Abstract
הידבקות תאי תאים היא יסוד לחיים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של חלבונים בתא שטח. עם זאת, האינטראקציות הדבקה לרבים מחלבונים אלו הם הבינו היטב. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה, מהירה לאפיון מאפייני ההדבקה של מולקולות הידבקות תא homophilic המשוערות. HEK293 תאים בתרבית הם transfected עם פלסמיד דנ"א קידוד ectodomain של חלבון בתא שטח מופרש, epitope מתויג. באמצעות חרוזים פונקציונליות ספציפיים לתג epitope, החלבון המסיס, מופרש ההיתוך הוא נתפס ממדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להשתמש חרוזים המצופים ישירות במבחני צבירת חרוז או בחרוז ניאון מיון מבחני לבדיקת הידבקות homophilic. אם תרצה, mutagenesis לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להבהיר את חומצות אמינו הספציפיות או תחומים הנדרשים להידבקות. assay זה דורש רק כמויות קטנות של חלבון ביטא, אינו מחייב את הייצור של שורות תאי יציבות, ויכול להיות עכוmplished ב4 ימים.
Introduction
הידבקות תאי תאים חיונית לפיתוח ושלמותם של אורגניזמים רב תאיים ומתווכת על ידי מערך מגוון של מולקולות פני השטח של תא. רב של מולקולות הדבקה אלה זוהו ואופיין, שרבים יישארו להתגלות. מספר שיטות משמשות כדי לחקור את התכונות של מולקולות הידבקות תא (מצלמות), כוללים מבחני מיון תא, מבחני צבירת תא 1-8 ושיטות biophysical, כגון מיקרוסקופ כוח אטומי וכוח ספקטרוסקופיה משטח 9-12.
המורכבות אפילו פשוטים במערכות מבחנה באמצעות שורות תאים עושה את זה קשה לקבוע את מאפייני ההדבקה של CAM משוער. בדרך כלל, מולקולה נחשבת CAM אם זה גורם להצטברות של תאים כאשר transfected לקו תא הלא דביק. עם זאת, ברור שזה לא עדות ישירה של פעילות הדבקה. למשל, להקל על מסירת השטח פני תא או יציבותCAM היה גם לגרום להצטברות תא גדל 1,13. יתר על כן, CAM אמיתי עלול להיכשל לתווך צבירת תא אם שורת התאים חסרת שיתוף גורמים אחרים הנדרשים למשלוח פני תא או התייצבות.
כדי להימנע מגורמים שמסבך אלה, יותר מבחני ישירים יכול להיות מועסקים המבוססים על הרעיון כי אינטראקציות דבקים צריכים להיות רכוש ביוכימיים פנימי של תחום תאי. בעוד חרוזים בתחילה שימשו לאפיין Ng-CAM 2, אלה מבחני שהורחבו על מנת לחקור 12,14,15 הידבקות בתיווך cadherin. שימוש בשילוב של שילובי ectodomain-FC C-cadherin, המעבדה Gumbiner הראתה כי חזרות cadherin מרובות לתרום לhomophilic אינטראקציות 14. שימוש במבחני צבירת חרוז דומים, E-cadherin והידבקות N-cadherin גם היו מאופיין 12,15, כמו שיש לי מספר protocadherins 1,15-18 וisoforms Dscam מדרוזופילה
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 תא הכנה (יום -2 ל0)
- פיצול תאי HEK293 1: 5 באמצעות 0.05% פתרון טריפסין-EDTA ודגירה בצמיחת מדיה על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עד 60 - 80% ומחוברות (2 - 3 ימים). עבור כל תנאי, תאי תרבות ב2 x 100 מנות מ"מ.
.2 Transfection תא (יום 1)
- Transfect HEK293 תאים עם FC-היתוך קידוד פלסמיד באמצעות מגיב transfection כגון Lipofectamine. גם שיטות חלופיות שתבאנה ליעילות transfection הדומה ניתן להשתמש.
- חזור תאי transfected לחממה ל24 שעות.
.3 תא רביה (יום 2)
- צמיחת מדיה מחממים ללא סרום שור העוברי (-FBS) ל37 מעלות צלזיוס.
- יש לשטוף את הכלים 2x עם 10 מ"ל צמיחת מדיה -FBS, ולהחזיר את המנות ל37 מעלות צלזיוס החממה במשך שעה 1.
- יש לשטוף את זמן מנות תרבויות אחד יותר עם 10 מ"ל צמיחת מדיה -FBS, עבור הסכום כולל של 3 שוטף.
- Incuבייט HEK293 תאי transfected על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחרת 48 ללא FBS לפני איסוף תקשורת.
.4 ביד צבירה (יום 4)
- כדי לאסוף מדיה ממנות התרבות, להעביר מדיה מכל זוג של מנות ל50 צינורות מ"ל וספין חרוטי ב XG 500 במשך 5 דקות עד גלולה פסולת הסלולר.
- תקשורת מסנן מצינור חרוטי 50 מ"ל לתוך מסנן צנטריפוגלי באמצעות מזרק 30 מ"ל ו0.45 מיקרומטר מסנן מזרק.
- ספין מסנני צנטריפוגלי ב4,000 XG ו -4 ° C עד נפח של תקשורת בתרבות המרוכזת הוא כ 500 μl (כ 15 דקות). חזור על פעולה עד כל התקשורת והתרבות כבר הוסיפה ומרוכזת.
- הוסף 1.5 μl של חרוזים מגנטיים חלבון G ל1 מ"ל של קר כקרח כריכת מאגר בצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge עבור כל דגימה, מקום על מגנט ולהסיר חיץ. מייד להוסיף תקשורת והתרבות המרוכזת לחלבון G חרוזים מגנטיים.
- סובב צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- Plצינורות אס על מגנט ולהסיר תקשורת. מהר לשטוף חרוזי פעמיים עם קרח קר 1 מ"ל חיץ מחייב, ולאחר מכן resuspend חרוזים ב300 μl חיץ מחייב.
- פיצול resuspended חרוזים לתוך 2 צינורות, 150 μl לתוך צינור אחד, ולאחר מכן להוסיף 1.5 μl של 200 מ"מ CaCl 2 או 200 mM EDTA ל" סידן "ותנאים" אין סידן ", בהתאמה.
- העברה מכל מצב 100 μl לדיכאון גם להחליק ולאסוף micrographs באמצעות מיקרוסקופ מועבר אור (איור 2). לאסוף תמונות מ5 שדות של תצוגה עבור כל ניסוי בכל נקודת זמן רצויה.
ניתוח .5 נתונים
- באמצעות ImageJ, או תוכנת ניתוח תמונה דומה, פתח את אחת מחמש מערכות נתוני תמונה באמצעות יבוא תמונת הרצף / ... מהתפריט הנפתח קובץ. אלה ייפתחו כערימת תמונה.
- בתמונה / מאפיינים ... תיבת הדו שיח, לשנות את iיחידות קוסם לפיקסלים ורוחב פיקסל להגדיר ופיקסל ל1.0.
- להמיר את התמונות לינארי באמצעות / הסף ... הפקודה התאם בתפריט תמונה. לקבוע את הסף לכולל פיקסלים שתורמים לחרוזים או אגרגטים חרוז, אבל שלא לכלול רקע וחלקיקים קטנים. אחול על כל התמונות בערימה.
- בתיבת הדו שיח מדידות הסט, סמן את תיבות פינת וסטאק התפקיד.
- הפעל לנתח חלקיקים ... בניתוח תפריט הנפתח. זה יהיה ליצור רשימה של חלקיקים מזוהים, כולל גודלם (שטח) ואת התמונה שבה הם זוהו.
- חזור על תהליך זה עבורו ניסוי ותנאי ניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דוגמא לניסוי מוצג באיור 2, אשר מציג צבירת חרוז סידן תלוי על ידי ectodomain של N-cadherin התמזג Fc (NcadEC-FC). בהעדר סידן, חרוזים תערוכת נטייה קטנה או לא כדי לצבור ואין עלייה בגודל כולל עם זמן (איור 1 א, ג). בנוכחות סידן, חרוזים מצופים בצבירה איתנה מופע NcadEC-FC, עם גודל כולל הגדלת לאורך הזמן (איור 1 ב, ג). ניסוי זה חזר על עצמו שלוש פעמים, עם כל מופע המורכב מתמונות מחמישה שדות שאינם חופפים. גודל החלקיקים באזור פיקסל נקבע עבור כל המצרפי בחמשת תחומים. נתונים אלה היו בממוצע עבור כל נקודת זמן בכל ניסוי. נתונים משלושה הניסויים היו בממוצע כדי לקבוע אמצעים וסטיות התקן של מדידה בכל נקודה (איור 2 ג) זמן.
1,762 / 51762fig1highres.jpg "/>
.1 השתמשו דמותו של ectodomains במבחני צבירת חרוז המופרש, מתויג epitope. (א) סכמטי המציג את הארגון של טיפוסי, מולקולת הידבקות תא הטרנסממברני מעבר אחד (למעלה), שבו יש רצף אות (S), ectodomain, תחום הטרנסממברני (ט) ותחום תאיים (ICD). כדי ליצור צורה מופרשת של ectodomain, קטע שחסר את התחומים הטרנסממברני והתאיים הוא התמזגו לאזור Fc של נוגדנים אנושיים (בחלק תחתון). (ב) כאשר transfected לתאים בתרבית, היתוך ectomain-FC בא לידי ביטוי ומופרש לתוך מדיום התרבות, בו הוא יכול לנפול בפח וטהר בחלבון או חרוזים מגנטיים חלבון G. חלבון או חלבון G מוצג כעיגולים שחורים על חרוזים. (C) לאחר כביסה, חרוזים המגנטיים ectodomain-FC המצופים מותר לצבור, כמבחן לאינטראקציות דבקים homophilic."Target =" ig1highres.jpg _blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2 assay צבירה ביד. () Cadherins הקלאסי, כגון N-cadherin וE-cadherin, לתווך, הידבקות homophilic סידן תלוי. בהעדרו של סידן (ללא תוספת סידן ו2 mM EDTA), cadherins להיכשל לתווך אינטראקציות דבקים. המוצג כאן היא תמונה של חרוזים מגנטיים G חלבון מצופה ectodomain של N-cadherin דג הזברה התמזג Fc (NcadEC-FC). חרוזים מצופים (ב ') NcadEC-FC הורשו לצבור עבור שעה 1 בנוכחות 2 מ"מ CaCl 2. הידבקות Homophilic ידי ectodomains N-cadherin ניכר מהיווצרות אגרגטים חרוז גדולים. (C) כאמצעי חצי כמותית של הידבקות, בגודל של אגרגטים ניתן למדוד. שיטה אחת לעשות זאת היא למדוד את השטח הכבוש על ידיאגרגטים שונים בתמונות אור מועברות. הגודל הממוצע של שטח כולל ניתן להתוות כפונקציה של זמן, כפי שמוצג כאן, או היחס של שטח כולל הממוצע בנוכחותו או היעדריו של סידן יכול להיות מחושב. הצבירה של חרוזים מצופים NcadEC-FC בנוכחות סידן (מעגלים סגורים) ובהעדרו של סידן (עיגולים פתוחים) נקבעו ב15 מרווחי דקות במהלך שעה 1. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הידבקות תא היא תכונה חיונית של חיים רב תאיים ומתווכת על ידי מגוון רחב של חלבונים בתא שטח. מבין אלה, מאפייני הדבקה מפורטים הם הבינו רק חלק קטן יחסית. הנה, יש לנו תארנו פרוטוקול פשוט, מהיר לחקירת היכולת הדבקה homophilic של ectodomains המופרש התמזג תג epitope נוח. לגישה זו יש מספר היתרונות חשובים. ראשית, שורות תאי יציבות אינן נדרשות 14,20, ככמויות מספיקות של חלבון יכולות להיות שנוצרו על ידי transfection החולף של 100 מנות מ"מ. זה מאפשר ההקרנה של מספרים גדולים יותר של מבנים - למשל, נקודה או מחיקת מוטציות - ללא המאמץ ומחיר הפקה ושמירה על מספר גדול של שורות תאים. שנית, מבחני חרוז אלה הם בדיקות ישירות של התכונות הביוכימיות של מולקולות הדבקה המשוערות במערכת מופחתת. לכן, הדבקה ניתן לייחס ישירות לחלבוןתחת חקירה, ולא השפעות עקיפות פוטנציאליות. שלישית, כדי לחקור את ההשפעות של שיתוף גורמים אפשריים, יכולים להיות שותף transfected תאים עם צורות מופרשות של מולקולת ההידבקות המשוערת ושיתוף הגורם המשוער שלה, כל אחד עם תג epitope שונה. בנוסף, גישה זו היא גמישה, כפי שהוא יכול להיות מותאם לשימוש עם מגוון רחב של תגי epitope המתאימים. לדוגמא, חרוזים מגנטיים אחידה בגודל זמינים שמצומדת לחלבון או G (תג Fc), streptavidin (תג סטרפטוקוקוס II), גלוטתיון (תג GST), או TALON או Ni: נ.ת. ע (6x התג שלו). לבסוף, הזמינות של חרוזי ניאון מאפשרת באותו הפרוטוקול להיות מותאמת למבחני מיון פשוט לחקור סגוליות homophilic. בתרחיש זה, חרוזי ניאון אדומים וירוקים, כל אחד מצופה בCAM שונה, מעורבבים והתואר של ערבוב או הפרדה מוערך.
למרות יתרונות אלה, יש גם אזהרות. ראשון, שברי חלבון על חרוזים בפתרון לאלשחזר את המורכבות של מצב in vivo. תאים בודדים להביע משלים ספציפי של חלבונים בתא שטח וeffectors תאית שלהם. כל אחד מאלה עשויים להיות השפעות ישירות או עקיפות על הידבקות, ורבים מהשפעות אלה לא באו לידי ביטוי במבחני חרוז. לדוגמא, מולקולה עשויה לתווך הדבקה חזקה, heterophilic (זה CAM), אך לא תגרום צבירת חרוז במבחנים אלה. שנית, מבחני חרוז הם רק חצי כמותית ואינו מספקים מידע אמין, כמותי בכח היחסי של אינטראקציות דבקים. לבסוף, כל המולקולות שיש לנו נחקרו הם, חלבוני קרום יחיד לעבור סוג אני בי תחום הדבק קיים בפוליפפטיד בודד, רציף. סביר להניח כי מספר רב של מצלמות יכולות להיות חלבונים הטרנסממברני מרובה עובר שיש לי ממשק דבק בנוי מאזורי ectodomain המרובים. assay זה לא יהיה התאמה בקלות למולקולות כאלה.
Foמבחני חרוז r להיות אמין, התנאים צריכים להיות לשחזור. ישנם שני מקורות פוטנציאליים של השתנות במבחנים אלה. הראשון הוא השתנות ברמות חלבון. אם יש שונות ברמות ביטוי, בשל שונות ביעילות transfection או חלבון גרוע הביע, חרוזים עשויים שלא להיות רוויים והתוצאות עלולות להיות לא אמינות. מימושי צבירת חרוז לפני להשתמש בכמות מוגדרת חלבון ectodomain-היתוך המטוהר של. בדרך כלל, חלבון ההיתוך הזה הוא מטוהר בקבוצות גדולות משורות תאי יציבות וניתן להשתמש בם בניסויים מרובים. ככמות של חרוזים המשמשים בכל ניסוי ואת כמות החלבון הדרוש היא קטנות מאוד, שחזור דומה ניתן להשיג עם transfection החולף. יש לי חרוזים המגנטיים שאנו משתמשים בי קיבולת מחייב של ~ 250 ng / L של חרוזים מושעים. Transfection טיפוסי של 2 x 100 תוצאות מנות מ"מ בעודף עצום של חלבון, אשר ניתן לאמת בצעד מחייב משניים, באמצעות הסופרnatant לאחר ראשוני המחייב של חלבון ההיתוך לחרוזים. המקור הפוטנציאלי השני של השתנות הוא הכמות של חרוזים משמשים. חרוזים המגנטיים שאנו משתמשים בי מסופקים כ30 מ"ג / מ"ל תרחיף המכריע במהירות. לשחזור, חרוזים חייבים להיות resuspended לחלוטין והנפח הרלוונטי שחולצו במהירות, לפני שהחרוזים מתחילים להתיישב. חלופה אחת היא מראש לדלל כמות מוגדרת של חרוזים בנפח גדול יותר. ניתן להוסיף חרוזים בדילול אלה מראש בנפח גדול יותר (15 L L ולא 1.5) כדי למנוע שגיאות pipetting. אם טיפול הולם אינו נלקח, תהיה השתנות ניסוי לניסוי בכמות חרוזים המשמשים. זה יכול להשפיע על השער של צבירה, שמוביל להבדלים בגודל המצרפי בזמן מסוים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
- Chen, X., Gumbiner, B. M. Paraxial protocadherin mediates cell sorting and tissue morphogenesis by regulating C-cadherin adhesion activity. J. Cell Biol. 174 (2), 301-313 (2006).
- Grumet, M., Friedlander, D. R., Edelman, G. M. Evidence for the binding of Ng-CAM to laminin. Cell Adhes. Commun. 1 (2), 177-190 (1993).
- Hatta, K., Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Cloning and expression of cDNA encoding a neural calcium-dependent cell adhesion molecule: its identity in the cadherin gene family. J. Cell Biol. 106 (3), 873-881 (1988).
- Hirano, S., Nose, A., Hatta, K., Kawakami, A., Takeichi, M. Calcium-dependent cell-cell adhesion molecules (cadherins): subclass specificities and possible involvement of actin bundles. J. Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2501-2510 (1987).
- Nose, A., Nagafuchi, A., Takeichi, M. Expressed recombinant cadherins mediate cell sorting in model systems. Cell. 54 (7), 993-1001 (1988).
- Nose, A., Takeichi, M. A novel cadherin cell adhesion molecule: its expression patterns associated with implantation and organogenesis of mouse embryos. J. Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2649-2658 (1986).
- Schreiner, D., Weiner, J. A. Combinatorial homophilic interaction between gamma-protocadherin multimers greatly expands the molecular diversity of cell adhesion. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (33), 14893-14898 (2010).
- Takeichi, M. Functional correlation between cell adhesive properties and some cell surface proteins. J. Cell Biol. 75, 464-474 (1977).
- Sivasankar, S., Brieher, W., Lavrik, N., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct molecular force measurements of multiple adhesive interactions between cadherin ectodomains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (21), 11820-11824 (1999).
- Sivasankar, S., Gumbiner, B., Leckband, D. Direct measurements of multiple adhesive alignments and unbinding trajectories between cadherin extracellular domains. Biophys. J. 80, 1758-1768 (2001).
- Sivasankar, S., Zhang, Y., Nelson, W. J., Chu, S. Characterizing the initial encounter complex in cadherin adhesion. Structure. 17 (8), 1075-1081 (2009).
- Zhang, Y., Sivasankar, S., Nelson, W. J., Chu, S. Resolving cadherin interactions and binding cooperativity at the single-molecule level. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (1), 109-114 (2009).
- Yasuda, S., et al. Activity-induced protocadherin arcadlin regulates dendritic spine number by triggering N-cadherin endocytosis via TAO2beta and p38 MAP kinases. Neuron. 56 (3), 456-471 (2007).
- Chappuis-Flament, S., Wong, E., Hicks, L. D., Kay, C. M., Gumbiner, B. M. Multiple cadherin extracellular repeats mediate homophilic binding and adhesion. J. Cell Biol. 154 (1), 231-243 (2001).
- Emond, M. R., Biswas, S., Blevins, C. J., Jontes, J. D. A complex of Protocadherin-19 and N-cadherin mediates a novel mechanism of cell adhesion. J. Cell Biol. 195 (7), 1115-1121 (2011).
- Biswas, S., Emond, M. R., Jontes, J. D. The clustered protocadherins Pcdhalpha and Pcdhgamma form a heteromeric complex in zebrafish. Neuroscience. 219, 280-289 (2012).
- Blevins, C. J., Emond, M. R., Biswas, S., Jontes, J. D. Differential expression, alternative splicing, and adhesive properties of the zebrafish delta1-protocadherins. Neuroscience. 199, 523-534 (2011).
- Morishita, H., et al. Structure of the cadherin-related neuronal receptor/protocadherin-alpha first extracellular cadherin domain reveals diversity across cadherin families. J. Biol. Chem. 281, 33650-33663 (1074).
- Wojtowicz, W. M., Flanagan, J. J., Millard, S. S., Zipursky, S. L., Clemens, J. C. Alternative splicing of Drosophila Dscam generates axon guidance receptors that exhibit isoform-specific homophilic binding. Cell. 118 (5), 619-633 (2004).
- Drees, F., Reilein, A., Nelson, W. J. Cell-adhesion assays: fabrication of an E-cadherin substratum and isolation of lateral and Basal membrane patches. Methods Mol. Biol. 294, 303-320 (2005).
