Abstract
L'adhérence cellule-cellule est essentielle à la vie multicellulaire et est médiée par une grande diversité de protéines de la surface cellulaire. Cependant, les interactions adhésives pour un grand nombre de ces protéines sont mal compris. Nous présentons ici une méthode simple et rapide pour caractériser les propriétés adhésives des homophiles des molécules d'adhésion cellulaire putatifs. De culture des cellules HEK293 sont transfectées avec l'ADN plasmidique codant pour une sécrétion, un ectodomaine d'une étiquette d'épitope d'une protéine de surface cellulaire. Utilisation de billes fonctionnalisées spécifiques pour le marqueur d'epitope, le soluble, la protéine de fusion sécrétée est capturé à partir du milieu de culture. Les billes enrobées peuvent alors être utilisés directement dans des tests d'agrégation billes ou à bille fluorescente tri dosages pour tester l'adhérence homophile. Si on le souhaite, la mutagenèse peut être utilisée pour élucider les acides aminés ou domaines spécifiques nécessaires pour l'adhérence. Ce dosage ne nécessite que de petites quantités de protéine exprimée, ne nécessite pas la production de lignées cellulaires stables, et peut être accomplished à 4 jours.
Introduction
L'adhérence cellule-cellule est essentielle pour le développement et l'intégrité des organismes multicellulaires et est médiée par une grande diversité de molécules de la surface cellulaire. Beaucoup de ces molécules d'adhésion ont été identifiés et caractérisés, mais beaucoup restent à découvrir. Plusieurs méthodes sont utilisées pour étudier les propriétés des molécules d'adhésion cellulaire (CAM), y compris le tri cellulaires essais, des tests d'agrégation de cellules 1-8 et méthodes biophysiques, comme la microscopie à force atomique et la surface spectroscopie de force 9-12.
La complexité de la même simplifié dans des systèmes in vitro utilisant des lignées cellulaires, il est difficile de déterminer les propriétés adhésives d'une CAM putatif. Typiquement, une molécule est considérée comme une CAM si elle induit une agrégation cellulaire lorsqu'il est transfecté dans une lignée cellulaire non-adhésif. Toutefois, il est clair qu'il ne s'agit pas de preuve directe de l'activité de l'adhésif. Par exemple, faciliter la distribution de surface de la cellule ou de la stabilité d'unCAM se traduirait également par l'agrégation cellulaire accrue 1,13. De plus, un vrai CAM peut échouer la médiation agrégation cellulaire si la lignée cellulaire n'a pas d'autres co-facteurs nécessaires pour la livraison de la surface cellulaire ou de stabilisation.
Pour éviter ces facteurs de risque, des tests plus directs peuvent être employées qui sont fondées sur l'idée que les interactions adhésives doivent être une propriété intrinsèque biochimique du domaine extracellulaire. Alors que les perles étaient initialement utilisés pour caractériser Ng-CAM 2, ces essais ont été étendus afin d'enquêter sur la cadhérine-médiation adhérence 12,14,15. Utilisation de fusion des fusions C-cadhérine ectodomaine-Fc, le laboratoire a montré que Gumbiner multiples répétitions de cadhérine contribuent à des interactions homophiles 14. En utilisant des tests d'agrégation de perles comparables, la E-cadhérine et la N-cadhérine adhésion ont également été caractérisé 12,15, comme l'ont fait un certain nombre de PROTOCADHERINES 1,15-18 et isoformes DSCAM de Drosophila
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Protocol
1 Préparation des cellules (J-2 à 0)
- Fractionner les cellules HEK293 1: 5 en utilisant 0,05% de solution de trypsine-EDTA et incuber à la croissance des médias à 37 ° C avec 5% de CO 2 jusqu'à 60 ans - 80% de confluence (2 - 3 jours). Pour chaque condition, les cellules en culture dans 2 x boîtes de 100 mm.
2. transfection des cellules (Jour 1)
- Transfecter des cellules HEK293 avec le plasmide codant pour la Fc-fusion en utilisant un réactif de transfection, tels que la lipofectamine. D'autres méthodes qui conduisent à des efficacités de transfection comparables peuvent également être utilisés.
- Retour cellules transfectées à l'incubateur pendant 24 heures.
3. cellulaire propagation (Jour 2)
- Préchauffer milieux de croissance sans sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C.
- Rincer la vaisselle 2x avec 10 ml de croissance médias FBS, et renvoient les plats à la 37 ° C incubateur pendant 1 heure.
- Rincer la cultures des plats une fois de plus avec 10 ml de croissance médias FBS, pour un total de 3 lavages.
- Incubate les cellules HEK 293 transfectées à 37 ° C pendant 48 heures sans autre FBS avant de recueillir médias.
4 perles d'agrégation (Jour 4)
- Pour recueillir des médias de boîtes de culture, de transférer les médias de chaque paire de plats à 50 ml tubes coniques et rotation à 500 g pendant 5 min pour sédimenter les débris cellulaires.
- Les milieux filtrants de 50 ml tube conique dans un filtre centrifuge utilisant une seringue de 30 ml et de 0,45 um filtre de la seringue.
- Spin filtres centrifuges à 4000 x g et 4 ° C jusqu'à ce que le volume de milieu de culture concentré est d'environ 500 pl (environ 15 min). Répétez jusqu'à ce que tous les supports de culture a été ajouté et concentré.
- Ajouter 1,5 ul de billes magnétiques protéines G à 1 ml de glace froide Binding Buffer dans un tube de 1,5 ml pour chaque échantillon, les placer sur un aimant et éliminer le tampon. Immédiatement ajouter au milieu de culture concentré de la protéine G des billes magnétiques.
- Faire tourner les tubes à 4 ° C pendant 2 heures.
- Pltubes ace sur un aimant et supprimer médias. Laver rapidement perles deux fois avec le froid de la glace 1 ml Binding Buffer, puis remettre en suspension des billes dans 300 pi Binding Buffer.
- De Split remis en suspension dans 2 perles tubes, 150 pi dans chaque tube, puis ajouter 1,5 pi de mM CaCl 2 ou 200 200 mM EDTA pour le "calcium" et les conditions "pas de calcium", respectivement.
- Transfert 100 pi de chaque condition à une dépression bien glisser et de recueillir des micrographies au microscope lumière transmise (figure 2). Recueillir des images à partir de 5 champs de vision pour chaque expérience à chaque point de temps souhaité.
Analyse 5. données
- ImageJ, ou logiciel d'analyse d'image comparable, ouvrez l'un des cinq ensembles de données d'image en utilisant le / séquence d'images Importer ... dans le menu déroulant Fichier. Ceux-ci seront ouverts comme une pile d'images.
- Dans la boîte de dialogue ... image / Propriétés, modifiez la iunités de mage à pixels et mis Largeur Pixel et Hauteur de pixel à 1,0.
- Convertir les images en binaire utilisant le / Seuil Ajustez ... de commande dans le menu déroulant Image. Régler le seuil pour inclure pixels qui contribuent à des billes ou des agrégats de perles, mais qui excluent fond et de petites particules. Appliquer à toutes les images de la pile.
- Dans la boîte de dialogue de mesures Set, cochez les cases de la région et la pile de position.
- Exécutez analyser des particules ... dans le menu déroulant Analyser. Cela va générer une liste de particules identifiées, notamment leur taille (région) et l'image dans laquelle ils ont été identifiés.
- Répétez ce processus pour que l'expérience et l'état expérimental.
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Representative Results
Une expérience d'exemple est présenté sur la figure 2, qui représente l'agrégation des billes de calcium-dépendante par l'ectodomaine de la N-cadhérine fusionné à Fc (NcadEC-Fc). En l'absence de calcium, les perles présentent peu ou pas de tendance à l'agrégation et il n'y a pas d'augmentation de la taille des agrégats avec le temps (Figure 1A, C). En présence de calcium, des perles revêtues d'NcadEC-Fc montrent une agrégation solide, avec la taille des agrégats de plus en plus au cours du temps (figure 1B, C). Cette expérience a été répétée trois fois, à chaque fois constitué d'images à partir de cinq domaines ne se chevauchant pas. La taille des particules dans la zone de pixels a été déterminée pour chaque agrégat dans les cinq domaines. Ces données ont été moyennées pour chaque point de temps dans chaque expérience. Les données des trois expériences ont été calculée pour déterminer les moyens et les erreurs de mesure standard à chaque point de temps (figure 2C).
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Figure 1: Utilisation d'sécrétées, ectodomaines l'épitope étiqueté dans des tests d'agrégation de perles. (A) Représentation schématique montrant l'organisation d'une caractéristique, un seul passage molécule d'adhésion cellulaire transmembranaire (en haut), qui a une séquence de signal (S), un ectodomaine, un domaine transmembranaire (T) et un domaine intracellulaire (ICD). Pour produire une forme sécrétée de l'ectodomaine, un segment qui n'a pas les transmembranaires et intracellulaires des domaines est fusionné à la région Fc de l'IgG humaine (en bas). (B) lorsqu'il est transfecté dans des cellules en culture, la fusion ectomain-Fc est exprimée et sécrétée dans le milieu de culture, où il peut être capturé et purifié sur de la protéine A ou la protéine G des billes magnétiques. La protéine A ou la protéine G sont présentés sous forme de cercles noirs sur les perles. (C) Après lavage, les billes magnétiques recouvertes ectodomaine-Fc sont autorisés à regrouper, comme un test des interactions adhésives homophiles.ig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2 Perle essai d'agrégation. (A) Les cadhérines classiques, tels que la N-cadhérine et E-cadhérine, la médiation calcium-dépendante, l'adhérence homophile. En l'absence de calcium (sans calcium et 2 mM d'EDTA ajoutés), ne parviennent pas à médier cadhérines interactions adhésives. Montré ici est une image de la protéine G billes magnétiques recouvertes avec l'ectodomaine de poisson zèbre N-cadhérine fusionnée à Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc billes revêtues ont été autorisés à regrouper pendant 1 heure en présence de 2 mM CaCl 2. Adhérence homophile par les ectodomaines N-cadhérine est apparent à partir de la formation de gros agrégats de talon (C). Comme une mesure semi-quantitative de l'adhérence, de la taille des agrégats peut être mesurée. Une méthode pour y parvenir consiste à mesurer la surface occupée paragrégats distincts en images de lumière transmise. La taille moyenne de la superficie globale peut être représentée graphiquement en fonction du temps, comme illustré ici, ou le rapport de la surface moyenne des agrégats en présence ou en absence de calcium peut être calculé. L'agrégation des NcadEC-Fc billes revêtues en présence de calcium (cercles fermés) et en l'absence de calcium (cercles vides) a été déterminée à intervalles de 15 minutes au cours de 1 h. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'adhésion cellulaire est un élément essentiel de la vie multicellulaire et est médiée par une large gamme de protéines de la surface cellulaire. Parmi ceux-ci, les propriétés adhésives détaillées sont comprises que pour une part relativement faible. Ici, nous avons décrit un protocole simple et rapide pour enquêter sur la capacité adhésive homophile de ectodomaines sécrétées fusionnées à une étiquette d'épitope pratique. Cette approche a un certain nombre d'avantages importants. Premièrement, des lignées cellulaires stables sont pas tenus 14,20, en tant que des quantités suffisantes de protéine peuvent être produits par transfection transitoire de boîtes de 100 mm. Cela permet la projection d'un plus grand nombre de constructions - par exemple, le point ou suppression mutants - sans l'effort et de la charge de générer et de maintenir un grand nombre de lignées cellulaires. D'autre part, ces tests sont des tests de talon directes des propriétés biochimiques des molécules d'adhésion putatifs dans un système réduite. Par conséquent, l'adhésion peut être directement attribué à la protéineà l'étude, plutôt que les effets indirects potentiels. Troisièmement, pour étudier les effets des co-facteurs possibles, les cellules peuvent être co-transfectées avec les formes sécrétées de la molécule d'adhésion putatif et son co-facteur putatif, chacun avec une étiquette d'épitope distinct. En outre, cette approche est flexible, car il peut être adapté pour être utilisé avec une variété de marqueurs d'épitopes appropriés. Par exemple, des billes magnétiques de taille uniforme sont disponibles qui sont conjugués à la protéine A ou G (Fc tag), streptavidine (II Etiquette Strep), le glutathion (TPS tag), ou TALON ou Ni: NTA (6x His). Finalement, la disponibilité de billes fluorescentes permet au même protocole pour être adaptée à des essais de tri simples pour étudier la spécificité homophile. Dans ce scénario, des billes fluorescentes rouges et vertes, chacune revêtue d'une CAM distincts, sont mélangés et le degré de brassage ou de ségrégation est évaluée.
Malgré ces avantages, il ya aussi des mises en garde. Tout d'abord, des fragments de protéines sur des billes en solution font pasrécapituler la complexité de la situation in vivo. Les cellules individuelles expriment des compléments spécifiques de protéines de surface cellulaire et leurs effecteurs intracellulaires. Chacun d'eux peut avoir des effets directs ou indirects sur l'adhérence, et un grand nombre de ces effets ne seront pas reflétées dans les essais de perles. Par exemple, une molécule peut médier forte adhérence hétérophiles (il s'agit d'une CAM), mais ne pas induire une agrégation de talon dans ces essais. Deuxièmement, les analyses de perles sont semi-quantitatives et ne fournissent pas une information fiable, quantitative de la force relative des interactions adhésives. Enfin, toutes les molécules que nous avons étudiés sont de type I, en un seul passage des protéines de membrane, dans lequel le domaine d'adhésif est présent sur un seul polypeptide, contiguës. Il est probable que de nombreux CAM peuvent être multi-passes protéines transmembranaires qui possèdent une interface adhésive construit à partir de plusieurs régions de ectodomaine. Ce test ne serait pas facilement adaptable à de telles molécules.
Foessais r de perles soient fiables, les conditions doivent être reproductibles. Il existe deux sources de variabilité dans les dosages. Le premier est la variabilité des taux de protéines. Si il existe une variabilité des niveaux d'expression, en raison de la variation de l'efficacité de transfection ou une protéine mal exprimé, les billes peuvent pas être saturés et les résultats peuvent ne pas être fiables. Avant implémentations d'agrégation de perles utilisent une quantité définie de protéine purifiée ectodomaine-fusion. Généralement, cette protéine de fusion est purifié en grandes séries à partir de lignées cellulaires stables et peut être utilisé dans de multiples expériences. Comme la quantité de billes utilisées dans chaque expérience et la quantité de protéine requise est très faible, une reproductibilité comparable peut être atteint avec une transfection transitoire. Les billes magnétiques que l'on utilise ont une capacité de liaison d'environ 250 ng / L de perles remises en suspension. Une transfection typique de 2 x boîtes de 100 mm de résultats dans une vaste excès de protéines, qui peut être vérifiée à l'aide d'une étape de liaison secondaire, en utilisant le supersurnageant après la liaison initiale de la protéine de fusion aux billes. La seconde source de potentiel de variabilité est la quantité de billes utilisées. Les billes magnétiques que nous utilisons sont livrés en 30 mg / ml suspension qui s'installe rapidement. Pour la reproductibilité, les perles doivent être remises en suspension complètement et le volume utile extraites rapidement, avant que les billes commencent à s'installer. Une autre solution consiste à effectuer une pré-diluer une quantité définie de billes dans un volume plus important. Ces perles pré-dilué peut être ajouté à un volume plus grand (15 L au lieu de 1,5 L) pour éviter les erreurs de pipetage. Si les soins ne sont pas prises, il y aura la variabilité expérience à l'expérience de la quantité de billes utilisées. Cela pourrait affecter le taux d'agrégation, ce qui conduit à des différences de taille des agrégats à une heure spécifiée.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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