Abstract
Cell-cell adhesion är grundläggande för flercelliga livet och förmedlas av en mångfald av cellytproteiner. Emellertid är de adhesiva interaktioner för många av dessa proteiner dåligt kända. Här presenterar vi en enkel, snabb metod för att karakterisera de vidhäftande egenskaperna hos förmodade homofil cellvidhäftningsmolekyler. Odlade HEK293-celler transfekteras med DNA-plasmid som kodar för en utsöndrad, epitopmärkta ektodomänen av ett cellytprotein. Användning av funktionaliserade pärlor specifika för epitopmärkningen, är den lösliga, utsöndrade fusionsprotein fångat från odlingsmediet. De belagda kulorna kan sedan användas direkt i däckfots aggregeringsanalyser eller i fluorescerande pärla sortering analyser för att testa för homofil vidhäftning. Om så önskas kan mutagenes sedan användas för att belysa de specifika aminosyror eller domäner som krävs för vidhäftning. Denna analys kräver endast små mängder uttryckt protein, inte kräver att få se stabila cellinjer, och kan Accomplished i 4 dagar.
Introduction
Cell-cell adhesion är viktigt för utvecklingen och integritet flercelliga organismer och förmedlas av en mångfald av cellytemolekyler. Många av dessa adhesionsmolekyler har identifierats och karakteriserats, men många återstår att upptäcka. Flera metoder används för att undersöka egenskaperna hos celladhesionsmolekyler (CAMs), inklusive cellsorteringsanalyser, cell aggregeringsanalyser 1-8 och biofysiska metoder, såsom atomkraftsmikroskopi och ytan kraft spektroskopi 9-12.
Komplexiteten i ens klas in vitro-system med användning av cellinjer gör det svårt att bestämma de vidhäftande egenskaperna hos en förmodad CAM. Typiskt är en molekyl vara ett CAM om det inducerar cellaggregation när den transfekteras in i en icke-vidhäftande cellinje. Det är emellertid uppenbart att detta inte är direkta bevis för adhesiv aktivitet. Exempelvis underlättar leverans cellyta eller stabiliteten hos ettCAM skulle också leda till ökad cellaggregation 1,13. Dessutom kan en sann CAM misslyckas med att förmedla cellaggregation om cellinje saknar andra co-faktorer som behövs för leverans eller stabilisering cellytan.
För att undvika dessa komplicerande faktorer, mer direkta analyser kan användas som bygger på tanken att adhesiva interaktioner bör vara en inneboende biokemisk egenskap av den extracellulära domänen. Medan pärlor ursprungligen användes för att karakterisera Ng-CAM 2, har dessa analyser utökats för att undersöka cadherin-medierad vidhäftning 12,14,15. Genom att använda fusion av C-cadherin ektodomän-Fc fusioner visade Gumbiner labbet att flera cadherin upprepningar bidrar till homofil interaktioner 14. Med jämförbara vulst aggregeringsanalyser, E-cadherin och N-cadherin vidhäftnings har också karaktäriserats 12,15, som har ett antal protocadherins 1,15-18 och Dscam isoformer från Drosophila
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cell Preparation (Dag -2 till 0)
- Split HEK293 celler 1: 5 använder 0,05% trypsin-EDTA-lösning och inkubera i Growth Media vid 37 ° C med 5% CO2 tills 60-80% sammanflytande (2-3 dagar). För varje tillstånd, kulturceller i 2 x 100 mm skålar.
2. Cell Transfektion (Dag 1)
- Transfektera HEK293 celler med plasmid som kodar Fc-fusions med en transfektionsreagens såsom Lipofectamine. Alternativa metoder som resulterar i jämförbara transfektionseffektivitet kan också användas.
- Återgå transfekterade celler att inkubator i 24 timmar.
3. Cell Förökning (dag 2)
- Värm Growth Media utan fetalt bovint serum (-FBS) till 37 ° C.
- Skölj rätter 2x med 10 ml Growth Media -FBS och tillbaka disken till 37 ° C inkubator i 1 timme.
- Skölj kulturer rätter en gång med 10 ml Growth Media -FBS, för totalt 3 tvättar.
- Incubate de transfekterade HEK293-celler vid 37 ° C under ytterligare 48 tim utan FBS före uppsamling av media.
4. Bead Aggregation (Dag 4)
- För att samla mediet från odlingsskålarna, överföra media från varje par av rätter till 50 ml koniska rör och centrifugera vid 500 xg under 5 minuter för att pelletera cellrester.
- Filtermedia från 50 ml koniska rör i en centrifugal filter med hjälp av en 30 ml spruta och 0,45 um sprutfilter.
- Spin centrifugalfilter vid 4000 xg och 4 ° C tills volymen av koncentrerad kulturmedia är ungefär 500 | j, l (ca 15 min). Upprepa tills alla odlingsmedier har lagts till och koncentreras.
- Lägg 1,5 pl av protein G magnetiska pärlor till 1 ml iskall bindningsbuffert i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för varje prov, plats på en magnet och avlägsna buffert. Omedelbart lägga det koncentrerade odlingsmedier till Protein G magnetiska pärlor.
- Rotera rören vid 4 ° C under 2 tim.
- Place rören på en magnet och ta bort media. Snabbt tvätta pärlor två gånger med iskall 1 ml Binding Buffer och sedan resuspendera pärlor i 300 l Binding Buffer.
- Split återsuspenderas pärlor i 2 rör, 150 ul i varje rör, och sedan lägga till 1.5 l av 200 mM CaCl2 eller 200 mM EDTA för "kalcium" och "no kalcium" förhållanden.
- Överför 100 l från varje tillstånd till en depression väl glida och samla mikrofotografier med en genomlysning mikroskop (Figur 2). Samla bilder från 5 synfält för varje experiment vid varje önskad tidpunkt.
5. Data Analysis
- Med hjälp av ImageJ, eller jämförbar bildanalys programvara, öppnar du en av fem bilddatauppsättningar med hjälp av Import / Bildsekvens ... från Arkiv rullgardinsmenyn. Dessa kommer att öppnas som en bild stack.
- I bild / Egenskaper ... dialogrutan ändrar jagmage enheter till pixlar och ställa Pixel bredd och Pixel Höjd till 1,0.
- Konvertera bilderna till binära använda / Threshold Adjust ... kommandot i Bildrullgardinsmenyn. Ställ in tröskelvärdet för att inkludera pixlar som bidrar till pärlor eller bead aggregat, men att utesluta bakgrunden och små partiklar. Tillämpa på alla bilder i bunten.
- I Set dialogrutan Mått ruta, markera rutorna området och staplas.
- Kör Analysera Partiklar ... i Analysera rullgardinsmenyn. Detta kommer att generera en lista över identifierade partiklar, bland annat deras storlek (area) och bilden där de identifierades.
- Upprepa processen för vilka experiment och experimentell skick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel experiment presenteras i figur 2, som visar kalciumberoende vulst aggregering av ektodomänen av N-cadherin fusionerad till Fc (NcadEC-Fc). I brist på kalcium, pärlor uppvisar liten eller ingen tendens att aggregera och det finns ingen ökning av den aggregerade storlek med tiden (figur 1 A, C). I närvaro av kalcium, pärlor belagda med NcadEC-Fc show robust aggregering, med aggregatstorleken ökar över tiden (Figur 1B, C). Detta experiment upprepades tre gånger, med varje instans som består av bilder från fem icke-överlappande områden. Partikelstorleken i pixelområde bestämdes för varje aggregat i de fem områdena. Dessa data togs i genomsnitt för varje tidpunkt i varje experiment. Data från de tre försöken beräknades medelvärdet för att bestämma medelvärden och standardfel för mätning vid varje tidpunkt (figur 2C).
1762 / 51762fig1highres.jpg "/>
Figur 1 Användning av utsöndrade, epitopmärkta ektodomäner i pärla aggregeringsanalyser. (A) Schematisk visar anordnandet av en typisk, enkelpasstransmembran celladhesionsmolekyl (överst), som har en signalsekvens (S), en ektodomän, en transmembrandomän (T) och en intracellulär domän (ICD). För att generera en utsöndrad form av ektodomänen, ett segment som saknar de transmembrana och intracellulära domänerna är fusionerad till Fc-regionen av humant IgG (botten). (B) när den transfekteras i odlade celler, är ectomain-Fc-fusions uttrycks och utsöndras i odlingsmediet, där det kan fångas upp och renades på protein A eller protein G magnetiska pärlor. Protein A eller Protein G visas som svarta cirklar på pärlorna. (C) Efter tvättning ektodomän-Fc belagda magnetiska pärlor tillåtet att aggregera, som ett test av homofil självhäftande interaktioner.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Bead aggregeringsanalys. (A) De klassiska cadheriner, såsom N-cadherin och E-cadherin, medierar kalciumberoende, homofil vidhäftning. I frånvaro av kalcium (utan tillsatt kalcium och 2 mM EDTA), cadheriner misslyckas med att medla adhesiva interaktioner. Visat här är en bild av Protein G magnetiska pärlor belagda med ektodomänen av zebrafisk N-cadherin fusionerad till Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc belagda pärlor tilläts aggregera under 1 h i närvaro av 2 mM CaCla 2. Homofil vidhäftning av N-cadherin ektodomäner framgår av bildandet av stora pärla aggregat. (C) som en semi kvantitativt mått på vidhäftning, kan storleken på aggregaten mätas. En metod för att åstadkomma detta är att mäta den area som upptas avdistinkta aggregat i överförda ljusbilder. Den genomsnittliga storleken på sammantagen yta kan plottas som en funktion av tid, såsom visas här, eller förhållandet mellan medelvärdet sammantagen yta i närvaro eller frånvaro av kalcium kan beräknas. Sammanläggningen av NcadEC-Fc belagda pärlor i närvaro av kalcium (fyllda cirklar) och i frånvaro av kalcium (öppna cirklar) bestämdes vid 15 minuters intervall under loppet av 1 timme. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Celladhesion är ett väsentligt inslag i flercelliga livet och förmedlas av ett brett utbud av cellytproteiner. Av dessa är de detaljerade vidhäftningsegenskaper förstås endast en relativt liten del. Här har vi beskrivit en enkel, snabb protokoll för undersökning av homofil vidhäftning av utsöndrade ektodomäner fuserade till ett bekvämt epitopmarkör. Detta tillvägagångssätt har ett antal viktiga fördelar. Först är stabila cellinjer inte krävs 14,20, som tillräckliga mängder av proteinet kan genereras genom transient transfektion av 100 mm skålar. Detta gör att screening av större antal konstruktioner - t.ex. punkt eller deletionsmutanter - utan ansträngning och bekostnad av att skapa och upprätthålla ett stort antal cellinjer. För det andra är dessa bead analyser är direkta tester av de biokemiska egenskaperna hos förmodade adhesionsmolekyler i ett reducerat system. Därför kan vidhäftningen hänföras direkt till proteinetunder utredning, snarare än eventuella indirekta effekter. För det tredje, för att undersöka effekterna av eventuella co-faktorer, celler kan samtransfekteras med utsöndrade former av den förmodade adhesionsmolekylen och dess förmodade kofaktor, var och en med en distinkt epitopmarkör. Dessutom är detta tillvägagångssätt flexibel, eftersom den kan anpassas för användning med en mängd olika lämpliga epitoppåhäng. Exempelvis enhetligt stora magnetiska kulor finns som är konjugerade till protein A eller G (Fc tag), Streptavidin (Strep Il-tag), glutation (GST tag), eller TALON eller Ni: NTA (6x His tag). Slutligen tillgängligheten av fluorescerande kulor gör samma protokoll ska anpassas för enkla sorteringsanalyser för att undersöka homofil specificitet. I detta scenario, röda och gröna fluorescerande pärlor, var belagd med en distinkt CAM, blandas och graden av sammanblandning eller segregation bedöms.
Trots dessa fördelar, det finns också varningar. Först, proteinfragment på pärlor i lösningen interekapitulera komplexiteten av in vivo-situationen. Individuella celler uttrycker specifika komplement av proteiner på cellytan och deras intracellulära effektorer. Var och en av dessa kan ha antingen direkta eller indirekta effekter på vidhäftning, och många av dessa effekter kommer inte att återspeglas i pärla-analyser. Till exempel kan en molekyl medla stark, heterofila vidhäftning (det är en CAM), men skulle inte framkalla pärla aggregering i dessa analyser. För det andra, bead analyser är bara semi-kvantitativa och ger inte tillförlitliga, kvantitativ information om den relativa styrkan av självhäftande interaktioner. Slutligen alla de molekyler som vi har undersökt är typ I, enkelpassmembranproteiner i vilka den adhesiva domänen är närvarande på en enda, sammanhängande polypeptid. Det är troligt att många CAMs kan vara multi-passtransmembranproteiner som har ett vidhäftande gränssnitt byggd av flera ektodomän regioner. Denna analys skulle inte vara lätt att anpassa till sådana molekyler.
For pärla analyser för att vara tillförlitliga, villkoren måste vara reproducerbar. Det finns två möjliga källor till variabilitet i dessa analyser. Den första är variationen i proteinnivåer. Om det finns variabilitet i expressionsnivåer, beroende på variation i transfektionseffektivitet eller en dåligt uttryckta proteinet, kan pärlorna inte vara mättad och resultatet kan vara otillförlitliga. Tidigare pärla aggregering implementeringar använder en definierad mängd renat ektodomän-fusionsprotein. Typiskt är detta fusionsprotein renas i stora satser från stabila cellinjer och kan användas i flera experiment. Eftersom mängden av pärlor som användes i varje experiment och den mängd protein som erfordras är mycket liten, kan en jämförbar reproducerbarhet uppnås med transient transfektion. De magnetiska kulor som vi använder har en bindande kapacitet på ~ 250 ng / L återsuspenderat pärlor. En typisk transfektion av 2 x 100 mm skålar resulterar i ett stort överskott av protein, som kan kontrolleras med en sekundär bindningssteget, med användning av supernatant efter den initiala bindningen av fusionsproteinet till pärlorna. Den andra potentiell källa till variabilitet är mängden pärlor som används. De magnetiska kulor som vi använder levereras som en 30 mg / ml slam som lägger sig snabbt. För reproducerbarhet måste pärlorna återsuspenderas fullständigt och mängderna heras snabbt, innan kulorna börjar att bosätta sig. Ett alternativ är att i förväg späda en definierad mängd pärlor i en större volym. Dessa pre-utspädda pärlorna kan tillsättas i en större volym (15 L i stället för 1,5 L) för att undvika pipetteringsfel. Om lämplig vård inte vidtas kommer det att finnas experiment till experiment variation i mängden pärlor som används. Detta kan påverka graden av aggregering, vilket leder till skillnader i aggregatstorlek vid en viss tid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
