Abstract
Celle-celle adhæsion er grundlæggende for flercellede liv og er medieret af en bred vifte af celleoverfladeproteiner. Imidlertid er de adhæsive vekselvirkninger af mange af disse proteiner dårligt forstået. Her præsenteres en simpel, hurtig fremgangsmåde til karakterisering klæbeevne formodede homofil celleadhæsionsmolekyler. Dyrkede HEK293-celler transficeret med DNA-plasmid, der koder et udskilt, epitop-tagget ektodomænet af et celleoverfladeprotein. Brug af funktionaliserede perler specifikke for epitop-tag, er opløselige, udskilte fusionsprotein fanget fra dyrkningsmediet. De coatede perler kan derefter anvendes direkte i perle aggregation assays eller fluorescerende vulst sortering assays til at teste for homofil adhæsion. Hvis det ønskes, kan mutagenese derefter anvendes til at belyse de specifikke aminosyrer eller domæner er nødvendige for adhæsion. Dette assay kræver kun små mængder af udtrykt protein, ikke kræver produktion af stabile cellelinier, og kan ACCOmplished i 4 dage.
Introduction
Celle-celle adhæsion er afgørende for udviklingen og integriteten af flercellede organismer og er medieret af en bred vifte af celleoverflademolekyler. Mange af disse adhæsionsmolekyler er blevet identificeret og karakteriseret, selvom mange mangler at blive opdaget. Flere metoder anvendes til at undersøge egenskaberne af celleadhæsionsmolekyler (CAMs), herunder celle sortering assays, celleaggregering assays 1-8 og biofysiske metoder, såsom atomic force mikroskopi og overflade kraft spektroskopi 9-12.
Kompleksiteten af selv forenklet in vitro systemer, der anvender cellelinjer gør det vanskeligt at fastslå de klæbende egenskaber af et formodet CAM. Typisk er et molekyle, som en CAM, hvis det inducerer celleaggregering når det transficeres ind i en ikke-klæbende cellelinie. Det er imidlertid klart, at dette ikke er direkte bevis for adhæsiv aktivitet. For eksempel, lette leveringen celleoverfladen eller stabiliteten af enCAM vil også resultere i øget celleaggregering 1,13. Desuden kan en sand CAM undlader at mediere celleaggregering hvis cellelinien mangler andre co-faktorer, der kræves for celle overflade levering eller stabilisering.
For at undgå disse komplicerende faktorer, mere direkte assays kan anvendes som er baseret på den idé, at adhæsive interaktioner bør være en iboende biokemisk egenskab af det ekstracellulære domæne. Mens perler oprindeligt blev brugt til at karakterisere Ng-CAM 2 har disse analyser blevet udvidet med henblik på at undersøge cadherin-medieret adhæsion 12,14,15. Brug fusion af C-cadherin ectodomæne-Fc fusioner, den Gumbiner laboratoriet viste, at flere cadherin gentagelser bidrager til homofil interaktioner 14. Brug sammenlignelige perle sammenlægning assays, E-cadherin og N-cadherin vedhæftning er også blevet karakteriseret 12,15, som har en række protocadherins 1,15-18 og Dscam isoformer fra Drosophila
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celle Forberedelse (dag -2 til 0)
- Split HEK293 celler 1: 5 ved hjælp af 0,05% trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes i vækstmedier ved 37 ° C med 5% CO 2, indtil 60-80% sammenflydende (2 - 3 dage). For hver betingelse, kultur-celler i 2 x 100 mm skåle.
2. celletransfektion (dag 1)
- Transficere HEK293-celler med plasmidet, der koder for Fc-fusion ved hjælp af et transfektionsreagens, såsom Lipofectamin. Alternative metoder, der resulterer i sammenlignelige transfektionseffektiviteter kan også anvendes.
- Retur transficerede celler til inkubatoren i 24 timer.
3. Cell Formering (Dag 2)
- Forvarm Vækst medier uden føtalt bovint serum (-FBS) til 37 ° C.
- Skyl retter 2x med 10 ml vækstmedie -FBS, og returnere retter til 37 ° C inkubator i 1 time.
- Skyl kulturer retter en gang mere med 10 ml vækstmedium -FBS, for i alt 3 vaske.
- INCUpyr de transficerede HEK293-celler ved 37 ° C i yderligere 48 timer uden FBS før indsamling af medier.
4. Bead Sammenlægning (dag 4)
- At indsamle medier fra dyrkningsskålene, overføre medier fra hvert par af retter til 50 ml koniske rør og slynger ved 500 xg i 5 min til pelletering cellerester.
- Filter medier fra 50 ml konisk rør i en centrifugal filter ved hjælp af en 30 ml sprøjte og 0,45 um sprøjtefilter.
- Spin centrifugefiltre ved 4.000 xg og 4 ° C, indtil mængden af koncentreret dyrkningsmedier er ca 500 pi (ca. 15 min). Gentag, indtil alle dyrkningsmedier er blevet tilsat, og koncentreret.
- Tilføj 1.5 pi Protein G magnetiske perler til 1 ml iskold bindingspuffer i et 1,5 ml mikrocentrifugerør for hver prøve, sted på en magnet og fjerne puffer. Tilføje Umiddelbart koncentrerede kulturmedier til protein G magnetiske perler.
- Roter rør ved 4 ° C i 2 timer.
- Place rør på en magnet og fjerne medier. Hurtigt vaske perler to gange med iskold 1 ml bindingspuffer og derefter resuspendere perlerne i 300 pi bindingspuffer.
- Split resuspenderet perler i 2 rør, 150 ul i hvert rør, og derefter tilføje 1,5 ul 200 mM CaCl2 eller 200 mM EDTA til "calcium" og "ingen calcium" betingelser hhv.
- Overfør 100 ul fra hver tilstand til en depression godt glide og indsamle mikrografier ved hjælp af en transmitteret lys mikroskop (figur 2). Saml billeder fra 5 synsfelter for hvert forsøg på hver ønskede tidspunkt.
5. Dataanalyse
- Brug ImageJ eller tilsvarende billede analyse software, åbne en af de fem billed datasæt ved hjælp af Import / billedsekvens ... fra File rullemenuen. Disse vil blive åbnet som en billedstak.
- I Billede / Egenskaber ... dialogen, ændre jegMage enheder til pixels og sæt Pixel Bredde og Pixel Højde til 1,0.
- Konverter billeder til binær hjælp Adjust / Threshold ... kommando i Billede rullemenuen. Indstil tærsklen omfatter pixel, der bidrager til perler eller perle aggregater, men at udelukke baggrund og små partikler. Anvend på alle billeder i stakken.
- I Indstil dialogboksen Målinger boksen kontrollere området og stack bokse.
- Kør Analyser Partikler ... i analyse-rullemenuen. Dette genererer en liste over kendte partikler, herunder deres størrelse (område), og det billede, som de blev identificeret.
- Gentag denne proces for hvilken eksperiment og eksperimentel tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel eksperiment er vist i figur 2, som viser calciumafhængig perle aggregering i ektodomænet af N-cadherin fusioneret til Fc (NcadEC-Fc). I mangel af calcium, perler udviser ringe eller ingen tendens til at aggregere og der er ingen stigning i den samlede størrelse med tiden (figur 1A, C). I nærvær af calcium, perler overtrukket med NcadEC-Fc viser robust aggregering med aggregatstørrelse stigende over tid (figur 1B, C). Dette forsøg blev gentaget tre gange, idet hver forekomst består af billeder fra fem ikke-overlappende områder. Den partikelstørrelse i pixelområde blev bestemt for hver samlet på de fem områder. Disse data blev udregnet for hver tid i hvert eksperiment. Dataene fra de tre eksperimenter blev et gennemsnit for at bestemme midler og standard målefejl på hvert tidspunkt (figur 2C).
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Anvendelse af secernerede, epitopmærkede ektodomæner i perle aggregation assays. (A) Skematisk viser opbygning af en typisk single-pass transmembrane celleadhæsionsmolekyle (øverst), som har en signalsekvens (S), et ektodomæne, et transmembrant domæne (T) og et intracellulært domæne (ICD). For at generere en udskilt form af ectodomænet, et segment, som mangler de transmembrane og intracellulære domæner fusioneret til Fc-regionen af humant IgG (nederst). (B), når det transficeres i dyrkede celler er ectomain-Fc-fusionsprotein udtrykkes og udskilles i dyrkningsmediet, hvor det kan blive fanget og oprenset på Protein A eller Protein G magnetiske perler. Protein A eller protein G er vist som sorte cirkler på perlerne. (C) Efter vask ektodomænet-Fc belagte magnetiske kugler lov til at aggregere, som en test af homofil adhæsive interaktioner.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Perle sammenlægning assay. (A) De klassiske cadheriner, såsom N-cadherin og E-cadherin, medierer calcium-afhængig, homofil adhæsion. I fravær af calcium (uden tilsat calcium og 2 mM EDTA), cadheriner undlader at mediere adhæsive interaktioner. Vist her er et billede af Protein G magnetiske perler overtrukket med ectodomænet zebrafisk N-cadherin fusioneret til Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc overtrukne kugler blev tilladt at aggregere i 1 time i nærvær af 2 mM CaCl 2. Homofil vedhæftning af N-cadherin ektodomæner fremgår dannelsen af store perle-aggregater. (C) som en semi-kvantitativ måling af friktion, kan måles størrelsen af aggregater. En metode til at opnå dette er at måle arealetsærskilte aggregater i transmitterede lys billeder. Den gennemsnitlige størrelse af den samlede areal kan plottes som en funktion af tiden, som vist her, eller forholdet mellem gennemsnitlig samlet område i nærvær eller fravær af calcium kan beregnes. Sammenlægning af NcadEC-FC belagte kugler i nærvær af calcium (lukkede cirkler), og i mangel af calcium (åbne cirkler) blev bestemt ved 15 minutters intervaller i løbet af 1 time. Klik her for at se en større version af dette figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celleadhæsion er et væsentligt element i flercellede liv og er medieret af en bred vifte af celleoverfladeproteiner. Af disse er de detaljerede klæbeevne forstod kun en relativt lille andel. Her har vi beskrevet en simpel, hurtig protokol til at undersøge homofil klæbende kapacitet af udskilte ektodomæner fusioneret til en bekvem epitopmærke. Denne fremgangsmåde har en række vigtige fordele. Først stabile cellelinjer ikke påkrævet 14,20, som tilstrækkelige mængder af proteinet kan genereres ved transient transfektion af 100 mm skåle. Dette tillader screening af et større antal konstruktioner - fx point eller deletionsmutanter - uden indsatsen og bekostning af skabe og opretholde et stort antal cellelinjer. For det andet er disse perle assays er direkte test af de biokemiske egenskaber af formodede adhæsionsmolekyler i en reduceret system. Derfor kan vedhæftning direkte tilskrives proteinetomfattet af undersøgelsen, snarere end de potentielle indirekte virkninger. For det tredje, for at undersøge virkningerne af eventuelle co-faktorer, celler kan cotransficeres med secernerede former af det formodede adhæsionsmolekyle og dens formodede co-faktor, hver med et særskilt epitopmærke. Desuden er fleksibel denne fremgangsmåde, da det kan tilpasses til anvendelse med en række af passende epitopmærker. For eksempel findes der er konjugeret til protein A eller G (Fc tag) ensartet størrelse magnetiske perler, Streptavidin (Strep II tag), glutathion (GST-tag) eller TALON eller Ni: NTA (6x His-tag). Endelig tilgængeligheden af fluorescerende perler giver den samme protokol, der skal tilpasses til simple sortering assays til at undersøge homofil specificitet. I dette scenario, røde og grønne fluorescerende perler, hver belagt med en tydelig CAM, blandes og graden af sammenblanding eller adskillelse vurderes.
På trods af disse fordele, er der også forbehold. Først proteinfragmenter på perler i opløsning ikkerekapitulere kompleksiteten af in vivo-situationen. Individuelle celler udtrykker specifikke komplementer af celleoverfladeproteiner og deres intracellulære effektorer. Hver af disse kan have enten direkte eller indirekte virkninger på vedhæftning, og mange af disse effekter vil ikke blive afspejlet i perle assays. For eksempel kan et molekyle medierer stærk, heterofil adhæsion (det er et CAM), men vil ikke fremkalde perle aggregering i disse assays. For det andet, perle analyser er kun semi-kvantitativ og giver ikke pålidelige, kvantitative oplysninger om den relative styrke af adhæsive interaktioner. Endelig alle de molekyler, som vi har undersøgt er type I, single-pass membranproteiner, hvorved klæbemidlet domæne er til stede på en enkelt, sammenhængende polypeptid. Det er sandsynligt, at mange CAM'er kan være multi-pass transmembrane proteiner, der har en klæbende grænseflade bygget fra flere ektodomænet regioner. Dette assay ville ikke være let at tilpasse til sådanne molekyler.
For perle assays at være pålidelige, betingelserne skal være reproducerbare. Der er to potentielle kilder til variabilitet i disse assays. Den første er variation i proteinniveauer. Hvis der er variabilitet i ekspressionsniveauer, som følge af variation i transfektionseffektiviteten eller et dårligt udtrykt protein, kan perlerne ikke mættet, og resultaterne kan være upålidelige. Tidligere perle sammenlægning implementeringer bruge en defineret mængde renset ectodomæne-fusionsprotein. Typisk er dette fusionsprotein oprenses i store partier fra stabile cellelinier og kan anvendes i flere forsøg. Da mængden af perler, der anvendes i hvert forsøg, og mængden af protein, der kræves, er meget lille, kan en sammenlignelig reproducerbarhed opnås med transient transfektion. De magnetiske perler, som vi bruger har en bindende kapacitet på ~ 250 ng / L af resuspenderet perler. En typisk transfektion af 2 x 100 mm skåle resulterer i et stort overskud af protein, som kan kontrolleres med en sekundær bindende trin under anvendelse af supernatant efter den indledende binding af fusionsproteinet til perlerne. Den anden potentiel kilde til variation er mængden af perler, der anvendes. De magnetiske perler, som vi bruger leveres som en 30 mg / ml gylle, som afregner hurtigt. For reproducerbarhed skal perlerne resuspenderes fuldstændigt og den relevante mængde udvundet hurtigt, før perlerne begynder at bundfælde sig. Et alternativ er at pre-fortynde en defineret mængde af perler i et større volumen. Disse forfortyndet perler kan tilsættes i en større mængde (15 L snarere end 1,5 L) for at undgå pipetteringsfejl. Hvis ordentlig pleje ikke er taget, vil der være eksperiment-til-eksperiment variation i mængden af perler, der anvendes. Dette kan påvirke hastigheden af sammenlægning, hvilket fører til forskelle i den samlede størrelse på et bestemt tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
