Abstract
La adhesión célula-célula es fundamental a la vida multicelular y está mediada por una serie diversa de proteínas de la superficie celular. Sin embargo, las interacciones adhesivas para muchas de estas proteínas son poco conocidos. Aquí se presenta un método simple, rápido para la caracterización de las propiedades adhesivas de moléculas de adhesión celular homofílicas putativos. Células HEK293 cultivadas se transfectaron con el plásmido de ADN que codifica un secretada, ectodominio epítopo de etiquetado de una proteína de la superficie celular. El uso de perlas funcionalizados específicos para la etiqueta de epítopo, la proteína de fusión soluble, secretada es capturada del medio de cultivo. Las perlas recubiertas se pueden utilizar directamente en ensayos de agregación de talón o en grano fluorescente de clasificación ensayos para probar la adhesión homophilic. Si se desea, la mutagénesis se puede entonces utilizar para dilucidar los aminoácidos o dominios específicos requeridos para la adhesión. Este ensayo requiere sólo pequeñas cantidades de proteína expresada, no requiere la producción de líneas celulares estables, y se puede ACCOmplished en 4 días.
Introduction
Adhesión célula-célula es esencial para el desarrollo y la integridad de los organismos multicelulares y es mediada por un conjunto diverso de moléculas de superficie celular. Muchas de estas moléculas de adhesión se han identificado y caracterizado, aunque muchos aún no se han descubierto. Se utilizan varios métodos para investigar las propiedades de las moléculas de adhesión celular (CAMs), incluyendo ensayos de clasificación de células, ensayos de agregación celular 1-8 y métodos biofísicos, tales como la microscopía de fuerza atómica y espectroscopía de fuerza de superficie 9-12.
La complejidad de incluso simplificada en sistemas in vitro utilizando líneas celulares hace que sea difícil determinar las propiedades adhesivas de una CAM putativo. Típicamente, una molécula se considera una CAM si induce la agregación de células cuando se transfecta en una línea celular no adhesiva. Sin embargo, está claro que esto no es evidencia directa de la actividad de adhesivo. Por ejemplo, facilitar la entrega de la superficie celular o la estabilidad de unCAM también se traduciría en un aumento de la agregación de células 1,13. Por otra parte, una verdadera CAM puede fallar para mediar en la agregación de células si la línea celular carece de otros co-factores necesarios para la entrega de la superficie celular o la estabilización.
Para evitar estos factores que complican, los ensayos más directos pueden ser empleadas que se basan en la idea de que las interacciones adhesivas deben ser una propiedad bioquímica intrínseca del dominio extracelular. Mientras que los granos fueron utilizados inicialmente para caracterizar Ng-CAM 2, estos ensayos se han ampliado con el fin de investigar la adhesión mediada por cadherina 12,14,15. Uso de fusión de las fusiones C-cadherina ectodominio-Fc, el laboratorio Gumbiner mostró que múltiples repeticiones de cadherina contribuyen a las interacciones homofílicas 14. Usando ensayos de agregación del grano comparables, E-cadherina y de adhesión N-cadherina también se han caracterizado 12,15, como tener un número de protocadherins 1,15-18 e isoformas Dscam de Drosophila
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Protocol
1. Cell preparación (Día de -2 a 0)
- Dividir celdas HEK293 1: 5 utilizando solución de tripsina-EDTA 0,05% y se incuban en medios de crecimiento a 37 ° C con 5% de CO 2 hasta 60 - 80% de confluencia (2-3 días). Para cada condición, células de cultivo en 2 x 100 mm platos.
2. transfección celular (Día 1)
- Transfectar células HEK293 con plásmido que codifica Fc-fusion utilizando un reactivo de transfección como Lipofectamine. Los métodos alternativos que resultan en eficiencias de transfección comparables también pueden ser utilizados.
- Volver células transfectadas a la incubadora durante 24 horas.
3. Cell Propagación (Día 2)
- Precaliente el crecimiento de medios sin suero bovino fetal (FBS) al 37 ° C.
- Lavar platos 2x con 10 ml Growth Medios FBS, y devuelven los platos a la incubadora a 37 ° durante 1 hora.
- Enjuague la culturas platos una vez más con 10 ml Growth Medios FBS, para un total de 3 lavados.
- Incubate las células HEK293 transfectadas a 37 ° C durante otras 48 horas sin FBS antes de recoger los medios de comunicación.
4. bolas Aggregation (Día 4)
- Para recoger los medios de comunicación a partir de placas de cultivo, transferir los medios de comunicación de cada par de platos para 50 ml tubos cónicos y centrifugado a 500 xg durante 5 min para sedimentar los restos celulares.
- Los medios de filtro de 50 ml tubo cónico de centrífuga en un filtro utilizando una jeringa de 30 ml y 0,45 micras filtro de jeringa.
- Girar filtros centrífugos a 4.000 xg y 4 ° C hasta que el volumen de medios de cultivo concentrado es de aproximadamente 500 l (aproximadamente 15 min). Repita hasta que haya agregado todos los medios de cultivo y se concentró.
- Añadir 1,5 l de perlas magnéticas proteína G a 1 ml de tampón de unión enfriado con hielo en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para cada muestra, el lugar en un imán y eliminar el tampón. Inmediatamente después, añadir el medio de cultivo concentrado a la proteína G perlas magnéticas.
- Girar los tubos a 4 ° C durante 2 horas.
- Pltubos as en un imán y eliminar los medios de comunicación. Lavarse rápidamente perlas dos veces con frío hielo 1 ml de tampón de unión, y luego volver a suspender cuentas en 300 l de tampón de unión.
- Dividir volvió a suspender cuentas en 2 tubos, 150 l en cada tubo, y luego añadir 1,5 l de CaCl 2 mM o 200 mM EDTA 200 para la condiciones "no" calcio "calcio", y, respectivamente.
- Transferencia de 100 l de cada condición a una depresión bien deslice y recoger micrografías utilizando un microscopio de luz transmitida (Figura 2). Recoger imágenes de 5 campos de visión para cada experimento en cada punto de tiempo deseado.
Análisis 5. Datos
- Usando ImageJ, o software de análisis de imagen comparable, abra uno de los cinco conjuntos de datos de imágenes utilizando la Importación / Secuencia de imágenes ... en el menú desplegable Archivo. Éstas se abrirán como de pilas de imágenes.
- En el cuadro de diálogo ... Imagen / Propiedades, cambie la iunidades de magos a píxeles y establecer pixel Ancho y Altura en hasta 1,0.
- Convertir las imágenes a binario utilizando el / Umbral Ajuste ... comando en el menú desplegable de imagen. Establecer el umbral para incluir píxeles que contribuyen a cuentas o agregados de cuentas, pero que excluye fondo y las partículas pequeñas. Aplicar a todas las imágenes de la pila.
- En el cuadro de diálogo Medidas Set, seleccione las casillas de la zona y de pila de posición.
- Ejecute Analizar Partículas ... en el menú desplegable Analizar. Esto generará una lista de partículas identificadas, incluyendo su tamaño (área) y la imagen en la que se identificaron.
- Repita este proceso para el que experimento y la condición experimental.
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Representative Results
Un ejemplo experimento se presenta en la Figura 2, que muestra la agregación de talón dependiente de calcio por el ectodominio de N-cadherina fusionada a Fc (NcadEC-Fc). En ausencia de calcio, perlas exhiben poca o ninguna tendencia a agregarse y no hay aumento en tamaño de los agregados con el tiempo (Figura 1A, C). En presencia de calcio, perlas recubiertas con NcadEC-Fc muestran robusta agregación, con el aumento de tamaño de los agregados en el tiempo (Figura 1B, C). Este experimento se repitió tres veces, con cada instancia que consiste en imágenes de cinco campos que no se superponen. El tamaño de las partículas en el área de píxeles se determinó para cada agregado en los cinco campos. Estos datos se promediaron para cada punto de tiempo en cada experimento. Los datos de los tres experimentos se promedian para determinar los medios y los errores estándar de medida en cada punto de tiempo (Figura 2C).
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Figura 1 Uso de secretadas, ectodominios epítopo de etiquetado en ensayos de agregación de perlas. (A) Esquema que muestra la organización de una típica, de un solo paso molécula de adhesión celular transmembrana (arriba), que tiene una secuencia (S) de la señal, un ectodominio, un dominio transmembrana (T) y un dominio intracelular (ICD). Para generar una forma secretada de la ectodominio, un segmento que carece de los dominios transmembrana e intracelulares se fusiona a la región Fc de la IgG humana (abajo). (B) cuando se transfecta en células cultivadas, la fusión ectomain-Fc se expresa y se secreta en el medio de cultivo, donde puede ser capturado y purificó sobre proteína A o proteína G perlas magnéticas. Proteína A o Proteína G se muestran como círculos negros en las perlas. (C) Después del lavado, las perlas magnéticas recubiertas ectodominio-Fc se les permite agregar, como una prueba de interacciones adhesivas homofílicas.ig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. ensayo de agregación de bolas. (A) Las cadherinas clásicas, tales como N-cadherina y E-cadherina, median dependiente de calcio, la adhesión homophilic. En ausencia de calcio (sin calcio y EDTA 2 mM añadido), cadherinas fallan en mediar en las interacciones adhesivas. Aquí se muestra una imagen de perlas magnéticas recubiertas con proteína G del ectodominio de pez cebra N-cadherina fusionada a Fc (NcadEC-Fc). (B) NcadEC-Fc perlas recubiertas se les permitió a agregarse durante 1 hora en presencia de 2 mM CaCl 2. Adhesión Homophilic por los ectodominios N-cadherina es evidente a partir de la formación de grandes agregados de talón. (C) como una medida semi-cuantitativa de la adhesión, el tamaño de los agregados se puede medir. Un método de lograr esto es para medir el área ocupada poragregados distintas imágenes en luz transmitida. El tamaño medio de superficie total puede ser trazado como una función del tiempo, como se muestra aquí, o la relación del área total media en la presencia o ausencia de calcio se puede calcular. La agregación de NcadEC-Fc perlas recubiertas en presencia de calcio (círculos cerrados) y en ausencia de calcio (círculos abiertos) se determinó a intervalos de 15 min en el transcurso de 1 hora. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de este figura.
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Discussion
La adhesión celular es una característica esencial de la vida multicelular y está mediada por una amplia gama de proteínas de la superficie celular. De estos, se entienden las propiedades adhesivas detalladas por sólo una proporción relativamente pequeña. Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y rápido para la investigación de la capacidad adhesiva homophilic de ectodominios secretadas fusionados con un cómodo marcador de epítopo. Este enfoque tiene una serie de ventajas importantes. En primer lugar, no se requieren líneas celulares estables 14,20, en forma de cantidades suficientes de proteína pueden ser generados por transfección transitoria de placas de 100 mm. Esto permite la detección de un mayor número de construcciones - por ejemplo, de punto o de deleción mutantes - sin el esfuerzo y el gasto de la generación y el mantenimiento de un gran número de líneas celulares. En segundo lugar, estos ensayos de talón son pruebas directas de las propiedades bioquímicas de las moléculas de adhesión putativos en un sistema reducida. Por lo tanto, la adhesión se puede atribuir directamente a la proteínabajo investigación, en lugar de efectos indirectos potenciales. En tercer lugar, para investigar los efectos de posibles co-factores, las células pueden ser co-transfectadas con formas secretadas de la molécula de adhesión putativa y su co-factor putativo, cada uno con una etiqueta de epítopo distinto. Además, este enfoque es flexible, ya que puede ser adaptado para su uso con una variedad de etiquetas de epítopos adecuados. Por ejemplo, perlas magnéticas de tamaño uniforme están disponibles que se conjuga con la proteína A o G (etiqueta Fc), estreptavidina (Strep tag II), glutatión (etiqueta GST), o TALON o Ni: NTA (6x His). Finalmente, la disponibilidad de perlas fluorescentes permite el mismo protocolo para ser adaptada para los ensayos de clasificación simple, para investigar la especificidad homophilic. En este escenario, perlas fluorescentes rojas y verdes, cada uno recubierto con una CAM distinta, se mezclan y el grado de entremezclado o segregación se evalúa.
A pesar de estas ventajas, también hay advertencias. En primer lugar, fragmentos de proteínas en perlas en solución no hacenrecapitular la complejidad de la situación in vivo. Las células individuales expresan complementos específicos de proteínas de superficie celular y sus efectores intracelulares. Cada uno de ellos puede tener efectos directos o indirectos sobre la adherencia, y muchos de estos efectos no se reflejarán en los ensayos de cuentas. Por ejemplo, una molécula puede mediar fuerte, la adhesión heterófilos (es una CAM), pero no sería inducir la agregación del talón en estos ensayos. En segundo lugar, los ensayos de cuentas sólo son semi-cuantitativos y no proporcionan información fiable y cuantitativa de la fuerza relativa de las interacciones adhesivas. Finalmente, todas las moléculas que hemos investigado son de tipo I, proteínas de membrana de un solo paso en el que el dominio adhesivo está presente en una sola, polipéptido contiguo. Es probable que muchas cámaras podrían ser proteínas transmembrana de varias pasadas que tienen una interfaz adhesivo construido a partir de múltiples regiones ectodominio. Este ensayo no sería fácilmente adaptable a tales moléculas.
Foensayos de perlas r sean fiables, las condiciones deben ser reproducibles. Hay dos posibles fuentes de variabilidad en estos ensayos. La primera es la variabilidad en los niveles de proteína. Si hay variabilidad en los niveles de expresión, debido a la variación en la eficiencia de la transfección o una proteína poco expresado, las perlas no pueden ser saturados y los resultados pueden ser poco fiables. Anteriores implementaciones de agregación de talón utilizan una cantidad definida de proteína de fusión purificada ectodominio-. Típicamente, esta proteína de fusión se purifica en grandes lotes a partir de líneas celulares estables y se puede utilizar en múltiples experimentos. A medida que la cantidad de perlas utilizados en cada experimento y la cantidad de proteína requerida es muy pequeña, una reproducibilidad comparable se puede lograr con transfección transitoria. Las perlas magnéticas que utilizamos tienen una capacidad de unión de ~ 250 ng / L de perlas resuspendidas. Una transfección típico de 2 x 100 mm placas de resultados en un gran exceso de proteína, que puede ser verificado con un paso de unión secundaria, utilizando el súpersobrenadante después de la unión inicial de la proteína de fusión a las perlas. La segunda fuente potencial de variabilidad es la cantidad de perlas utilizados. Las perlas magnéticas que utilizamos se suministran como 30 mg / ml suspensión que se instala rápidamente. Para la reproducibilidad, los granos deben ser resuspendido completamente y el volumen correspondiente extrajeron rápidamente, antes de que las cuentas comienzan a asentarse. Una alternativa es la de pre-diluir una cantidad definida de perlas en un volumen mayor. Estas perlas pre-diluido se pueden añadir en un volumen más grande (15 L en lugar de 1,5 L) para evitar errores de pipeteo. Si no se toma el cuidado apropiado, habrá variabilidad experimento a experimento en la cantidad de granos utilizados. Esto podría afectar a la velocidad de agregación, dando lugar a diferencias en el tamaño agregado de un tiempo especificado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pFc-N1 plasmid | Addgene | To be submitted | |
| HEK293 cells | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| DMEM | Mediatech - Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F2442 | |
| 100x Pen-Strep (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668030 | |
| Dynabeads – Protein G | Life Technologies | 10003D | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3294 | |
| Depression slides | Electron Microscopy Sciences | 71878-06 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC901024 | |
| 0.45 mm syringe filter | Sarstedt | 83.1826 | |
| Dynamag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Fiji (ImageJ) Image Analysis Software | http://fiji.sc/Fiji | ||
| Table of Buffers/Solutions | |||
| Growth Media | DMEM + 10% FBS + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Growth Media –FBS | DMEM + Pen-Strep | Filter sterilize and store at 4 °C. | |
| Binding Buffer | 50 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCl, 10 mM KCl, 0.2% BSA | Vortex until dissolved, keep on ice. | |
References
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