть отображена при малом увеличении (рис. 4С) для визуализации общий размер и форму мозга или для обнаружения NBs. Для визуализации NBs или их потомства GMCs более подробно, большем увеличении должны быть использованы. При умеренной увеличении (рис. 4D), целые кластеры NB Lineage можно наблюдать. Для получения более подробной сотовой анализа, большем увеличении используется (рис. 4д).

Рисунок 1
Рисунок 1. Культивирующий в искусственной среде целые мозги для живых клеток изображений НБ ACD. А) Личиночная Центральная нервная система состоит из двух оптических долях и брюшной нервной цепочки. Два подтипа NBs заполнить зрительный доли в стереотипных позиций:. Тип I (темно-синий) и тип II (светло-голубой) B) NBs пройти ACD. С каждым делением клетки,NB расщепляет, чтобы дать начало одной GMC (или ИЯФ, не показан) и регенерирует NB стволовую клетку. ГМО будут делить, чтобы дать начало двум нейронов (или глии, не показаны). C) Два инструмента микродиссекция собраны, вставив рассекает флажки в держатели контактов. Изгиб флажки создает уникальные инструменты, скальпель и крючок, которые используются, чтобы разорвать, пронзает и вытеснить нежелательные ткани, не повреждая основной мозг. D) Мозги эксплантированных в один из двух пулов рассекающих СМИ (синие кружки). Один бассейн среды используется для удаления на центральную нервную систему от личинок (валовой рассечение), а другой пул используется для тонкой микродиссекции периферических тканях из эксплантированных мозги (в порядке рассечение).

Рисунок 2
Рисунок 2. СохраAtion морфологии мозга во время микродиссекции. Поспешные рассечение мозга может вызвать серьезные повреждения тканей, что включает: (а) порванные брюшной нервной шнуры или (б) искаженные оптические доли. Еще более тонкие повреждение тканей (В ') следует избегать изображений живых клеток. (C) Пример здорового образца ткани, пригодной для живого изображения. D) оптически прозрачным, газ мембрана. E) набор из нескольких здоровых мозга расположены в среду культивирования на газопроницаемой блюдо. Эти мозг готов к установке для микроскопии. Шкала бар: (AC), 100 мкм; (D), 25 мм; (E) 1 мм.

Рисунок 3
Рисунок 3. Монтаж мозги для визуализации живых клеток. А) Мозгвыровнены с рядами в капле среды для культивирования хранении в центре тарелки. б) падение среде окружен капель масла HC приблизительно равным объемом. Четыре капли ХК нефти и центральной капле среды напоминают пять грани играли в кости. После покровное опускают на капли масла, (C) фитиль изделия из Kimwipe ткани и используется, чтобы впитать лишнюю жидкость. D) внешний край покровного стекла окружен тонким слоем масла, чтобы остановить испарение из культуральной среды. Эти мозги готовы к микроскопии. E и F) ориентация мозга по сравнению с покровным определяет, какие нейробласты доступны для изображений живых клеток. E) спинного нейробласты изображаются путем организации мозги с брюшной стороны, касаясь мембрану газа . F) Передняя-брюшные нейробласты может быть отображены на обрanging мозги с спинной стороны касаясь мембрану газа, а затем подталкивая покровное, и основной ткани, в направлении вентральной советы нерва мозга. Это движение немного наклоняет оптические лепестки так, что anterio-спинной поверхности контактов покровное, в результате чего желаемых ось изображений в идеального выравнивания (зеленая линия).

Рисунок 4
Рисунок 4. Представитель результаты от живого изображения разделительных нейробластах. А и В) Живая съемка NB стволовых клеток подразделения в целом препаратов монтирования с использованием 40X, 1.3 NA масло-погружения цели. Время отображается в виде мин: сек относительно начала покадровой) Кадры из покадровой визуализации одного клеточного цикла от NB выражающей GFP-Moesin.(GFP-Мо). Скорость захвата изображений из одного клеточного цикла может быть увеличена до повышения временное разрешение, не вызывая фотоповреждения. Б) Кадры из покадровой съемки последовательных циклов деления клеток от NB выражающей как GFP-Мо и GFP-меченых центросом маркер. Длительный период связан с несколькими клеточных циклов требует пониженную временное разрешение, чтобы избежать фотоповреждения. Обратите внимание, что промежуток времени между каждым делением клетки увеличивается в ходе визуализации. CE) Конфокальные проекции неподвижных стволовых клеток из целых монтирования препаратов. C)) для изображений всех NBs, расположенных по обеим оптических долях, используется 20-кратным увеличением. Этот анализ особенно полезен для изучения общей морфологии мозга и количественно номера NB (голубой), и т.д.. D) Большинство NBS (розовый) из одного зрительного доли могут быть визуализированы с 40-кратном увеличении. Микротрубочки, (зеленый). Е)

Фильм 1. Живая съемка одного NB клеточного цикла. Замедленной образы одной дивизии NB клеток из мозга, выражающей GFP-Moe для обозначения клеток коры головного мозга. Изображения были получены с одного оптической плоскости при 40-кратном увеличении. В этом фильме, кадры были захвачены каждые 15 сек. Примерно через 7 мин приобретения, ставка была увеличена до одного кадра каждые 5 секунд. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Фильм 2. Живая съемка последовательных раундов ое NB ACD. покадровой образы NB, проходящие три раунда деления клеток в головном мозге, выражающей GFP-Мо и GFP-меченых центросом маркер. Изображения были получены на 2 временных мин с интервалом в 60X увеличением. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм.

Линия Маркированный Сотовая структура Флуорофора Выражение / Промоутер Цитата
YFP-Asterless Центриоль YFP Убиквитин Rebollo и соавт. (2007) Dev. Сотовый 12:. 467.
SAS6-mCherry Центриоль mCherry Эндогенный Русан и Пайфер (2007) Дж. Cell Biol. 177
GFP-SAS6 Центриоль GFP Эндогенный (BAC) Lerit и Русан (2013) Дж. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-ПАКТ Центриоль GFP Убиквитин Мартинес-Кампос, и др.. Дж. Cell Biol 165:. 673.
GFP-SAS4 Центросома GFP Убиквитин Дикс и Рафф (2007) Керр. Biol 17:. 1759.
GFP-Поло Центросома GFP Эндогенный . Моутинью-Сантос, и др. (1999) Biol сотовый 91:. 585.
GFP-γ-тубулина 23C Центросома GFP Убиквитин Lerit и Русан (2013) Дж. Cell Biol 202:. 1013.
GFP-Centrosoмин Центросома GFP UAS Megraw и соавт. (2002) J. Сотовые Sci 115:. 4707.
GFP-SPD-2 Центросома GFP Убиквитин Дикс и Рафф (2007) Керр. Biol 17:. 1759.
mCherry-α-тубулина Микротрубочки mCherry Убиквитин Русан и Пайфер (2007) Дж. Cell Biol 177:. 13.
GFP-α-тубулина Микротрубочки GFP Убиквитин . Rebollo, и др. (2004) PLoS Biol 2:. E8.
Юпитер-GFP ("G147") Микротрубочки GFP Эндогенный Морин, и др. (2001) PNAS 98:.. 15050.
mCherry-Юпитер Микротрубочекс mCherry UAS Cabernard и Доу (2009) Дев. Сотовый 17: 134.
H2AvD-MRFP ДНК MRFP Эндогенный Пандей и др.. (2005) Дж. Сотовые Sci 118:. 733.
H2AvD-GFP ДНК GFP Эндогенный Кларксон и Санкт (1999) ДНК Cell Biol 18:. 457.
Moesin-GFP Кортикальная актина GFP Спагетти сквош Kiehart и соавт. (2000) J. Cell Biol 149:. 471.

Таблица 1. Выбор полезных трансгенных линий для изучения ACD. Эти слитые конструкции особенно полезны для изучения деление клеток. Они обычно используются в NB исследований живого изображения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Изображений живых клеток является бесценным подход, используемый для изучения механизмов, которые регулируют ACD стволовых клеток, дифференцировку клеточных клонов, и морфогенез сложных тканей. Хотя исследовательские группы исторически использовали различные методы, чтобы визуализировать NB ACD, эти подходы в целом можно разделить на две категории, которые, прежде всего, отличаются по отношению к ткани мозга остается ли нетронутыми или в отрыве.

Изображений в отрыве NBs есть свои плюсы. С одной стороны, диссоциируют NBs легче изображение, потому что они особенно легко определить в качестве крупнейших (около 12 мкм в диаметре) клеток в культуральной чашке. Кроме того, почти все стволовые клетки, которые культивировали на поверхности стекла будут одинаково близко к объектива микроскопа в течение всего периода получения изображения. Оптическое качество покадровой изображений дополнительно улучшена с использованием либо поли-L-лизин или фибриногена стекла с покрытием индуцировать РЭМя-уплощение круглого NBs 16, 17. Еще одно преимущество для визуализации диссоциированные NBs выращенные в культуре является легкость, с которой можно обменять культивирование среднего. Как только клетки прилипают к поверхности стекла с покрытием, культивирование среды, содержащей любое количество фармакологических агонистов, антагонистов или антител immunoblocking и др. могут быть добавлены или удалены. Наконец, недавние подходы визуализировать диссоциированные NBs показали, что этот метод является, по сути, поддаются длительной получения изображений 18, 19.

Тем не менее, недостатки изображений в отрыве NBs включают сложность протокола. Большинство методов подробно длительным (30-60 мин) химическое разложение, а затем долгое стадии инкубации (60 мин), чтобы позволить рассеянные клетки урегулировать и придерживаться культивирования блюдо 17, 19.

В противоположность этому, визуализации NBs от интактным мозгом сохраняет какфизиологический контекст и морфология ткани. Преимущества такого подхода включают возможность выявления конкретных NB клоны, которые развиваются в стереотипных соглашений или через определенные развития времен 1. Таким образом, наша упрощенная протокол имеет утилиту, которая выходит за рамки исследований ACD, поскольку она также позволяет для живой расследования дифференцировки и морфогенеза событий. Одним из недостатков этого метода, однако, является невозможность обмена культивирование среды. Таким образом, исследователи, заинтересованные в долгосрочном визуализации последовательных делений стволовых клеток должны рассмотреть подход (в отрыве первичной культуре по сравнению с целой горе), что наилучшим образом соответствует их применение. Кроме того, необходимость культивирования добавок, таких как инсулин или сыворотке, должен быть определен эмпирически на основании условий обработки изображений (продолжительность визуализации, количество света, попадающее на образец, и т.д..) И экспериментальной установки.

В общем, мы рекомендуем пользоваться отделитьг NBs для исследований, где это необходимо для оценки острой реакции NBs к внедрению малых молекул (например, ингибиторы и т.д.)., для высокой пропускной приложений, когда штраф микродиссекции мозгов может быть слишком громоздким, и для продвинутых визуальных исследований которые требуют NB быть в физическом контакте с покровным. В отличие от этого, мы рекомендуем пользоваться неповрежденные мозги для приложений, где это полезно изображение несколько NBs из того же мозга, и особенно для исследований, которые касаются межклеточных взаимодействий, автономия, клональный анализ, изменения формы клеток, а также другие исследования, где родной среда клеток имеет важное значение.

Для обеспечения успешной подготовки неповрежденных мозгов для живого изображения, несколько важных шагов должны быть тщательно выполнены. Прежде всего, необходимо, чтобы не подвергать ткани к ненужной травмы. В частности, культивирующий в искусственной среде мозг и удаления периферических тканей должны быть выполнены с осторожностью. Одинследует свести к минимуму непосредственный контакт между рассекающих инструментов и мозга. Кроме того, следует избегать дергая или потянув ткани, прикрепленной к мозгу. Неправильное обращение ткани легко привести в рваных или искаженных мозгов. В наших руках, NBs из поврежденных мозгов редко разделить. Лица, которые являются новыми для личинок вскрытия головного мозга часто выгоду от освоения рассечение, прежде чем пытаться подготовить образцы для живого изображения.

Другим важным шагом в протоколе является монтаж мозгах предыдущих жить визуализации клеток. Правильные объемы как среда для культивирования и ХК масла необходимы для завершения полезный препарат. Хотя трудно точно измерить вязкое масло HC с пипеткой, можно аппроксимировать правильного объема (около 30 мкл) на глаз. Слишком много жидкости предотвращает покровное поселиться на место. Часто это приводит к мозгу, движущихся на поверхности культуральной чашке. Во время живого изображения, нерешенным покровное получены данныевмятина, когда сугробы ткани или зрительный ролл доли. Образцы, которые не расположены в месте его следует избегать. Напротив, добавление слишком мало культивирования средний или HC нефти результаты в катастрофического повреждения тканей, в том числе взрыв оптических долей. Существует осторожный баланс между использованием достаточно жидкую среду и масло для обработки вес покровного стекла по сравнению с использованием слишком много жидкости, что приводит к покровное скользить. Этот баланс лучше узнали на практике. В общем, лучше только изображения эти мозги, которые имеют здоровую морфологию, например, неповрежденной брюшной нервной и симметричные, круглых оптических долях.

После того, как образец монтируется без заметного дрейфа, выдержки образца в живых станет следующим важным аспектом этого протокола. Это лучше всего достигается путем поддержания надлежащей температуры и, самое главное, сводя к минимуму количество света, которое попадает на образец. Установка микроскоп и образец являются две переменные, которые будут регулировать успех лив изображений клеток. Высокие цели в области качества, фильтры (~ передачи 98%), и камеры (обратно-поредели электронов умножения и КМОП) на стороне эмиссии позволит свести количество света, которое попадает на образец на стороне возбуждения. Известно, что синий свет (используется для изображения GFP) высоко токсичен для клеток. Нужно определить, сколько всего света (всего время экспозиции) данный образец может терпеть, а затем распространилась, что общее время вдоль продолжительности эксперимента. Например, если образец может только терпеть 500 лазерного света воздействия на основе конкретной установки микроскопа, то можно было бы собирать 50 х 10-ломтик стеки. Эти стеки можно растянуты на 1 мин, чтобы собрать один NB клеточный цикл, или 2-3 мин, чтобы собрать ~ 3 цикла клеток. Кроме того, оптимизация настроек для каждого генотипа является критическим для успешного живого изображения. В период оптимизации, является хорошей отправной точкой для 488 нм Мощность лазера составляет 25-50 мкВт исходящие от 100X, 1.4 NA &# 160; масло погружения цель. Наконец, необходимо определить, что состояние изображения будет правильно ответить на вопрос под рукой, так как это не всегда так, что наиболее сложные изображений требуется.

Для экспериментов с прямом эфире или фиксированной ткани, мозг может быть установлен таким образом, чтобы изображения конкретных NB линий. Например, для того, чтобы Тип изображения II НБС, которые стереотипно проживают в задне-медиальной области зрительного доли 7, можно было бы установить мозги, как показано на рисунке 3Е. Потому что пространственная и временная структура центральных NBs мозга были хорошо документированы 1, можно использовать наш протокол к изображению разнообразные конкретные кластеров NB то время как использование любого количества широко распространенных трансгенных конструкций, которые выражаются в вездесущий или, в идеале, эндогенных промоутеров (табл. 1). Тем не менее, Lineage конкретных маркировки технологии 20 остаются полезными для ряда приложений.С фиксированной анализа, мозги с незначительным повреждением, как правило, приемлемо. Кроме этого, полное удаление периферических тканей не может быть отложено до непосредственно перед вложением мозги по монтажу среду. Исследования с фиксированной ткани особенно полезны, когда большое количество NBs должны быть отображены.

В заключение исследования NB ACD имеют большую пользу от использования как живых клеток изображений и подробным фиксированной анализа. Протокол изложил здесь подробности один подход для подготовки личинок дрозофилы для прямом эфире или стационарного применения. Мы ожидаем продолжение исследование NB ACD через детальных исследований изображений покажет новый и интересные результаты, которые будут способствовать пониманию стволовых клеток в развитии и болезней. Применение долгосрочного живого изображения интактных личинок мозгов имеет потенциал, чтобы раскрыть новые проницательности в временной последовательности дифференцировки и морфогенеза событий, которые регулируют развитие (и вырождениярации) центральной нервной системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана разделения очной исследований в Национальных Институтах Здоровья / NHLBI (1ZIAHL006126) и Lenfant биомедицинской докторантуру, присужденных DAL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lumox tissue culture dish 50 x 12 mm Sarstedt 94.6077.410 A reusable culture dish with a gas-permeable and optically clear film base.
Schneider's S2 Medium Invitrogen 21720-024
Gibco Antibiotic-Antimycotic (100x) Invitrogen 15240-062 A supplement containing penicillin (10,000 U/ml), streptomycin (10,000 μg/ml), and amphotericin B (25 μg/ml) that is added to Schneider's S2 media to prevent bacterial and fungal contamination. 
Glass coverslips, #1.5 22 x 22 mm Fisher Scientific 12-541-B
Halocarbon oil 700 Sigma-Aldrich H8898 A high viscosity inert oil that is clear and colorless.
Pair of nickel-plated pin holders, 17 cm long Fine Science Tools 26018-17
Pair of Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Dissecting needle/probe with plastic handle Fisher Scientific 08-965-A
Syringe filter, 0.22 μm pore size Fisher Scientific 09-719A
Syringe, 5 ml BD Biosciences 309646
Plastic transfer pipette Fisher Scientific S30467-1
Paraformaldehyde, 32% EM-grade Electron Microscopy Sciences 15714 CAUTION: Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood. Follow MSDS guidelines for safe handling.
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) Invitrogen D1306 A dye that labels DNA and is excited by UV light.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Truman, J. W., Bate, M. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Developmental Biology. 125, 145-157 (1988).
  2. Doe, C. Q. Molecular markers for identified neuroblasts and ganglion mother cells in the Drosophila central nervous system. Development. 116, 855-863 (1992).
  3. Lerit, D. A., Smyth, J. T., Rusan, N. M. Organelle asymmetry for proper fitness, function, and fate. Chromosome research. 21, 271-286 (2013).
  4. Bello, B. C., Izergina, N., Caussinus, E., Reichert, H. Amplification of neural stem cell proliferation by intermediate progenitor cells in Drosophila brain development. Neural development. 3, 5 (2008).
  5. Bowman, S. K., et al. The tumor suppressors Brat and Numb regulate transit-amplifying neuroblast lineages in Drosophila. Developmental Cell. 14, 535-546 (2008).
  6. Boone, J. Q., Doe, C. Q. Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells. Dev Neurobiol. 68, 1185-1195 (2008).
  7. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
  8. Savoian, M. S., Rieder, C. L. Mitosis in primary cultures of Drosophila melanogaster larval neuroblasts. Journal of Cell Science. 115, 3061-3072 (2002).
  9. Fleming, S. L., Rieder, C. L. Flattening Drosophila cells for high-resolution light microscopic studies of mitosis in vitro. Cell Motil Cytoskeleton. 56, 141-146 (2003).
  10. Buffin, E., Lefebvre, C., Huang, J., Gagou, M. E., Karess, R. E. Recruitment of Mad2 to the kinetochore requires the Rod/Zw10 complex. Current biology. 15, 856-861 (2005).
  11. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125, 1375-1386 (2006).
  12. Lucas, E. P., Raff, J. W. Maintaining the proper connection between the centrioles and the pericentriolar matrix requires Drosophila centrosomin. J. Cell Biol. 178, 725-732 (2007).
  13. Basto, R., et al. Centrosome amplification can initiate tumorigenesis in flies. Cell. 133, 1032-1042 (2008).
  14. Conduit, P. T., Raff, J. W. Cnn dynamics drive centrosome size asymmetry to ensure daughter centriole retention in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 20, 2187-2192 (2010).
  15. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome research. 6, 533-549 (1998).
  16. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing Drosophila neural stem cells. Dev. Cell. 12, 467-474 (2007).
  17. Januschke, J., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Drosophila neuroblasts retain the daughter centrosome. Nat. Commun. 2, 243 (2011).
  18. Januschke, J., et al. Centrobin controls mother-daughter centriole asymmetry in Drosophila neuroblasts. Nat Cell Biol. 15, 241-248 (2013).
  19. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-Term Live Cell Imaging and Automated 4D Analysis of Drosophila Neuroblast Lineages. PLoS One. 8, (2013).
  20. Neumuller, R. A., et al. Genome-wide analysis of self-renewal in Drosophila neural stem cells by transgenic RNAi. Cell Stem Cell. 8, 580-593 (2011).
  21. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  22. Siegrist, S. E., Doe, C. Q. Extrinsic cues orient the cell division axis in Drosophila embryonic neuroblasts. Development. 133, 529-536 (2006).
  23. Broadus, J., Doe, C. Q. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. Curr. Biol. 7, 827-835 (1997).
  24. Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular biology of the cell. 16, 5127-5140 (2005).
  25. Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
  26. Siller, K. H., Doe, C. Q. Lis1/dynactin regulates metaphase spindle orientation in Drosophila neuroblasts. Developmental Biology. 319, 1-9 (2008).
  27. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Dev. Cell. 17, 134-141 (2009).
  28. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. J. Cell Biol. 188, 693-706 (2010).
  29. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013, 970-977 (2013).
  30. Rusan, N. M., Akong, K., Peifer, M. Putting the model to the test: are APC proteins essential for neuronal polarity, axon outgrowth, and axon targeting. J. Cell Biol. 183, 203-212 (2008).
  31. Lerit, D. A., Rusan, N. M. PLP inhibits the activity of interphase centrosomes to ensure their proper segregation in stem cells. J. Cell Biol. 202, 1013-1022 (2013).
  32. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  33. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  34. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. J. Cell Biol. 177, 13-20 (2007).
  35. Martinez-Campos, M., Basto, R., Baker, J., Kernan, M., Raff, J. W. The Drosophila pericentrin-like protein is essential for cilia/flagella function, but appears to be dispensable for mitosis. J. Cell Biol. 165, 673-683 (2004).
  36. Dix, C. I., Raff, J. W. Drosophila Spd-2 recruits PCM to the sperm centriole, but is dispensable for centriole duplication. Curr. Biol. 17, 1759-1764 (2007).
  37. Moutinho-Santos, T., Sampaio, P., Amorim, I., Costa, M., Sunkel, C. E. In vivo localisation of the mitotic POLO kinase shows a highly dynamic association with the mitotic apparatus during early embryogenesis in Drosophila. Biol. Cell. 91, 585-596 (1999).
  38. Megraw, T. L., Kilaru, S., Turner, F. R., Kaufman, T. C. The centrosome is a dynamic structure that ejects PCM flares. J. Cell Sci. 115, 4707-4718 (2002).
Живая съемка<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Личиночные нейробласты
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).More

Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts. J. Vis. Exp. (89), e51756, doi:10.3791/51756 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter