Summary
Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse aus heterogenen Populationen. Jedoch Gen-Targeting unter Verwendung von herkömmlichen homologen Rekombination in embryonalen Stammzellen äußerst ineffizient. Hier beschreiben wir Targeting ZNS Mittelhirn spezifischen Transkriptionsfaktor PITX3 Ortes mit EGFP mit Zink-Finger-Nuklease verbesserte homologe Rekombination.
Abstract
Eine große Einschränkung mit den aktuellen menschlichen embryonalen Stammzellen (ESC) Differenzierungsprotokollen ist die Erzeugung von heterogenen Zellpopulationen. Diese Kulturen enthalten die Zellen von Interesse, sondern auch mit undifferenzierten WSR nichtneuralen Derivaten und anderen neuronalen Subtypen verunreinigt. Dies beschränkt ihre Verwendung in in vitro-und in vivo-Anwendungen, beispielsweise in vitro-Modellierung für die Arzneimittelentdeckung oder Zellersatztherapie. Zur Überwindung dieser, Reporterzelllinien, die ein Mittel zur Visualisierung, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse anbieten, können entwickelt werden. Um dies jedoch in menschlichen embryonalen Stammzellen zu erreichen über konventionellen homologen Rekombination ist äußerst ineffizient. Dieses Protokoll beschreibt Targeting der Hypophyse Homöobox 3 (PITX3) Locus in menschlichen embryonalen Stammzellen mit maßgeschneiderten Zink-Finger-Nukleasen, die ortsspezifische DNA-Doppelstrangbrüche vorstellen, zusammen mit einemPITX3 - EGFP-spezifischen DNA-Donor-Vektor. Nach der Erzeugung des PITX3 Reporterzelllinie kann dann unter Verwendung veröffentlichter Protokolle für die Verwendung in Studien unterschieden werden, wie in vitro-Parkinson-Krankheit Modellierung oder Zellersatztherapie.
Introduction
Strom embryonalen Stammzellen (ESC) Differenzierungsprotokollen führen in heterogenen Zellpopulationen, insbesondere hinsichtlich der Ableitung von spezifischen neuronalen Phänotypen. Obwohl Kulturen enthalten die gewünschte Mobil Phänotyp, andere neuronale, sind nicht-neuronalen und un-differenzierten Zelltypen häufig vorhanden 1. Diese Eigenschaften beschränken die Anwendung der ESC abgeleiteten Zellquellen für Zellersatztherapie und in vitro-Krankheitsmodelle.
Genetische Reporterzelllinien bieten ein Mittel, um zu visualisieren, zu verfolgen und zu isolieren Zellen von Interesse, vorausgesetzt, dass die Expression des Reporterproteins (RP) reproduziert endogene Expression. Verwendung von Promotoren, die unmittelbar stromaufwärts von einem Gen kodierende Region kann verwendet werden, um rohe genetische Reporter abgeleitet werden, sondern solche Konstrukte fehlen die genaue regulatorische Elemente, die endogene Genexpression zu steuern. Im Gegensatz dazu bietet der homologen RekombinationMöglichkeit, High-Fidelity-Expression des RP zu gewährleisten. In der Vergangenheit Targeting-Vektoren für die homologe Rekombination an bestimmten Loci von Interesse entworfen wurden zur RPs in Maus WSR (mESCs) Ziel unter Verwendung von Elektroporation als Mittel zur DNA-Abgabe 1,2. Doch die Generation der Reporterzelllinien über herkömmliche homologen Rekombination ist extrem ineffizient für den menschlichen WSR (hES-Zellen) und damit nur in einer Handvoll von Fällen (3 Bewertung) dokumentiert. Durch die Verwendung eines manipulierten chimären Protein, das eine Fusion eines FokI Nukleaseaktivität mit ortsspezifischen Zinkfingermotiven, die zusammen als Zinkfinger-Nucleasen (ZFNs) bekannt ist, DNA-Doppelstrangbrüche können an vorbestimmten Loci eingeführt werden. Wenn ein DNA-Vektor mit Homologie zu beiden Seiten des DNA-Doppelstrangbruch zugesetzt wird, kann die genomische Stelle durch homologe Rekombination repariert werden, so dass der Einbau der DNA-Donor-Sequenz. Diese Technik hat sich als nützlich erwiesen foder genomische Bearbeitung sowohl in primären humanen Zellen 4,5 und 6,7 HES. Neuere Arbeiten genutzt hat Transkriptionsaktivator-wie Effektor Nukleasen (Talens), Transkriptionsfaktoren durch Pflanzenpathogene verwendet 8, bei der Gestaltung von standortspezifischen Nukleasen 9 unterstützen.
In dem folgenden Protokoll zeigen wir die Erzeugung einer HES-Reporterzelllinie durch Elektroporation eines EGFP enthaltende homologe Zielvektor 6 zusammen mit ZFNs der menschlichen Hypophysen-Homeobox-3 (PITX3) Locus. Nach Antibiotika-Selektion für 2-3 Wochen kann mit hES richtig integriert DNA manuell abgeholt werden, erweitert und gesiebt zunächst über PCR und anschließend durch Southern Blotting validiert.
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Protocol
Alle Verfahren werden in einer sterilen Laminar Flow durchgeführt. Alle Medien und Lösungen werden auf 37 ° C äquilibriert, sofern nicht anders angegeben.
1. Erweiterung des menschlichen PSCs (hES-Zellen und hiPSCs, WA-09 in diesem Protokoll verwendet wird) für die Transfektion
Hinweis: Es ist nicht notwendig, auf hES Matrigel oder Geltrex erweitern. hES auf embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) erweitert werden kann, für die Elektroporation oder Nukleofektion nach einer MEF-Entfernungsstufe verwendet werden (siehe Abschnitt 2.8).
- Vorbereitung 1 x 100-mm-Schale und 1 x 75cm2 Kolben DR4 MEFs auf 2,0 x 10 4 Zellen pro cm 2 in MEF Medium (siehe Tabelle 1) auf Platten mit 0,1% w / v Gelatine vorbeschichtet.
Hinweis: CF1, BLK6 oder MF1 MEFs verwendet werden, jedoch empfiehlt es sich, Antibiotika-resistenten MEF Leitungen verwendet werden, beispielsweise DR410. - Am nächsten Tag, Passage hES auf eine 100-mm-Schale mit MEFs in Abschnitt 1.1 vorbereiteten, überzogen. Um dieses zu tun ASPIRate hESC Medien aus Kulturen Geschirr, waschen hES mit Ca2 + / Mg2 + -freie Hanks 'Salzlösung (HBSS), fügen Dispase (siehe Tabelle 2 angemessenen Mengen) und in einem befeuchteten Brutschrank bei 37 ° C / 5% CO 2. Nach 3-5 min Inkubation aspirieren Dispase und vorsichtig waschen 1-2 mal mit HBSS auf MEFs entfernen. Fügen hESC Medien (siehe Tabelle 3) und mit einem Zellschaber oder 5 ml Pipette vorsichtig abkratzen die Kolonien von der Oberfläche der Kulturschale.
- Sammeln Sie die Bruchstücke Kolonie in Suspension von der Kulturschale in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Kulturschale mit hESC Medien und Transfer zum 15-ml-Tube. Seien Sie vorsichtig, um nicht brechen Klumpen in einzelne Zellen oder kleine Fragmente.
- Zentrifuge 5 min bei 160 × g pelletiert Kolonie Fragmente.
- Überstand wird abgesaugt. Tippen Sie unten auf 15-ml-Tube mit dem Finger zu Kolonie Fragment Pellet zu lösen. Vorsichtig resuspendieren Kolonie Fragmente in hESC Medien nach Split-Verhältnis (normallya Aufteilungsverhältnis zwischen 1: 4 und 1: 8 angebracht ist). Seien Sie äußerst vorsichtig, nicht zu Klumpen in einzelne Zellen oder kleine Fragmente, da dies machen beeinflussen Neubelegung Effizienz.
- Vor der Neubelegung hESC-Fragmente auf MEFs waschen 1x mit HBSS. Langsam eine entsprechende Menge (siehe Tabelle 2) der Zellsuspension, die hES-Fragmente in hESC Medien, Gerichte mit MEFs vorgestrichen.
- Zeigen Kulturschalen auf Regal im Inkubator und bewegen sich langsam hin und her und her, um gleichmäßig zu verteilen Kolonie Fragmente.
- Ersetzen hESC Medien täglich.
- Um konditionierten Medien von MEF (MEF-CM) vorbereiten waschen die 75 cm 2-Kolben mit MEFs 1 x mit HBSS vorgestrichen. Fügen hESC Medien. Nach 24 Stunden, sammeln konditionierten Medien und ersetzen mit frischen hESC Medien. Wiederholen täglich für maximal 12 Tage. Speichern MEF-cm bei 4 ° C, bis sie benötigt.
2. Vorbereitung der Menschen WSR für die Transfektion
- Beobachten das Wachstum von hESunter dem Mikroskop täglich. Wenn Kolonien werden 40-50% konfluent, Platte 3 x 100-mm-Schalen mit 2,0 x 10 5 MEFs pro cm 2.
- Wenn Kolonien werden bei 60 - 70% konfluent sind sie bereit, transfiziert werden. 'Bräutigam' Kolonien, indem differenzierte Kolonien oder Kolonie Kerne.
Hinweis: Da wir glauben, dass höhere Transfektion und Targeting-Effizienz auf, wenn Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase, wird vorgeschlagen, dass die Elektroporation durchgeführt werden, bevor hES erreichen ≥ 70% Konfluenz. - Waschen hESC Kolonien mit HBSS und fügen Accutase.
Hinweis: Es ist nicht notwendig, vor der Behandlung mit hES ROCK-Inhibitor Y-27632 als ausreichend Hemmung tritt auf, wenn mit Y-27632 während der Stufe 2,7 inkubiert - Inkubation für 10 - 20 min bei 37 ° C / 5% CO 2, bis Kolonien gemacht einzelnen Zellen unter einem Mikroskop betrachtet. Man reibt Zellen mit einer 1 ml Pipette.
- Fügen hESC Medien und Filter in eine 15 ml konischen Röhrchen mit einer 40 um Zell Strainer, um Zellklumpen zu entfernen.
- Zentrifuge bei 160 × g für 5 min. Resuspendieren Zellpellet in frischem hESC Medien und wiederholen, um jegliche Rest Accutase Lösung zu entfernen.
- Die Zellen in hESC Medien mit 10 uM Y-27632 und übertragen die gesamte Zellsuspension auf eine 100-mm-Schale mit Gelatine vor-beschichtet.
- Bei 37 ° C / 5% CO 2 für mindestens 30 min.
- Während dieser Zeit wird MEFs auf die Gelatine beschichtete Schale haften. Sammeln Sie nicht haft hES mit einer 1 ml-Pipette in ein frisches 15 ml-Zentrifugenröhrchen und bestimmen die Zelldichte mit einer Zählkammer.
3. Elektroporation von hES
- Filter CM-MEF Medien mit einem 0,22 um Filter hinzuzufügen und 10 ng / ml rekombinanten humanen Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (rhFGF2).
- 7,5 x 106 übertragen hES aus Abschnitt 2.9 zu einem neuen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 160 xg für 5 min.
- Während dieser Zeit die Elektroporator gesetzt: Wählen Sie das Programm für die exponentielle electroporation und stellen Sie die folgenden Parameter, Spannung: 250 V, Kapazität: 500 uF, und Widerstand: ∞-.
- Saugen Sie den Überstand und resuspendieren Zellpellet in 0,8 ml eiskaltem HBSS 0,22 um filtriert. Die Lösung wird in einer sterilen 0,4 cm Elektroporationsküvette.
- TV-fügen hPITX3-Forward-Targeting-Konstrukt (30 ug DNA) und vorsichtig mit einer Pipette 200 ul. Inkubieren auf Eis für 5 min. Während dieser Zeit entfernen Sie eine aliquote Menge PITX3 ZFN mRNA und auf Eis auftauen. Wenn in Elektroporationsküvette taut Transfer 7,5 ul der ZFN-mRNA, DNA / Zellgemisch. Vorsichtig mischen mit 200 ul Pipette.
Anmerkung: Die Ortskurve abgezielt ist der wichtigste Faktor, um Targeting Effizienz beiträgt. Loci Codierung stille Gene, Gene nicht in WSR ausgedrückt, wie PITX3 sind schwer zu zielen mit herkömmlichen homologe Rekombination 6. So nutzt dieses Protokoll speziell für das menschliche PITX3 Ort konzipiert ZFNs einen DNA-Doppelstrang b induzierenreak. - Elektroporieren, indem Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm auf der Elektroporator.
- Mit einem 200 ul Pipette übertragen Sie die Inhalte aus der Elektroporationsküvette zu einem 15-ml-Tube mit 10 ml HES-Medien. Zweimal waschen Sie die Küvette mit 200 ul hESC Medien jedes Mal und in ein 15-ml-Tube. Es wird "Schleim-wie" Schutt, bestehend aus DNA und Protein aus den lysierten Zellen, die sich negativ auf die Zellüberlebens. Zentrifuge bei 160 × g für 5 min auf diese Ablagerungen zu entfernen.
- Saugen Sie den Überstand und klopfen Sie leicht Zellpellet zu lockern. Re-suspend in 30 ml ergänzt MEF-CM mit 10 uM Y-27632 und Ausstrich auf 3 x 100 mm Gerichte mit MEFs vorplattiert.
- Ändern Sie die Medien täglich. An Tag 2, Y-27632 entnommen und in Zellen nur HES Medien gezüchtet.
- Nach 2-3 Tagen werden die HES-Zellen sollten 50-70% konfluent sein. An diesem Punkt beginnen Antibiotika-Selektion (zB 0,5 g / ml Puromycin).
- Pflegen selReflexion durch Zugabe von frischem hESC / Puromycin Medien täglich. Nach ~ 7 Tage sollten kleine Kolonien sichtbar sein. Wenn Antibiotika resistenten MEFs nicht verwendet werden, können MEFs durch Hinzufügen eines zusätzlichen 1,0 x 10 4 Zellen pro cm 2 ergänzt werden.
4. Heben Transgene hESC Clones
- Ca. 14 - 21 Tage nach Auswahl (wenn Kolonien ~ 1 mm Durchmesser erreicht) vorzubereiten Platten für Expansion und Screening. Beginnen durch Auftauen eines Aliquots von Matrigel oder Geltrex bei 4 ° C für mindestens 5 Stunden. Verdünnen nach den Anweisungen des Herstellers, und fügen Sie 75 ul in jede Vertiefung der 3 x 96-Well-Platten. Vorbereitung 3 x 48-Well-Platten durch Plattieren MEFs auf 2,0 x 10 4 Zellen pro cm 2. Beide Platten O / N bei 37 ° C / 5% CO 2.
- Am folgenden Tag sezieren Kolonien in 16-25 Stücke unter Verwendung einer 21 G-Nadel am Ende einer 2-ml-Pipette, indem ein Raster.
- Absaugen Matrigel von 96-Well-Platten und ersetzen mit Nachtrtierten CM-MEF Medien. Wasch MEFs in 48-Well-Platten 1 x mit HBSS und fügen hESC Medien.
- Mit einer 200 ul Pipette vorsichtig übertragen 3.1 des seziert Kolonie in eine 48-Well-Platte für die Expansion. Übertragen die anderen zwei Drittel der Kolonie präpariert in eine entsprechende 96-Well-Platte, die ergänzt CM-MEF Medien.
- Halten beide Platten durch Veränderung der Medien täglich (ergänzt CM-MEF Medien für 96-Well-Platten und Matrigel beschichtet hESC Medien für 48-Well-Platten, die MEFs, beide mit 0,5 g / ml Puromycin ergänzt).
- Erweitern bis 96-Well-Platten zu 100% konfluent und dann zunächst mittels PCR zu screenen.
5. Screening und Ausbau von positiven Klonen
- Zur Vorbereitung der genomischen DNA (Methode basierend auf 11) entfernen Sie alle Medien aus Platten durch Umdrehen, dann auf Küchenpapier tupfen.
- Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit RT PBS (100 ul / jeder Wäsche), umdrehen und Blot wie für Schritt 5.1. Ort Platten bei -80 ° C foder 1-2 Stunden in Zell-Lyse zu unterstützen (kann auf unbestimmte Zeit Platten wie diese gespeichert werden).
- Während Zellen bei -80 ° C machen Sarcosyl Lysepuffer (siehe Tabelle 4) (50 ul / Vertiefung). Um Zellen, warme Platten Lyse für 5 min bei RT dann Pipette Lyse-Puffer in jedes Well. Die Ränder jeder Platte mit Band, in einen dicht verschließbaren Behälter mit feuchten Papiertüchern Luftfeuchtigkeit zu schaffen, und Inkubation O / N bei 60 ° C.
- Nach Inkubation mit 150 ul 5 M NaCl auf 10 ml von -20 ° C absolutem Ethanol, gut mischen und mit 100 ul in jede Vertiefung (Hinweis: Ethanol gehen bewölkt wenn NaCl hinzugefügt). Tippen Platten sanft zu mischen (nicht Pipette) und lassen für mindestens 30 min bei RT. Während dieser Zeit wird die Lösung gehen klar und die DNA auszufällen.
- Entfernen Lösung, wie in Schritt 5.1, dann mit 150 ul 70% igem Ethanol zu jeder Vertiefung. Invertieren Platte sanft und tupfen Sie wie zuvor. Wiederholen Sie diesen Schritt eine weitere 2x.
Hinweis: Da das ausgefallene DNA natürlich Adheres auf die Gewebekultur Kunststoff es wird nicht bei diesen Waschschritten verrutschen.) - Nach dem letzten Waschen kurz zentrifugieren Platten mit höchster Geschwindigkeit die DNA auf den Boden jeder Vertiefung dann luftgetrocknet bei Raumtemperatur (oder 37 ° C) für mindestens 30 Minuten zu konzentrieren.
- Fügen 40-50 ul T0.1E (pH 8,0) (siehe Tabelle 5) oder TE (pH 8,0) in jede Vertiefung und Ort Platten bei 65 ° C für 1 h oder bei 4 ° CO / N vor der Verwendung für die PCR. Resuspendieren DNA durch leichtes Antippen der Seiten der Platte. Verwenden Sie 1-2 ul resuspendierten DNA / 10 ul PCR-Reaktion.
- Verwendung des Expand Long Template PCR System mit hPITX3 L Arm gen. F und L hPITX3 Arm GFP R Primer durchzuführen erste Screening der Klone bei 58 ° C Annealing, 45 sec Verlängerung, 35 Zyklen.
- Elektrophorese-Proben mit Hyperladder 1kb in einem 1% Agarose-Gel, das bei 100 V für 45 min GelRed und Erkennung von positiven Klonen durch UV-Beleuchtung.
- Validieren PCR positiven Klone durch Verdauen von genomischer DNA aus EXPANDED Klonen (siehe unten) mit HindIII und Hybridisierungssonden 5 'und 3' der Vektor Homologiearme auf einem Southern-Blot (wie zuvor in 1 beschrieben). Sonden durch PCR unter Verwendung von Primerpaaren hPITX3 5'-Sonde F und R, und hPITX3 3 'Sonde F und R, mit EcoRI verdaut und in einem allgemeinen Klonierungsvektor ligiert.
- Abhängig von der Anzahl von positiven Klonen, Herstellung von 2 Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen von Vor-Galvanisieren mit MEFs (2,0 x 10 4 Zellen pro cm 2).
- Am nächsten Tag vorzubehandeln positive Klone im 48-Well-Platte mit 10 uM Y-27632 für mindestens 1 Stunde.
- Waschen positive Klone mit HBSS und 300 ul Accutase.
- Wenn Kolonien werden einzelne Zellen gemacht, 1 ml der hESC Medien und sammeln in einen 15-ml-Tube.
- Ändern Sie die Medien täglich. An Tag 2, Y-27632 entnommen und in Zellen HES Medien gezüchtet.
- Wenn Kolonien sind 70-80% konfluent, Subkultur und frieren den Rest der Colony Fragmente.
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Representative Results
Nach Co-Elektroporation von dem individuell gestalteten PITX3 Zinkfinger-Paar zusammen mit der PITX3 - EGFP-spezifischen DNA-Donor-Vektor und anschließende Puromycin Selektion wurden positive Klone hESC zunächst über genomische PCR-Screening (Abbildung 1) nachgewiesen. Southern-Blot-Hybridisierung dieser PCR-positiven Klone mit 5 'und 3' spezifischen Sonden bestätigt korrekte Ausrichtung zu Exon 1 des PITX3 Locus (Abbildung 2), mit einem Wirkungsgrad von 19%. In 3 gezeigt Immun Bilder zeigen EGFP-Expression durch den Promotor PITX3 folgenden Differenzierung mit einer veröffentlichten PA6 stromalen Zelldifferenzierung Protokoll 12,13 angetrieben. Co-Lokalisation von EGFP konnte mit Markern der dopaminergen Mittelhirnneuronen wie FOXA2 (rot) (3A) und Tyrosin-Hydroxylase (TH; rot) beobachtet werden (3B), während vor allem ohne Co-Lokalisation c Ould mit dem GABA-erge-Marker, Gamma-Aminobuttersäure (; rot GABA) beobachtet werden (3C).
Abbildung 1. Vorläufige genomische PCR-Screening. Nach Kolonie Kommissionierung und Expansion, erkannt vorläufigen genomischen PCR-Screening zahlreiche positive Klone durch das PCR-Produkt (984 bp Bande bei) gezeigt. (Die Klone wurden unter Verwendung von Primern hPITX3 L Arm gen. F, die direkt vor dem linken Arm liegt Targeting und hPITX3 L Arm GFP R, die innerhalb des EGFP-Gens lokalisiert wird gesiebt.) Rechte und linke Seitengassen sind ein 1 kb Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Validierung der EGFP-Targeting auf die hPITX3 Locus unter Verwendung von Zink-Finger-Nukleasen in hES-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Southern-Blot-Strategie eingesetzt, um zu überprüfen Targeting. Das obere Feld zeigt schema die native hPITX3 Locus vor Targeting. Die Bodenplatte zeigt die schematische hPITX3 Locus folgende richtige Einsetzen der EGFP-Transgens. Die roten Linien auf jeder Platte veranschaulichen die Stellen, an denen die 5 'und 3' Southern-Blot-Sonden binden, und entsprechen den Banden in 2B. (B) Southern-Blot Repräsentative korrekt gezielte Kolonien ausgewählt aus PCR Vorabsiebung. Abkürzungen: EGFP, verstärkt grün fluoreszierendes Protein; PGK, Menschen Phosphoglycerinkinase Promotor; Puro Puromycin-Resistenz-Gen. Weitere Merkmale: loxP-Stellen, lila; Polyadenylierungssequenz, BLue, hPITX3 Exons, orange. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. hPITX3 hES-EGFP unter PA6 / LSB / SAG / FGF8 Bedingungen unterschieden. Immunfluoreszenz-Bilder von EGFP mit (A) FOXA2 (rot), (B) TH (rot) und (C) GABA (rot) gekennzeichnet. Mit DAPI (blau) gegengefärbt. Waagen Bars, 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Nach Co-Elektroporation von dem individuell gestalteten PITX3 Zinkfinger-Paar zusammen mit der PITX3 - EGFP-spezifischen DNA-Donor-Vektor und anschließende Puromycin-Selektion positiver Klone wurden HES zunächst durch genomische PCR-Screening (1) detektiert. Southern-Blot-Hybridisierung dieser PCR-positiven Klone mit 5 'und 3' spezifischen Sonden bestätigt korrekte Ausrichtung zu Exon 1 des PITX3 Locus (Abbildung 2), mit einem Wirkungsgrad von 19%. In 3 gezeigt Immun Bilder zeigen EGFP-Expression durch den Promotor PITX3 folgenden Differenzierung mit einer veröffentlichten PA6 stromalen Zelldifferenzierung Protokoll 12,13 angetrieben. Co-Lokalisation von EGFP konnte mit Markern der dopaminergen Mittelhirnneuronen wie FOXA2 (rot) (3A) und Tyrosin-Hydroxylase (TH; rot) beobachtet werden (3B), während vor allem keine Co-Lokalisation konnte mit dem GABA-erge Marker beobachtet werden , Gamma-Aminobuttersäure (GABA, rot) (3C).
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Abbildung 2. Validierung derEGFP-Targeting auf die hPITX3 Locus unter Verwendung von Zink-Finger-Nukleasen in hES-Zellen. (A) Schematische Darstellung des Southern-Blot-Strategie eingesetzt, um zu überprüfen Targeting. Das obere Feld zeigt schema die native hPITX3 Locus vor Targeting. Die Bodenplatte zeigt die schematische hPITX3 Locus folgende richtige Einsetzen der EGFP-Transgens. Die roten Linien auf jeder Platte veranschaulichen die Stellen, an denen die 5 'und 3' Southern-Blot-Sonden binden, und entsprechen den Banden in 2B. (B) Southern-Blot Repräsentative korrekt gezielte Kolonien ausgewählt aus PCR Vorabsiebung. Abkürzungen: EGFP, verstärkt grün fluoreszierendes Protein; PGK, Menschen Phosphoglycerinkinase Promotor; Puro Puromycin-Resistenz-Gen. Weitere Merkmale: loxP-Stellen, lila; Polyadenylierungssequenz, blau, hPITX3 Exons, orange. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi sehengurieren.
Abbildung 3. hPITX3 hES-EGFP unter PA6 / LSB / SAG / FGF8 Bedingungen unterschieden. Immunfluoreszenz-Bilder von EGFP mit (A) FOXA2 (rot), (B) TH (rot) und (C) GABA (rot) gekennzeichnet. Mit DAPI (blau) gegengefärbt. Waagen Bars, 50 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Substanz | ml / 100 ml | Artikelnummer (Lieferant) |
| DMEM | 89 | 10566-016 (Life Technologies) |
| Fötales Rinderserum | 10 | 16140-071 (Life Technologies) |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) |
Tabelle 1.
| Komponente | 100-mm-Schale | 60-mm-Schale | 6-Well- | 48-Well- | 96-Well- | 75cm 2-Kolben |
| HBSS | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Accutase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | 0,5 ml | 0,1 ml | 8 ml |
| Dispase | 5 ml | 2 ml | 1 ml | - | - | - |
| hESC Medien | 10 ml | 6 ml | 3 ml | 0,5 ml | 0,2 ml | 15 ml |
| Matrigel | - | - | - | - | 0,1 ml | - |
Tabelle 2.
| Substanz | ml / 100 ml | Artikelnummer (Lieferant) | |
| DMEM / F12 | 80 | 11320-033 (Life Technologies) | |
| KSR | 20 | 10828-028 (Life Technologies) | |
| NEAA | 1 | 11140-050 (Life Technologies) | |
| Glutamax | 1 | 35050-061 (Life Technologies) | |
| Pen / Strep | 1 | 15070-063 (Life Technologies) | |
| ß-Mercaptoethanol | 0,1 | 21985-023 (Sigma-Aldrich) | |
| rhFGF2 | 7 ng / ml [endgültig] | 233-FB-025 / CF (R & D Systems) |
| Substanz | Konzentration | Artikelnummer (Lieferant) |
| N-Lauroylsarcosin Natriumsalz-Lösung (Sarcosyl) | 0,5% (w / v) | 61747 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA | 10,0 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
| NaCl | 10,0 mM | S3014 (Sigma-Aldrich) |
| Tris-Cl (pH 7,5) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| Proteinase K | 1,0 mg / ml | BIO-37084 (Bioline Australien) |
Tabelle 4.
| Substanz | Konzentration | Artikelnummer (Lieferant) |
| Tris-Cl (pH 8,0) | 10,0 mM | T3253 (Sigma-Aldrich) |
| EDTA (pH 8,0) | 0,1 mM | E9884 (Sigma-Aldrich) |
Tabelle 5.
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Discussion
Die Erzeugung von Reporterzelllinien bietet ein leistungsfähiges Mittel zu verfolgen, zu visualisieren und zu isolieren Zellen von Interesse aus einer heterogenen Population von hES-Zellen abgeleitet. Allerdings Gen-Targeting über herkömmliche homologe Rekombination hat sich als äußerst ineffizient für den menschlichen WSR 3 zu sein. In diesem Protokoll beschreiben wir eine relativ einfache Technik für die Einführung eines RP in Exon eines der PITX3 Ort, in hES-Zellen mittels eines allgemein verfügbaren Targeting-Vektor zusammen mit ZFNs. In unseren Händen die Gen-Targeting-System ist effizient, mit 19% des Puromycin-resistenten Klone, die eine korrekt ausgerichtet PITX3 Locus (ähnlich dem zuvor veröffentlichten 6).
Eine Einschränkung bei der Verwendung von Gen-Targeting ZFNs zu erleichtern, ist die Schwierigkeit bei der Gestaltung ZFNs von Grund auf neu im Haus. Somit wird in diesem Protokoll verwendeten wir kundenspezifische Handel erhältlich ZFNs, die teuer in der Anschaffung sein kann. & #160; In jüngerer Zeit hat die TALEN System für Gen-Targeting mittels der homologen Rekombination 9 verwendet. Die Verwendung von TALENS reduziert die Kosten des Gens Bearbeitung und kann in Gebäuden geeignet ist, beschleunigt den Vorgang. Obwohl nicht ausdrücklich in dieser Studie gezeigt, kann dieses Protokoll leicht modifiziert werden, um die Verwendung von TALENS nehmen wie die Methode ist die gleiche, mit der Ausnahme TALEN Plasmide werden in Schritt 3.5 anstelle von ZFN mRNA verwendet wird, wie in 9 gezeigt.
Bei dieser Technik ist es unerlässlich, um sicherzustellen, dass hPSCs sind in der logarithmischen Wachstumsphase (zB Kulturen sind nicht 70% oder mehr konfluent). Wir glauben, daß dies kritisch ist, da das Plasmid Zugriff auf den Kern folgenden Umschlag Bruchkern während der Zellteilung. Darüber hinaus wird die DNA-Donor-Vektor nur in DNA einzubauen folgenden DNA-Synthese, wie dieses Verfahren nutzt Homologie-gerichteten Reparatur während der Teilung, um die Donor-DNA in die nehmenGenom.
Eine weitere potentielle Beschränkung der ZFN Ansatz ist die Einführung von DNA-Brüchen an anderer Stelle im Genom. Obwohl Southern-Hybridisierung mit externen 5 'und 3' Sonden erkennt korrekte Integration wird es zusätzliche Integration Ereignisse oder fehleranfällige Reparatur an anderer Stelle im Genom nicht erkennen. Zusätzliche Integration Ereignisse können durch Southern-Hybridisierung mit spezifischen Sonden-Vektor (zB EGFP), während Off-Target-Spaltung der ZFN-Paare können mit SELEX 3,6 nachgewiesen werden untersucht werden.
Obwohl wir keine offensichtlichen Auswirkungen auf die Entwicklung des dopaminergen Mittelhirnneuronen, die direkt auf die Inaktivierung eines Gens zurückgeführt werden PITX3 konnte nicht beobachten, sollten die Forscher zu bedenken, dass jede Veranstaltung, bei der gezielt eine Kopie eines Gens gestört kann sich nachteilig auf die sein Entwicklung der Zelle und sollten dies bei der Analyse der Ergebnisse zu berücksichtigen. Ob dies der Fall ist, hängt weitgehendauf dem Gen abgezielt und kann nur durch Durchführen des Experiments bestimmt werden.
Verwendung eines PA6 basierte Differenzierung Protokoll 12,13 waren wir in der Lage, die Wiedergabetreue des Reportersystems durch Immunfluoreszenz bestätigt (Figur 3) und qPCR-Analyse von EGFP positive gegen negativen Populationen folgenden Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (Daten nicht gezeigt). Wie PITX3 ist ein Transkriptionsfaktor spezifisch dopaminergen Mittelhirn-Neuronen 14 wird die Konstruktion von einem menschlichen PITX3 Reporterzelllinie die Verwendung von PITX3 + dopaminergen Mittelhirn-Neuronen von HES in Studien sowohl in vitro PD Modellierung oder Zellersatztherapie abgeleitet erleichtern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
In diesem Protokoll beschriebenen Arbeiten wurden durch Mittel aus der viktorianischen Regierung als Teil eines kollaborativen Allianz mit dem kalifornischen Institut für Regenerative Medizin (CIRM) möglich.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse Embryonic Fibroblasts (DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| Gelatin | Sigma | G1393-100ML | |
| HBSS, no Calcium, no Magnesium, no Phenol Red (HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| Cell Scraper | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| Cell Strainer - 40 μm | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 mm - 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R&D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4 cm electroporation cuvette | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, US Origin (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt solution (Sarcosyl) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F (primer): 5’ TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| hPITX3 L arm GFP R (primer): 5’ ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3’ | GeneWorks, Australia | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, Australia | 41003 |
References
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Molecular Biology Ausgabe 90 Elektroporation mit menschlichen embryonalen Stammzellen Genom Bearbeitung Reporterzelllinie dopaminergen Mittelhirnneuronen View Video
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