Abstract
Celle-celle adhesjon er grunnleggende for flercellet liv og formidles av et variert utvalg av celleoverflateproteiner. Imidlertid er de adhesive interaksjoner for mange av disse proteiner dårlig forstått. Her presenterer vi en enkel, rask metode for å karakterisere klebende egenskaper antatte homofilist celleadhesjonsmolekyler. Dyrkede HEK293-celler transfektert med plasmid DNA som koder for et utskilt, epitop-tagget ektodomenet av et celleoverflateprotein. Ved hjelp av funksjon perler spesifikke for epitop tag, er løselig, utskilt fusjonsprotein tatt fra kulturmediet. De belagte perler kan så brukes direkte i bead aggregering assays eller fluorescerende vulsten sortering assays for å teste for homofilist adhesjon. Hvis ønskelig, kan mutagenese deretter benyttes for å belyse de spesifikke aminosyrer eller domener som kreves for adhesjon. Denne assay krever bare små mengder av uttrykt protein, ikke krever produksjon av stabile cellelinjer, og kan ACCOmplished i 4 dager.
Introduction
Celle-celle adhesjon er avgjørende for utvikling og integriteten til flercellede organismer, og er formidlet av et variert utvalg av celleoverflatemolekyler. Mange av disse adhesjonsmolekyler har blitt identifisert og karakterisert, men mange gjenstår å bli oppdaget. Flere metoder blir brukt for å undersøke egenskapene for celleadhesjonsmolekyler (kammene), inkludert cellesorteringsanalyser, celle aggregering assays 1-8 og biofysiske metoder, slik som atomic force microscopy og overflatekraft-spektroskopi 9-12.
Kompleksiteten selv forenklet in vitro systemer ved hjelp av cellelinjer gjør det vanskelig å fastslå klebende egenskaper en antatt CAM. Typisk blir et molekyl betraktet som en CAM celle dersom den induserer aggregering når transfektert inn i en ikke-klebende cellelinje. Imidlertid er det klart at dette ikke er direkte bevis for klebe aktivitet. For eksempel, å lette celleoverflaten levering eller stabiliteten i enCAM vil også føre til økt celle aggregering 1,13. Videre kan en sann CAM mislykkes i å mediere celle aggregering hvis cellelinjen mangler andre ko-faktorer som er nødvendige for celleoverflaten eller stabilisering levering.
For å unngå disse kompliserende faktorer, mer direkte analyser kan anvendes som er basert på ideen om at adhesive interaksjoner bør være en iboende egenskap ved biokjemisk det ekstracellulære domene. Mens perler ble opprinnelig brukt til å karakterisere Ng-CAM 2, har disse analysene blitt utvidet for å undersøke cadherin-mediert vedheft 12,14,15. Ved hjelp av fusjon av C-cadherin ektodomenet-Fc fusjoner, den Gumbiner lab viste at flere cadherin gjentar bidra til homofilist interaksjoner 14. Ved hjelp av sammenlignbare perle aggregering analyser, E-cadherin og N-cadherin vedheft har også vært preget 12,15, som har en rekke protocadherins 1,15-18 og Dscam isoformer fra Drosophila
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Forberedelse (Dag -2 til 0)
- Split HEK293-celler 1: 5 ved bruk av 0,05% Trypsin-EDTA-løsning og inkuberes i vekstmedier ved 37 ° C med 5% CO2 inntil 60 - 80% sammenflytende (2-3 dager). For hver tilstand, dyrke celler i 2 x 100 mm skåler.
2. Cell Transfeksjon (Dag 1)
- Transfektere HEK293-celler med plasmid som koder Fc-fusjon med en transfeksjon reagens slik som Lipofectamine. Alternative fremgangsmåter som resulterer i sammenlign transfeksjon effektivitet kan også anvendes.
- Retur transfekterte celler til-inkubator i 24 timer.
3. Cell Propagation (Dag 2)
- Forvarm vekstmedier uten Fetal Bovine Serum (-FBS) til 37 ° C.
- Skyll retter 2x med 10 ml vekstmedier -FBS, og returnere oppvasken til 37 ° C inkubator i 1 time.
- Skyll kulturer retter en gang til med 10 ml vekstmedier -FBS, for totalt 3 vasker.
- INCUbate de transfekterte HEK293 cellene ved 37 ° C for en annen 48 timer uten FBS før samle media.
4. Bead Aggregation (Dag 4)
- Å samle media fra kultur retter, overføre media fra hvert par av rettene til 50 ml koniske rør og sentrifuger ved 500 xg i 5 min til pellet mobilnettet rusk.
- Filtrer medier fra 50 ml konisk rør inn i en sentrifugal filter ved hjelp av en 30 ml sprøyte og 0,45 um sprøytefilter.
- Spin sentrifugale filtre ved 4000 xg og 4 ° C inntil volum av konsentrert kultur media er ca 500 mL (ca. 15 min). Gjenta til all kultur media har blitt lagt til og konsentrert.
- Tilsett 1,5 mL av Protein G magnetiske kuler til 1 ml av iskald bindingsbuffer i et 1,5 ml mikrosentrifugerør for hver prøve, sted på en magnet og fjern buffer. Legge umiddelbart konsentrert kultur media til Protein G magnetiske kuler.
- Roter rørene ved 4 ° C i 2 timer.
- Pless rør på en magnet og fjerne media. Raskt vaske perler to ganger med iskald 1 ml Binding Buffer, og deretter resuspender perler i 300 mL Binding Buffer.
- Split resuspendert perler inn to rør, 150 pl i hvert rør, og deretter legge til 1,5 mL av 200 mM CaCl 2 eller 200 mm EDTA for "kalsium" og "nei kalsium" forhold, henholdsvis.
- Overfør 100 ul fra hver tilstand til en depresjon godt gli og samle mikrografer ved hjelp av et overført lysmikroskop (figur 2). Samle bildene fra 5 synsfelt for hvert forsøk på hver ønsket tidspunkt.
5. Data Analysis
- Bruke ImageJ, eller sammenlignbare bildeanalyse programvare, åpne en av de fem bilde datasett ved hjelp av Import / Image Sequence ... fra Fil-rullegardinmenyen. Disse vil bli åpnet som en bildestabel.
- I bilde / Egenskaper ... dialogboksen endrer jegMage enheter til piksler og satt Pixel Width og Pixel Høyde til 1.0.
- Konvertere bilder til binær bruke Juster / Threshold ... kommando i bilde nedtrekksmenyen. Sett terskelen til å inkludere punkter som bidrar til perler eller perlestørrelser, men som ekskluderer bakgrunn og små partikler. Gjelde for alle bildene i bunken.
- I Set dialogboksen Mål boksen, sjekk området og Stack Posisjons bokser.
- Kjør Analyser Partikler ... i Analyze nedtrekksmenyen. Dette vil generere en liste over identifiserte partikler, inkludert deres størrelse (område), og bildet der de ble identifisert.
- Gjenta denne prosessen som eksperiment og eksperimentell tilstand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel eksperimentet er presentert i figur 2, som viser kalsium-avhengige aggregering av vulsten ektodomenet av N-cadherin fusjonert til Fc (NcadEC-Fc). I fravær av kalsium, perler oppviser liten eller ingen tendens til å aggregere, og det ikke er noen økning i samlet størrelse med tiden (figur 1A, C). I nærvær av kalsium, perler belagt med NcadEC-Fc-show robust aggregering, med samlet størrelse øker over tid (figur 1B, C). Dette eksperimentet ble gjentatt tre ganger, med hver forekomst bestående av bilder fra fem ikke-overlappende felt. Partikkelstørrelsen i pikselområdet ble bestemt for hvert tilslag i de fem felter. Dataene ble midlet for hver gang-punkt i hvert forsøk. Dataene fra tre forsøk ble midlet for å bestemme middel og standardfeilene for måling ved hvert tidspunkt (figur 2C).
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Bruk av utskilt, epitop-merket ectodomains i perle aggregering analyser. (A) Skjematisk viser organiseringen av en vanlig, enkelt-pass transmembrane celle adhesjonsmolekyl (topp), som har en signalsekvens (S), en ektodomenet, et transmembrant domene (T), og et intracellulært domene (ICD). For å generere en utskilt form av ektodomenet, et segment som mangler transmembrane og intracellulære domener er fusjonert til Fc-regionen av humant IgG (nederst). (B) Når transfektert i dyrkede celler, er ectomain-Fc-fusjon uttrykkes og utskilles i kulturmediet, hvor det kan fanges opp og renset på protein A eller protein G magnetiske kuler. Protein A eller Protein G er vist som svarte sirkler på perlene. (C) Etter vasking, blir ektodomenet-Fc-belagte magnetiske kuler tillatt å aggregere, som en test på homofilist adhesive interaksjoner.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bead aggregering analysen. (A) De klassiske cadherins, slik som N-cadherin og E-cadherin, mediere kalsium-avhengige, homofilist adhesjon. I fravær av kalsium (uten tilsatt kalsium og 2 mM EDTA), cadherins mislykkes i å mediere adhesive interaksjoner. Vist her er et bilde av Protein G magnetiske kuler belagt med ektodomenet av sebrafisk N-cadherin smeltet til Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc belagt perler fikk lov til å aggregere for 1 time i nærvær av 2 mM CaCl 2. Homofilist adhesjon av N-cadherin ectodomains fremgår av dannelsen av store aggregater bead. (C) som en semi-kvantitativ måling av adhesjonen, kan størrelsen på aggregatene måles. En metode for å oppnå dette på er å måle området okkupert avdistinkte tilslag i overfør lyse bilder. Den midlere størrelse av den samlede området kan plottes som en funksjon av tid, som vist her, eller forholdet mellom midlere aggregat område i nærvær eller fravær av kalsium kan beregnes. Aggregering av NcadEC-Fc belagt perler i nærvær av kalsium (lukkede sirkler) og i fravær av kalsium (åpne sirkler) ble bestemt 15 min intervaller i løpet av 1 time. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celle adhesjon er en viktig funksjon av flercellet liv og formidles av et bredt spekter av celleoverflateproteiner. Av disse er de detaljerte klebeegenskaper forstås for bare en forholdsvis liten andel. Her har vi beskrevet en enkel, rask protokoll for å undersøke homofilist limet kapasitet skilles ectodomains smeltet til en praktisk epitope tag. Denne tilnærmingen har en rekke viktige fordeler. For det første er stabile cellelinjer ikke nødvendig 14,20, som tilstrekkelige mengder av protein kan bli generert av transient transfeksjon av 100 mm skåler. Dette gjør det mulig for screening av større antall konstruksjoner - som Punkt eller delesjonsmutanter - uten innsats og bekostning av å generere og vedlikeholde et stort antall cellelinjer. For det andre er disse kule assays er direkte tester av de biokjemiske egenskaper av putative adhesjonsmolekyler i en redusert system. Derfor kan adhesjonen knyttes direkte til proteinetsom undersøkes, i stedet mulige indirekte effekter. Tredje å undersøke effektene av mulige co-faktorer, celler kan være co-transfektert med utskilling former av den antatte adhesjonsmolekylet og dens antatte co-faktor, hver med en distinkt epitop tag. I tillegg er denne tilnærmingen fleksibel, da den kan tilpasses for bruk sammen med en rekke hensiktsmessige epitopen koder. For eksempel jevnt store magnetiske kuler er tilgjengelig som er konjugert til protein A eller G (Fc tag), Streptavidin (Strep II tag), glutation (GST tag), eller TALON eller Ni: NTA (6x Hans tag). Til slutt, tilgjengeligheten av fluoriserende perler gjør den samme protokollen for å være tilrettelagt for enkel sortering analyser for å undersøke homofilist spesifisitet. I dette tilfellet røde og grønne fluorescerende kuler, som hver er belagt med et distinkt CAM, blandes og graden av omrøring eller segregering vurderes.
Til tross for disse fordelene, er det også begrensninger. Først proteinfragmenter på perler i løsningen ikkerekapitulere kompleksiteten i in vivo situasjonen. Individuelle celler uttrykker spesifikke utfyller av celleoverflateproteiner og deres intracellulære effektorer. Hver av disse kan være enten direkte eller indirekte virkninger på adhesjon, og mange av disse effektene vil ikke bli reflektert i bead-analyser. For eksempel kan et molekyl medierer sterk, heterofile adhesjon (det er en CAM), men vil ikke indusere aggregering vulsten i disse assays. Sekund, perle analysene er bare semi-kvantitativ og ikke gi pålitelig, kvantitativ informasjon om den relative styrken av selvklebende interaksjoner. Endelig alle de molekyler som vi har undersøkt er type I, enkelt-pass-membranproteiner i hvilke limet domenet er til stede på en enkelt, sammenhengende polypeptid. Det er sannsynlig at mange CAM kan være multi-pass transmembrane proteiner som har en selvklebende grensesnitt bygget fra flere ektodomenet regioner. Denne assay ville ikke være lett å tilpasse til slike molekyler.
For perle analyser for å være pålitelig, forholdene må være reproduserbar. Det er to potensielle kilder for variasjon i disse assays. Den første er variasjonen i proteinnivåer. Hvis det er variasjon i ekspresjonsnivåene, på grunn av variasjon i transfeksjon effektivitet eller et dårlig uttrykte protein, kan kulene ikke bli mettet og resultatene kan være upålitelig. Tidligere perle aggregering implementeringer bruke en definert mengde av renset ektodomenet-fusion protein. Vanligvis er dette fusjonsprotein renset i store partier fra stabile cellelinjer, og kan brukes i flere eksperimenter. Ettersom mengden av perler som brukes i hvert forsøk og mengden av protein som kreves er svært liten, kan en tilsvarende reproduserbarhet oppnås ved forbigående transfeksjon. De magnetiske perler som vi bruker har en bindingskapasitet på ~ 250 ng / L av resuspendert perler. En typisk transfeksjon av 2 x 100 mm skåler resultater i et stort overskudd av protein, noe som kan verifiseres med en sekundær bindende trinnet, ved hjelp av superNatant etter den første binding av fusjonsproteinet til perlene. Den annen potensiell kilde til variasjon er mengden av perler som brukes. De magnetiske kuler som vi bruker leveres som en 30 mg / ml slurry som legger seg raskt. For reproduserbarhet, må kulene resuspenderes fullstendig, og det relevante volum ekstraheres raskt, før kulene begynner å avsette seg. Et alternativ er å pre-tynnes en definert mengde av perler i et større volum. Disse pre-fortynnet perler kan tilsettes i et større volum (15 L i stedet for 1,5 L) for å unngå feil pipettering. Ved riktig behandling er ikke tatt, vil det være eksperiment-til-eksperiment variasjon i mengden av perler som brukes. Dette kan påvirke graden av aggregering, som fører til forskjeller i samlede størrelsen på et angitt tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
