Summary
Reporter cellelinjer tilbyder et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse fra heterogene populationer. Men gen-targeting anvendelse af konventionel homolog rekombination i humane embryonale stamceller er yderst ineffektivt. Heri beskriver vi målrettet CNS midthjernen specifik transkriptionsfaktor PITX3 locus med EGFP hjælp zink-finger nuklease forbedret homolog rekombination.
Abstract
En væsentlig begrænsning med aktuelle humane embryonale stamceller (ESC) differentiering protokoller er dannelsen af heterogene cellepopulationer. Disse kulturer indeholder cellerne af interesse, men er også forurenet med udifferentierede økonomiske og sociale råd, ikke-neurale derivater og andre neuronale undertyper. Dette begrænser deres anvendelse i in vitro og in vivo applikationer, såsom in vitro-modellering for lægemiddelforskning eller udskiftning celleterapi. For at hjælpe med at overvinde dette, reporter cellelinjer, som tilbyder et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse, kan manipuleres. Men for at opnå dette i humane embryonale stamceller via konventionel homolog rekombination er meget ineffektiv. Denne protokol beskriver målretning af hypofysen homeobox 3 (PITX3) locus i humane embryonale stamceller ved hjælp af specialdesignede zink-finger nukleaser, som introducerer stedspecifikke dobbeltstrenget DNA pauser, sammen med enPITX3 - EGFP-specifikke DNA-donor vektor. Efter genereringen af PITX3 reporter cellelinie, kan det derefter være differentieret anvendelse af offentliggjorte protokoller til anvendelse i undersøgelser som in vitro Parkinsons sygdom modellering eller celleerstatningsterapi.
Introduction
Aktuelle embryonale stamceller (ESC) differentiering protokoller resulterer i heterogene cellepopulationer, især med hensyn til afledning af specifikke neuronale fænotyper. Selv om kulturer indeholder den ønskede cellefænotypen andre neuronale, ikke-neuronal og un-opdelte celletyper er ofte til stede 1. Disse egenskaber begrænser anvendelsen af ESC afledte cellekilder til brug i celleerstatningsterapi og in vitro sygdomsmodeller.
Genetiske reporter cellelinjer giver et middel til at visualisere, spore og isolere celler af interesse, forudsat at ekspressionen af reporter protein (RP) gengiver endogen ekspression. Anvendelse af promotorer umiddelbart opstrøms for et gen kodende område kan anvendes til at udlede rå genetiske reportere, men sådanne konstruktioner mangler de præcise regulatoriske elementer, der styrer endogen genekspression. I modsætning hertil tilbyder homolog rekombinationmulighed for at sikre high-fidelity udtryk for RP. Tidligere har rettet i vektorer designet til homolog rekombination specifik loci af interesse er blevet anvendt til at målrette RP'er i mus ESC (mESCs) ved hjælp af elektroporation som et middel til DNA-levering 1,2. Men dannelsen af reporter cellelinjer via konventionel homolog rekombination er ekstremt ineffektiv for menneskerettighederne økonomiske og sociale råd (hESCs), og dermed er kun blevet dokumenteret i en håndfuld sager (revideret i 3). Ved at bruge et manipuleret kimære protein, der indeholder en fusion af en Fokl nuklease med stedspecifikke zink-finger motiver, kendt kollektivt som zink-finger nukleaser (ZFNs), kan indføres DNA dobbelt-strenget pauser på forudbestemte genomisk loci. Når der tilsættes en DNA-vektor med homologi til begge sider af DNA-dobbeltstreng pause, kan det genomiske sted repareres ved homolog rekombination, således at inkorporering af den DNA-donor sekvensen. Denne teknik har vist sig nyttig feller genomisk redigering i både humane primære celler 4,5 og hESCs 6,7. Nyere arbejde har udnyttet transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talens), transkriptionsfaktorer bruges af plantepatogener 8, for at hjælpe med udformningen af stedspecifikke nukleaser 9.
I det følgende protokol demonstrere vi frembringelsen af et embryonale reporter cellelinie ved elektroporering af en EGFP indeholdende homolog målretning vektor 6 sammen med ZFNs for menneskelige hypofyse homeobox 3 (PITX3) locus. Efter antibiotisk selektion i 2-3 uger, kan hESCs med korrekt integreret DNA manuelt plukkes, ekspanderet og indledningsvist screenet via PCR og efterfølgende godkendt af Southern blotting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer udføres i en steril laminær strømning. Alle medier og opløsninger ækvilibreres til 37 ° C, medmindre andet er angivet.
1. Udvidelse af menneskelige PSC (hESCs og hiPSCs, WA-09 i denne protokol) til transfektion
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at udvide hESCs på Matrigel eller Geltrex. hESCs ekspanderet på muse embryonale fibroblaster (MEF) kan anvendes til elektroporation eller nucleofection efter en MEF fjernelse trin (se afsnit 2.8).
- Klargør 1 x 100 mm skål og 1 x 75cm2 kolbe DR4 MEF'er på 2,0 x 10 4 celler pr cm2 i MEF medier (se tabel 1) på servicet præcoatet med 0,1% vægt / volumen gelatine.
Bemærk: CF1 kan BLK6 eller MF1 MEF'er anvendes, men det anbefales, at antibiotikaresistente MEF linier anvendes, fx DR410. - Den næste dag, passage hESCs ned på en 100 mm skål pre-belagt med MEF'er fremstillet i afsnit 1.1. For at gøre dette ASPIsats hESC medier fra kulturer skåle, vask hESCs med Ca2 + / Mg2 + -fri Hanks balanceret saltopløsning (HBSS), der tilsættes Dispase (se tabel 2 for passende mængder) og anbring i en fugtig inkubator ved 37 ° C / 5% CO 2. Efter 3-5 min inkubation aspireres Dispase og forsigtigt vaske 1 - 2 gange med HBSS at fjerne MEF. Tilføj hESC medier (se tabel 3) og ved hjælp af en celleskraber eller 5 ml pipette forsigtigt skrabe kolonier fra overfladen af dyrkningsskålen.
- Saml koloni fragmenter i suspension fra dyrkningsskålen i et 15 ml centrifugerør. Skyl dyrkningsskål med hESC medier og overførsel til 15 ml rør. Vær omhyggelig med ikke at bryde op klumper i enkelte celler eller små fragmenter.
- Centrifugeres i 5 minutter ved 160 xg til pelletering koloni fragmenter.
- Aspirer supernatanten. Tryk bunden af 15 ml rør med fingeren for at løsne koloni fragment pellet. Forsigtigt genopslæmme colony fragmenter i hESC medier efter delingsforholdet (normallya delt forholdet mellem 1: 4 og 1: 8 er relevant). Vær meget omhyggelig med ikke at gøre klumper i enkelte celler eller små fragmenter, da dette vil påvirke -genudpladning effektivitet.
- Forud for udpladning hESC fragmenter på MEF'er vask 1x med HBSS. Langsomt tilføje en passende mængde (se tabel 2) celle suspension indeholdende hESC fragmenter i hESC medier retter præ-belagt med MEF.
- Placer dyrkningsskåle på hylden i kuvøse og bevæge sig langsomt frem og tilbage og fra side til side for at fordele koloni fragmenter.
- Udskift hESC medier dagligt.
- For at forberede konditionerede medier fra MEF'er (MEF-CM) vask 75 cm 2 kolbe pre-belagt med MEF'er 1 x med HBSS. Tilføj hESC medier. Efter 24 timer, indsamle konditionerede medier og erstatte med frisk hESC medier. Gentag dagligt i højst 12 dage. Opbevar MEF-CM ved 4 ° C indtil brug.
2. Fremstilling af menneskelige økonomiske og sociale råd til transfektion
- Overhold væksten af hESCsunder et mikroskop dagligt. Når kolonier bliver 40-50% sammenflydende, plade 3 x 100 mm-skåle med 2,0 x 10 5 MEF'er per cm2.
- Når kolonier bliver 60-70% sammenflydende de er klar til at blive transficeret. »Groom kolonier ved at fjerne differentierede kolonier eller kolonier kerner.
Bemærk: Da vi tror på højere transfektion og målretning effektivitetsgevinster opstår, når cellerne er i vækst logaritmisk fase, foreslås det, at elektroporation udføres før hESCs nå ≥ 70% konfluens. - Vask hESC kolonier med HBSS og tilføje Accutase.
Bemærk: Det er ikke nødvendigt at pre-treat hESCs med ROCK inhibitor Y-27632 som tilstrækkeligt hæmning vil ske, når de inkuberes med Y-27632 under trin 2.7 - Der inkuberes i 10 - 20 minutter ved 37 ° C / 5% CO2, indtil kolonier er afsmeltet enkelte celler som ses under et mikroskop. Tritureres celler med en 1 ml pipette.
- Tilføj hESC medier og filter over i en 15 ml konisk rør ved hjælp af en 40 um celle strainer at fjerne celleklumper.
- Centrifugeres ved 160 xg i 5 minutter. Resuspender cellepelleten i frisk hESC medier og gentag for at fjerne alle rester Accutase løsning.
- Resuspender cellerne i hESC medier indeholdende 10 uM Y-27632 og overføre den samlede cellesuspension til en 100 mm skål pre-coatet med gelatine.
- Der inkuberes ved 37 ° C / 5% CO2 i mindst 30 minutter.
- I denne periode vil MEF klæbe til gelatine belagt skålen. Saml ikke-klæbende hESCs anvendelse af en 1 ml pipette i en frisk 15 ml centrifugerør og bestemme celledensitet ved hjælp af et hæmocytometer.
3. Elektroporation af hESCs
- Filter CM-MEF medier ved hjælp af et 0,22 um filter og tilsættes 10 ng / ml rekombinant human fibroblastvækstfaktor 2 (rhFGF2).
- Overfør 7,5 x 106 hESCs fra afsnit 2.9 til en ny 15 ml konisk rør og centrifugeres ved 160 xg i 5 minutter.
- I løbet af denne tid opsætte elektroporator: Vælg program for eksponentiel electroporation og indstil følgende parametre, Spænding: 250 V, kapacitet: 500 uF og Resistance: ∞-.
- Aspirere supernatanten og re-suspendere cellepelleten i 0,8 ml iskold 0,22 um filtreret HBSS. Opløsningen overføres til en steril 0,4 cm elektroporeringskuvette.
- Tilføj TV-hPITX3 frem målkonstruktion (30 ug DNA) og bland forsigtigt med en 200 gl pipette. Der inkuberes på is i 5 minutter. I løbet af denne tid fjerne en prøve af PITX3 ZFN mRNA og optøning på is. Når optøet overførsel 7.5 pi ZFN mRNA til DNA / celle blandingen i elektroporeringskuvette. Bland forsigtigt med en 200 gl pipette.
Bemærk: Det geometriske sted bliver målrettet er den vigtigste faktor, der bidrager til at målrette effektivitet. Loci kodning tavse gener, gener ikke udtrykkes i økonomiske og sociale råd, såsom PITX3 er vanskelige at målrette anvendelse af konventionel homolog rekombination 6. Således udnytter denne protokol specialdesignet ZFNs for den menneskelige PITX3 locus at fremkalde en DNA dobbelt streng Break. - Elektroporere ved at følge instruktionerne på skærmen på elektroporator.
- Ved hjælp af en 200 pi pipette overføres indholdet fra elektroporationskuvette til et 15 ml rør indeholdende 10 ml hESC medier. Vask kuvetten to gange med 200 pi hESC medier hver gang og overføres til en 15 ml rør. Der vil være "slim-lignende" vragrester bestående af DNA og protein fra de lyserede celler, som vil have en negativ indflydelse celle overlevelse. Centrifugeres ved 160 xg i 5 minutter for at fjerne dette snavs.
- Aspirere supernatanten og forsigtigt trykke cellepellet at løsne. Re-suspendere 30 ml suppleret MEF-CM indeholdende 10 uM Y-27632 og replate på 3 x 100 mm skåle preplated med MEF.
- Skift medierne dagligt. På dag 2, kan Y-27632 trækkes tilbage, og celler dyrket i kun hESC medier.
- Efter 2-3 dage blev hESCs bør være 50-70% sammenflydende. På dette tidspunkt begynder antibiotisk selektion (fx 0,5 ug / ml puromycin).
- Vedligehold selfdeling ved at tilføje frisk hESC / puromycin medier dagligt. Efter ~ 7 dage små kolonier skal være synlig. Hvis der ikke anvendes antibiotikaresistente MEF'er kan MEF'er suppleres med yderligere 1,0 x 10 4 celler pr cm2.
4. Picking Transgene hESC Clones
- Ca. 14 - 21 dage efter valg (når kolonier har nået ~ 1 mm i diameter) forberede plader for ekspansion og screening. Begynd med afrimning en portion af Matrigel eller Geltrex ved 4 ° C i mindst 5 timer. Fortynd pr producentens anvisninger og tilsæt 75 ul til hver brønd på 3 x 96 brønds-plader. Forbered 3 x 48 brønds-plader ved udpladning af MEF'er på 2,0 x 10 4 celler pr cm2. Inkubér begge plader O / N ved 37 ° C / 5% CO2.
- Den følgende dag dissekere kolonier i 16-25 stykker under anvendelse af en 21 G nål på enden af en 2 ml pipette ved at skære et gitter.
- Aspirer Matrigel fra plader med 96 brønde og erstatte med supplemteret CM-MEF medier. Vask MEF'er i 48-brønds plader 1 x med HBSS og add hESC medier.
- Ved hjælp af en 200 pi pipette forsigtigt overføre tredjedel af det dissekerede koloni i en 48-brønds plade til ekspansion. Overfør anden 2/3 af dissekeret koloni til en tilsvarende 96-brønds plade indeholdende suppleret CM-MEF medier.
- Oprethold begge plader ved at ændre mediet dagligt (suppleret CM-MEF medier i 96-brønds Matrigel coatede plader og hESC medier i 48-brønds plader indeholdende MEF'er, begge suppleret med 0,5 ug / ml puromycin).
- Expand indtil 96-brønds plader er 100% sammenflydende og derefter indledningsvis screening via PCR.
5. Screening og Udvidelse af positive kloner
- For at forberede genomisk DNA (metode baseret på 11) Fjern alle medier fra pladerne ved at vende, så skamplet på papirservietter.
- Skyl hver godt to gange med RT PBS (100 ul / brønd hver vask), invertsukker og skamplet som for trin 5.1. Place plader ved -80 ° C feller 1 - 2 timer til støtte i celle lysis (plader kan gemmes på ubestemt tid som dette).
- Mens cellerne er ved -80 ° C gøre Sarcosyl Lysis Buffer (se tabel 4) (50 ul / brønd). At lysere celler, varme plader i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter afpipetteres lyseringsbuffer til hver brønd. Seal kanter af hver plade med tape, sted i en forseglet beholder indeholdende fugtige papirservietter til at skabe fugt og inkuberes O / N ved 60 ° C.
- Efter inkubation tilsættes 150 pi 5M NaCI til 10 ml -20 ° C absolut ethanol, bland godt, og der tilsættes 100 ul til hver brønd (Bemærk: ethanol vil gå uklar, når der tilsættes NaCl). Tryk plader forsigtigt for at blande (ikke pipette) og henstår i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. I løbet af denne tid opløsningen vil gå klar og DNA'et udfældes.
- Fjern opløsning som i trin 5.1 derefter tilsættes 150 pi af 70% ethanol til hver brønd. Vend forsigtigt pladen rundt og duppes som før. Gentag dette trin yderligere 2x.
Bemærk: Da det udfældede DNA naturligt adheres til vævskulturplast den ikke løsner sig under disse vasketrin.) - Efter den sidste vask kort centrifuge plader ved tophastighed at koncentrere DNA til bunden af hver brønd derefter lufttørre ved stuetemperatur (eller 37 ° C) i mindst 30 minutter.
- Tilføj 40 - 50 ul T0.1E (pH 8,0) (se tabel 5), eller TE (pH 8,0) til hver brønd og placere pladerne ved 65 ° C i 1 time eller ved 4 ° CO / N før de anvendes til PCR. Resuspender DNA ved forsigtigt at banke de sider af pladen. Brug 1-2 ul resuspenderede DNA / 10 pi PCR-reaktion.
- Med Expand Long Template PCR-systemet med hPITX3 L arm gen. F og hPITX3 L arm GFP R primere udføre indledende screening af kloner ved 58 ° C annealing 45 sek forlængelse, 35 cyklusser.
- Elektroforesér prøver med Hyperladder 1Kb i en 1% agarosegel indeholdende GelRed ved 100 V i 45 min og detektere positive kloner via UV-belysning.
- Godkend PCR positive kloner ved fordøjelse af genomisk DNA fra expaerdraget kloner (se nedenfor) med HindIII og hybridiserende prober 5 'og 3' af vektor homologiarmene til et Southern-blot (som tidligere beskrevet i 1). Prober genereret ved PCR under anvendelse af primerpar hPITX3 5'sonde F og R, og hPITX3 3 'probe F og R, spaltet med EcoRI og ligeret ind i en generel kloningsvektor.
- Afhængig af antallet af positive kloner, forberede to brønde i en 6-brønds plade ved præ-plettering med MEF'er (2,0 x 10 4 celler pr cm 2).
- Den næste dag forbehandle positive kloner i 48-brønds plade med 10 pM Y-27632 i mindst 1 time.
- Vask positive kloner med HBSS, og der tilsættes 300 pi Accutase.
- Når kolonier gengives enkelte celler, tilsættes 1 ml hESC medier og samle ind i et 15 ml rør.
- Skift medierne dagligt. På dag 2, kan Y-27632 trækkes tilbage, og celler dyrket i embryonale medier.
- Når kolonier er 70 - 80% sammenflydende, subkultur og fryse resten af coloventuelle fragmenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter co-elektroporation af specialdesignede PITX3 zink-finger parret sammen med PITX3 - EGFP-specifikke DNA-donorvektoren og efterfølgende puromycin selektion blev positive hESC kloner initialt detekteret via genomisk PCR-screening (figur 1). Southern blot hybridisering af disse PCR positive kloner med 5 'og 3' specifikke prober bekræftede korrekt målretning til exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en effektivitet på 19%. Immunfluorescens billeder vist i figur 3 demonstrere EGFP-ekspression drevet af PITX3 promotoren efter differentiering ved hjælp af en offentliggjort PA6 stromal celledifferentiering protokol 12,13. Co-lokalisering af EGFP kunne observeres med markører for mesencephale dopaminerge neuroner såsom FOXA2 (rød) (figur 3A) og tyrosinhydroxylase (TH, rød) (figur 3B), medens vigtigere ingen co-lokalisering c Ould iagttages med det GABAergic markering, gamma-aminosmørsyre (GABA; rød) (Figur 3C).
Figur 1. Indledende genomisk PCR-screening. Efter koloni plukning og ekspansion, foreløbig genomisk PCR-screening påvist talrige positive kloner som vist ved PCR-produktet (bånd ved 984 bp). (Kloner blev screenet under anvendelse af primere hPITX3 L arm gen. F, som ligger lige uden for den venstre målretning armen og hPITX3 L arm GFP R, som er beliggende inden EGFP-genet.) Højre og venstre side baner er en 1 kb stigen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Validering af EGFP målretning til hPITX3 locus ved hjælp af zink finger nucleaser i hESCs. (A) Skematisk af Southern blot anvendte strategi til at validere målretning. Toppanelet skematiske illustrerer den indfødte hPITX3 locus før målretning. Den nederste panel skematiske viser hPITX3 locus efter korrekt isætning af EGFP transgen. De røde linjer under hvert panel illustrerer de steder, hvor de 5 'og 3' Southern blot sonder vil binde, og svarer til de bands i figur 2B. (B) Repræsentant Southern blot korrekt målrettede kolonier udvalgt fra PCR pre-screening. Forkortelser: EGFP forbedret grønt fluorescerende protein; PGK-, menneske phosphoglycerolkinase promotor; PURO puromycin resistensgen. Andre funktioner: loxP steder, lilla; polyadenyleringssekvens, blue, hPITX3 exons, orange. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. hPITX3-EGFP hESCs differentieret under PA6 / LSB / SAG / FGF8 betingelser. Immunfluorescerende billeder af EGFP mærket med (A) FOXA2 (rød), (B) TH (rød) og (C) GABA (rød). Modfarvet med DAPI (blå). Scales barer, 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Efter co-elektroporation af specialdesignede PITX3 zink-finger parret sammen med PITX3 - EGFP-specifikke DNA-donoren vektoren og efterfølgende puromycin-udvælgelse, positive hESC kloner blev initialt detekteret via genomisk PCR-screening (Figur 1). Southern blot hybridisering af disse PCR positive kloner med 5 'og 3' specifikke prober bekræftede korrekt målretning til exon 1 i PITX3 locus (figur 2), med en effektivitet på 19%. Immunfluorescens billeder vist i figur 3 demonstrere EGFP-ekspression drevet af PITX3 promotoren efter differentiering ved hjælp af en offentliggjort PA6 stromal celledifferentiering protokol 12,13. Co-lokalisering af EGFP kunne observeres med markører for mesencephale dopaminerge neuroner såsom FOXA2 (rød) (figur 3A) og tyrosinhydroxylase (TH, rød) (figur 3B), medens vigtigere ingen co-lokalisering kunne iagttages med det GABAerge markør , gamma-aminosmørsyre (GABA; rød) (Figur 3C).
Indholdsproduktion "FO: keep-together.within-page =" altid ">Figur 1. Indledende genomisk PCR-screening. Efter koloni plukning og ekspansion, foreløbig genomisk PCR-screening påvist talrige positive kloner som vist ved PCR-produktet (bånd ved 984 bp). (Kloner blev screenet under anvendelse af primere hPITX3 L arm gen. F, som ligger lige uden for den venstre målretning armen og hPITX3 L arm GFP R, som er beliggende inden EGFP-genet.) Højre og venstre side baner er en 1 kb stigen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Validering afEGFP målretning mod hPITX3 locus ved hjælp af zinkfinger nukleaser i hESCs. (A) Skematisk af Southern blot anvendte strategi til at validere målretning. Toppanelet skematiske illustrerer den indfødte hPITX3 locus før målretning. Den nederste panel skematiske viser hPITX3 locus efter korrekt isætning af EGFP transgen. De røde linjer under hvert panel illustrerer de steder, hvor de 5 'og 3' Southern blot sonder vil binde, og svarer til de bands i figur 2B. (B) Repræsentant Southern blot korrekt målrettede kolonier udvalgt fra PCR pre-screening. Forkortelser: EGFP forbedret grønt fluorescerende protein; PGK-, menneske phosphoglycerolkinase promotor; PURO puromycin resistensgen. Andre funktioner: loxP steder, lilla; polyadenyleringssekvens, blå, hPITX3 exoner, orange. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3. hPITX3-EGFP hESCs differentieret under PA6 / LSB / SAG / FGF8 betingelser. Immunfluorescerende billeder af EGFP mærket med (A) FOXA2 (rød), (B) TH (rød) og (C) GABA (rød). Modfarvet med DAPI (blå). Scales barer, 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Stof | ml / 100 ml | Katalog Nr (Leverandør) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Kalvefosterserum | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tabel 1.
| Komponent | 100 mm skål | 60 mm skål | 6-brønds | 48-brønds | 96-brønds | 75cm 2 kolbe |
| HBSS | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Accutase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Dispase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | - | - | - |
| hESC medier | 10 ml | 6 ml | 3 ml | 0,5 ml | 0,2 ml | 15 ml |
| Matrigel | - | - | - | - | 0,1 ml | - |
Tabel 2.
| Stof | ml / 100 ml | Katalog Nr (Leverandør) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| Glutamax | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| SS-mercaptoethanol | 0.1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [endelig] | 233-FB-025 / CF (F & D Systems) |
| Stof | Koncentration | Katalog Nr (Leverandør) |
| N-lauroylsarcosin-natriumsalt-opløsning (Sarcosyl) | 0,5% (w / v) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10.0 mm | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10.0 mm | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-CI (pH 7,5) | 10.0 mm | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinase K | 1,0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Australien) |
Tabel 4.
| Stof | Koncentration | Katalog Nr (Leverandør) |
| Tris-CI (pH 8,0) | 10.0 mm | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH 8,0) | 0,1 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tabel 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dannelsen af reporter cellelinjer giver et stærkt middel til at spore, visualisere og isolere celler af interesse fra en heterogen population afledt fra hESCs. Imidlertid har genmålretning via konventionel homolog rekombination vist sig at være særdeles ineffektiv for menneskerettighederne økonomiske og sociale råd 3. I denne protokol beskriver vi en forholdsvis simpel teknik til at indføre en RP i exon en af PITX3 locus i hESCs med en gængs målvektor sammen med ZFNs. I vores hænder genet målretning systemet er effektivt, med 19% af puromycin-resistente kloner indeholdende en korrekt målrettet PITX3 locus (svarende til den tidligere offentliggjorte 6).
En begrænsning med hjælp ZFNs at lette målretning genet er vanskeligheden ved at designe ZFNs fra bunden i huset. Således i denne protokol vi brugte Custom designet kommercielt tilgængelige ZFNs, som kan være dyrt at erhverve. & #160; Mere for nylig har Talen systemet blevet anvendt til gen-targeting ved anvendelse af homolog rekombination 9. Anvendelsen af TALENS reducerer omkostningerne til gen redigering og kan udformes i huset, fremskynde processen. Selv om det ikke udtrykkeligt er påvist i denne undersøgelse, kan denne protokol er let ændret til at omfatte brugen af TALENS den metode, er den samme, bortset fra Talen plasmider der anvendes i trin 3.5 i stedet for ZFN mRNA, som vist i 9.
Når du bruger denne teknik er det bydende nødvendigt at sikre, at hPSCs er i vækst log fase (fx kulturer er ikke 70% eller derover sammenflydende). Vi mener, at dette er kritisk, da det plasmid får adgang til kernen følgende fordeling nukleare kuvert under celledeling. Desuden vil DNA donorvektoren kun inkorporere i DNA efter DNA-syntesen, da denne proces udnytter homologi-dirigeret reparation under deling at indarbejde donor-DNA igenom.
En anden potentiel begrænsning med ZFN metode er indføringen af DNA bryder andre steder i genomet. Selvom Southern-hybridisering med ekstern 5 'og 3' sonder registrerer korrekt integration vil det ikke afsløre yderligere integration begivenheder eller fejlbehæftet reparation andetsteds i genomet. Ekstra integration arrangementer kan undersøges ved Southern hybridisering ved anvendelse af vektor-specifikke prober (f.eks EGFP), mens off-target spaltning af ZFN parrene kan påvises ved hjælp af SELEX 3,6.
Selvom vi ikke observere nogen åbenlyse effekter i udviklingen af midthjernen dopaminerge neuroner, som direkte kan henføres til inaktivering af en PITX3 gen, forskere huske på, at enhver målrettet begivenhed, hvor en kopi af et gen er forstyrret, kan være til skade for udvikling af denne celle, og bør tage hensyn til dette, når man analyserer resultaterne. Hvorvidt dette er tilfældet, afhænger i høj gradpå det gen, der målrettet og kan kun bestemmes ved at udføre eksperimentet.
Ved hjælp af en PA6 differentiering protokol 12,13 var vi i stand til at bekræfte troskab af reportersystem ved immunfluorescens (figur 3) og qPCR analyse af EGFP positive versus negative populationer efter fluorescens-cellesortering (data ikke vist). Som PITX3 er en transkriptionsfaktor, der er specifikke for midthjernen dopaminerge neuroner 14, vil manipulation af en human PITX3 reporter cellelinie lette brugen af PITX3 + midthjernen dopaminerge neuroner afledt fra hESCs i undersøgelser af enten in vitro PD modellering eller celleerstatningsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Arbejdet er beskrevet i denne protokol blev muliggjort af støtte fra den victorianske regering som en del af et samarbejde alliance med den californiske Institut for regenerativ medicin (CIRM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W. Extended periods of neural induction and propagation of embryonic stem cell-derived neural progenitors with EGF and FGF2 enhances Lmx1a expression and neurogenic potential. Neurochemistry International. 59 (3), 394-403 (2011).
- Collin, J., Lako, M. Concise review: putting a finger on stem cell biology: zinc finger nuclease-driven targeted genetic editing in human embryonic stem cells. Stem Cells. 29 (7), 1021-1033 (2011).
- Carroll, D. Progress and prospects: zinc-finger nucleases as gene therapy agents. Gene Therapy. 15 (22), 1463-1468 (2008).
- Urnov, F. D., et al. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435 (7042), 646-651 (2005).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iESCs using zinc-finger nucleases. Nature Biotechnology. 27 (9), 851-857 (2009).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nature Biotechnology. 25 (11), (2007).
- Boch, J., Bonas, U. Xanthomonas AvrBs3 family-type III effectors: discovery and function. Annual Review of Phytopathology. 48, 419-436 (2010).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human embryonic cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Tucker, K. L., Wang, Y., Dausman, J., Jaenisch, R. A transgenic mouse strain expressing four drug-selectable marker genes. Nucleic Acids Research. 25 (18), 3745-3746 (1997).
- Ramírez-Solis, R., Rivera-Pérez, J., Wallace, J. D., Wims, M., Zheng, H., Bradley, A. Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples. Analytical Biochemistry. 201 (2), 331-335 (1992).
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28 (1), 31-40 (2000).
- Denham, M., Thompson, L. H., Leung, J., Pébay, A., Björklund, A., Dottori, M. Gli1 is an inducing factor in generating floor plate progenitor cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 28 (10), 1805-1815 (2010).
- Smidt, M. P., et al. A homeodomain gene Ptx3 has highly restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 94, 13305-13310 (1997).
Tags
Molekylærbiologi Elektroporation humane embryonale stamceller genom redigering reporter cellelinie midthjernen dopaminerge neuroner View Video
Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.
