Summary
وكان الماوس لمبة حاسة الشم التبعي (AOB) صعبة للدراسة في سياق الترميز الحسي. هنا، ونحن يبرهن على وجود تشريح التي تنتج خارج الحي إعداد الخلايا العصبية التي لا تزال متصلة وظيفيا AOB لمدخلاتها الطرفية، وتسهيل البحث في معالجة المعلومات من الفيرومونات الماوس وkairomones.
Abstract
النظام التبعي حاسة الشم الماوس (الدعم الإداري والتشغيلي) هو مسار الحسية المتخصصة للكشف عن الروائح غير قلق الاجتماعي، الفيرومونات، وkairomones. أول الدوائر العصبية في مسار الدعم الإداري والتشغيلي، ودعا البصلة الشمية الإكسسوارات (AOB)، يلعب دورا هاما في تأسيس سلوكيات الجنس نموذجية مثل العدوان الإقليمية والتزاوج. هذا الصغيرة (<1 مم 3) الدائرة تمتلك القدرة على التمييز بين الدول السلوكية فريدة من نوعها، مثل الجنس، السلالة، والضغط من العظة حسي كيميائي في إفرازات وفضلات من conspecifics. في حين أن منظمة المدمجة من هذا النظام يقدم فرصا فريدة للتسجيل من أجزاء كبيرة من الدوائر في وقت واحد، والتحقيق في المعالجة الحسية في AOB يبقى تحديا، إلى حد كبير بسبب موقعها غير ملائم تجريبيا في الدماغ. هنا، ونحن يبرهن على وجود تشريح متعددة المراحل التي تزيل AOB سليمة داخل نصف الكرة احدة من الجمجمة الأمامية الماوس، وترك الاتصالالأيونات على كل من الخلايا العصبية الحسية الميكعي الطرفية (VSNs) والدوائر العصبية المحلية سليمة. الإجراء يعرض سطح AOB لتوجيه الفحص البصري، وتسهيل الكهربية والتسجيلات البصرية من عناصر الدائرة AOB في غياب التخدير. عند إدخال قنية رقيقة في الجهاز الميكعي (VNO)، الذي يضم VSNs، يمكن للمرء أن يعرض مباشرة على هامش الروائح الاجتماعية والفيرومونات في حين تم تسجيل النشاط المصب في AOB. تمكن هذا الإجراء الاستفسارات رقابة في الدعم الإداري والتشغيلي معالجة المعلومات، والتي يمكن أن تسلط الضوء على آليات ربط التعرض فرمون للتغيرات في السلوك.
Introduction
تجهيز الحسية في الدماغ في الثدييات وعادة ما يمتد متعددة الدوائر العصبية مرتبطة بالتبادل، كل منها مقتطفات ميزات معينة من المدخلات الحسية. في الممرات الحسية، وتجهيز المعلومات في وقت مبكر أمر حيوي لتصور العادي والسلوك. في نظام حاسة الشم التبعي (الدعم الإداري والتشغيلي)، والبصلة الشمية الإكسسوارات (AOB) هو الدوائر العصبية الرئيسية التي تربط بين المحيط الحسية للهياكل المصب التي تملي التوازن الهرموني 1،2، 3 العدوان، والشهوة 4. على هذا النحو، ويرتبط معالجة المعلومات داخل هذه الدائرة بقوة للتغيرات في سلوك الحيوان.
يقع البصلة الشمية التبعي في الفئران والجرذان في الجانب الظهري / الذيلية / الخلفي من البصلة الشمية الرئيسية (MOB) تحت الكثيفة، أوعية دموية الجيوب الأنفية أنفي. وAOB يتلقى تعصيب وارد من محاور عصبية من الخلايا العصبية الحسية الميكعي الطرفية (VSNs) الموجودة في الجهاز الميكعي (VNO)، وهو األصغر ل التعمية العضوية أنبوب في أنف الأمامية فقط فوق الحنك الرخو. هذه المحاور اجتياز رقة حساسة من الأنسجة الحاجز على الحدود وسطي من الممرات الأنفية. وقد تم بحث العديد من الدراسات AOB الاستجابات العصبية لمصادر الروائح الدعم الإداري والتشغيلي (مثل الماوس البول) في الجسم الحي باستخدام تخدير الفئران 5-7 أو استكشاف بحرية الحيوانات 8. البطولية تخدير في الدراسات المجراة المعنية (أ) tracheotomies لضمان التخدير العميق ومنع تطلع من المحفزات السائلة 5-7، (ب) تحفيز عنق الرحم العقدة متعاطفة 6 أو القسطرة مباشرة من الجهاز الميكعي 5،7 لإدخال الروائح غير قلق و (ج) craniotomies مع أو بدون ablations الفص الجبهي للسماح النهوض الكهربائي في AOB 6. مستيقظا / يتصرف الدراسات 8-10 تشارك زرع جراحية لميكرودريفي. باختصار، هذه هي نماذج تجريبية قوية، ولكن من الصعب للغاية، وغالبا ما تتطلب التخدير.
ق ق = "jove_content"> ومن المثير للاهتمام، حاولت العديد من الدراسات للحفاظ على الهياكل الحسية والدوائر العصبية المصب على قيد الحياة خارج الجسم (خارج الجسم الحي) مع بعض النجاح 11-15. لأن الاتصالات بين VNO وAOB تبقى المماثل، ولأن الأنسجة خط الوسط الحاجز يمكن أن يتعرض لsuperfusate الاوكسيجين في نصف الكرة احدة، سعينا لتطوير مثل هذا فيفو السابقين نهج واحد نصف الكرة لعزل هذه الهياكل مع الحفاظ على التواصل فيما بينها وظيفية. نجحنا مؤخرا في تحقيق هذا الهدف 16. هذا التحضير يحتفظ كل من VNO وAOB على قيد الحياة ومتصلة وظيفيا لا يقل عن 4 - 6 ساعة لأن كلا من المحاور (على طول خط الوسط الأنسجة الناعمة الحاجز) وAOB ضحلة نسبيا <600 ميكرون الميزات التي هي في متناول superfused الاوكسيجين السائل النخاعي الاصطناعي ( ACSF). هذا VNO-AOB فيفو السابقين إعداد يسمح بإدخال المحفزات للرقابة في VNO عبر قنية رقيقة، ووصول البصرية مباشرة إلى AOB صغيرة لاستهداف المواضع القطب و / أو المجهري مضان الحية. هذا الأسلوب هو مفيد إذا كان أحد يرغب في دراسة هذه الدوائر في غياب التخدير. لأن هذا النهج يقطع الاتصالات الطرد المركزي، فإنه ليس مناسبة تماما لتحقيقات في التشكيل الطرد المركزي من وظيفة AOB. وVNO-AOB فيفو السابقين إعداد من الصعب معرفة، ولكن بمجرد تحقيق تنتج منصة موثوق بها والتي على التحقيق في تنظيم الدوائر، ومعالجة المعلومات، واللدونة العصبية في هذه الدائرة الحسية قوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية جنوب غرب UT، واختيرت وذلك لتقليل الإجهاد، وعدم الراحة، والألم الذي تعيشه حيوانات التجارب.
1. غرفة تشريح
وثمة حاجة إلى غرفة التشريح العرف والصغيرة، لوح بلاستيكية رقيقة للحصول على أفضل النتائج (الشكل 1). بناء أو الحصول على هذه الغرفة في وقت مبكر من محاولة هذا البروتوكول.
2. حلول تشريح
- تحضير 1 لتر من مستوى السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) لاستخدامها في خطوات 3،22 حتي 5،4. إضافة كلوريد الصوديوم 125 ملم، 2.5 ملم بوكل، و CaCl 2 2 ملم، 1 ملم MgCl 2، 3 NaHCO 25 ملم، ناه 2 ص 4 1.25 ملم، ميو، اينوزيتول 3 ملم، البيروفات الصوديوم 2 مم، أسكوربات الصوديوم 0.4 ملم، والجلوكوز 25 مم إلى 1 لتر من الماء مولد الحمى مجانا.
- إعداد ACSF تشريح الأولي (200 مل) لاستخدام في الخطوات 3،3-3،22. تأخذ 200 مل من ستاندرد ACSF ورفع تركيز MgCl 2 بنسبة 9 ملي بإضافة 0.366 غرام من MgCl 2 هيكساهيدرات.
- تحضير محلول قياسي رينغر لتنفيذ المحفزات إلى VNO من خلال قنية للاستخدام في الخطوات التي تحتوي على كلوريد الصوديوم 4،11 حتي 5،4 ملم 115، 5 ملي بوكل، و CaCl 2، 2 مم، MgCl 2، 2 مم، 25 مم NaHCO 3، HEPES 10 ملي، الجلوكوز 10 ملم.
- فقاعة 0.8 L من ACSF القياسية و 0.5 لتر من رينغر مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2 الغاز في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة حتى الاستخدام.
- فقاعة في 200 مل من ACSF تشريح أولي مع 95٪ O 2، 5٪ CO 2 الغاز على الجليد لمدة 15-20 دقيقة حتى تصل إلى 4 درجات مئوية.
3. تشريح الابتدائية
- اعداد منطقة تشريح. وضع ثلاثة أطباق بتري 35 مم، الاوكسيجين ACSF، مقص قطع الرأس، منحني مقص تشريح، تشريح مقص، ملقط أدسون، وفروة الرأس رقم 11 على التواليش النصل والمقبض وشفرة حلاقة على الجليد.
- بعد أن يبرد الاوكسيجين ACSF إلى 4 درجة مئوية، وتخدير عميق الحيوان في غرفة تجفيف باستخدام 2-5 مل Isothesia (99.9٪ isofluorane). أداء الذيل والقدم قرصة الاختبارات لضمان تخدير الحيوان بعمق.
- بمجرد تأكيد التخدير العميق، وقطع رأس الحيوان ووضع على الفور رأسه في طبق بتري مليئة تشريح ACSF مبردة. ملاحظة: تزج في الأنسجة تشريح المبردة ACSF لإبقائه باردا في جميع أنحاء الداخلي عندما لا تكون قيد الاستعمال.
- إزالة الجانب السفلي (البلعوم بطني، الفك السفلي، واللسان) مع مقص منحني.
- باستخدام ملقط أدسون deglove (قشر) الجلد السطحية والمرفقات العضلات من الجمجمة. قشر فروة الرأس من الذيلية لمنقاري حتى الموقع الوحيد من المرفق على الأسنان الأمامية. قطع الأنسجة عند نقطة المرفقات باستخدام مقص منحني. إزالة العين عن طريق الامساك بها مع ملقط وتسحبه بعيدا عن الإعداد. Nالأذن نهاية الإجراء لحب، وتجنب القوة الزائدة على غضروف الأنف الدقيق باستخدام ملقط أدسون إلى المرفقات العضلات خالية من العظام الفك العلوي. ملاحظة: فصل فروة الرأس من الناحية الذيلية من الجمجمة مع مقص التوالي.
- مع مقص على التوالي، وخفض خط الوسط من الجمجمة من الذيلية لمنقاري حتى نصائح مقص عدد قليل مم في العظام الأمامية (فقط قبل الجيوب الأنفية أنفي).
- إزالة الجدارية والعظام الأمامية من الجمجمة باستخدام ملقط أدسون. ملاحظة: في كثير من الأحيان لا تزال تعلق قطعة من العظم الجبهي لعظام الأنف الذيلية إلى الجيوب الأنفية أنفي. إزالة هذه القطع مع الحرص على عدم الاتصال بصيلات الشم.
- استخدام مشرط لاجراء خفض الاكليلية من خلال الفص الجبهي 2 ملم الذيلية إلى الجيوب ثم قم بإزالة الذيلية الدماغ لخفض الانتاج. ضمان غيض من الاتصالات مشرط كفاف العظمية للجمجمة بطني بقطع تماما النسيج الخلفي. ملاحظة: وهذا يمكنإزالة الغالبية العظمى من الدماغ دون وضع الضغط الميكانيكي على مساحات الشمية الجانبي أو بصيلات الشم.
- إزالة الجوانب الذيلية المكشوفة من الجمجمة بطني مع مقص التوالي. ترك الجيوب المتبقية والنسيج العصبي.
- إزالة القوس الوجني وعضلات الوجه على الجانب الأيمن من الجمجمة التشريحية باستخدام مقص مستقيم
- تحويل خطم على (الجانب البطني متابعة) لفضح سقف الفم.
- قطع وإزالة الحنك الذيلية فورا إلى القواطع. القيام بذلك عن طريق إدراج غيض من شفرة مشرط تحت الحنك موازية للسقف الفم ثم نقل شفرة نحو القواطع.
- فهم سراح (منقاري) حافة الحنك مع ملقط أدسون وإزالة عن طريق سحب نحو caudally.
- على الجانب الأيسر من الجمجمة التشريحية، واستخدام شفرة المشرط لتوسيع الثقبة الحنكية نحو caudally، بدءا من الثقبة صغيرة بالقرب من الأضراس. تحقيق ذلك من خلال إدراج غيض من مشرط بلوخدي في الفراغ بالقرب من الأضراس وتناوب المعصم. ملاحظة: استخدام الحذر الشديد لاستخدام فقط غيض من شفرة - قطع عميق يمكن أن تتلف الأنسجة الحاجز.
- استخدام غيض من شفرة مشرط، وقطع من الثقبة الحنكية من خلال القواطع، بدءا منقاري إلى التشريحية الجهاز الميكعي اليسرى. استخدام التخفيضات التهديف متعددة. لا تضر الأنسجة الحاجز والأعصاب الميكعي عن طريق إدراج شفرة عميق جدا.
- تحويل الأنسجة حتى الجمجمة الظهرية يكون مواجها لها ثم توجيه شفرة حلاقة مستقيم عموديا (الموازية لخط الوسط) على حافة الذيلية للإعداد.
- على حافة البطنية من الأنسجة، وتلمس حافة القطع من شفرة حلاقة على الفور إلى اليسار من خط الوسط. بلطف الصخور النصل وتتحرك على طول الثقبة الحنكية اليسرى (قطع المنطقة التي أدخلت في الخطوة 3.14).
- على حافة الظهرية من الأنسجة، ووضع طليعة الحلاقة مباشرة إلى اليسار من خط الوسط (أقل من 1 مم).
- حفظشفرة موازية لخط الوسط، صخرة شفرة حلاقة ببطء مع الضغط باتجاه الأمامي من الأنسجة. إشعار المقاومة في لوحة مثقب. توقف فورا بعد اختراق هذه المقاومة. ملاحظة: عند هذه النقطة، يتم خففت النصف الأيمن من نصف الكرة المخية الأيسر. الاتصال الوحيد المتبقي هو بين نصفي الكرة الأرضية على طول الخطم الأمامي الظهري لوحة مثقب.
- فصل نصفي الكرة الأرضية من خلال استيعاب لهم بالقرب من الجانبين الذيلية مع أصابع القفاز وبلطف تناوب عليها أفقيا والأمامية. ملاحظة: هذه الخطوة هي مصدر التباين التجريبية، وخاصة في الفئران مع الخطوم انحرفت أو هش (على سبيل المثال، الفئران الأكبر سنا). أيضا، أثناء محاولة لتدوير نصفي الكرة بعيدا عن بعضها البعض، وإذا واجه مقاومة قوية يسجل خطم الظهرية (الأمامي لوحة مثقب) لإضعاف الأنسجة الضامة. عند القيام بذلك، واتخاذ الحذر الشديد بعدم إدراج مشرط بعمق، والتي يمكن أن تلحق الضرر منظمة الشفافية الدولية الحاجزssue والأعصاب الميكعي.
- تنطبق على كمية صغيرة (50-100 ميكرولتر) من الغراء الأنسجة إلى اللوح ووضع بلطف الحافة الجانبية من النصف الأيمن على الغراء باستخدام ملقط أدسون. إزالة الرطوبة الزائدة من الجانب الوحشي من إعداد باستخدام منشفة ورقية لمنع سابق لأوانه البلمرة الغراء والتصاق فضفاضة إلى الخشبة. ملاحظة: ضع بضع قطرات من ACSF تشريح المبردة على عينة لتسريع البلمرة الغراء بعد وضع النسيج على الغراء. وهذا يضمن أن تبقى الأنسجة عقدت بإحكام على اللوح.
- وضع كمية صغيرة (3-5 مم، 2 مم العميقة) من الشحوم فراغ في منتصف غرفة تشريح الثانوي ووضع الجانب من خشب المعاكس الأنسجة بحزم ضد الشحوم. ملء الفور غرفة التشريح مع تشريح ACSF المبردة، ونقل إلى منطقة تشريح غرامة وتبدأ نضح مع الاوكسيجين ACSF القياسية. توجيه لوح بحيث البصلة الشمية غير مباشرة فيتيار من الاوكسيجين ACSF القياسية طازجة.
4. تشريح الثانوية
- إزالة أية المقابل (يسار) البصلة الشمية مرئية أو الأنسجة القشرية من إعداد باستخدام ملقط غرامة. قرصة معا ملقط غرامة (تشكيل شبه حادة نقطة)، ومن ثم وضعه في الظهرية والذيلية جزء من الأنسجة بالقرب من خط الوسط. بلطف تشغيل ملقط مقروص على طول خط الوسط، تقشير الأنسجة بعيدا عن النصف الأيمن ببطء في الحركة الأمامية. إزالة كافة الأنسجة المقابل، بما في ذلك الأنسجة البصلة الشمية المقابل. اتخاذ الحذر الشديد لا طعن خلال الأنسجة، والتي يمكن أن تسبب ضررا على AOB أو الميكعي العصبية.
- مراقبة الأم الجافية بيضاء على طول السطح الظهري / وسطي من البصلة الشمية. المسيل للدموع هذه الأم الجافية على طول ظهري / الذيلية حافة البصلة الشمية من خلال استيعاب بياضا في جزء من الجافية مع اثنين من أزواج من ملقط غرامة وسحب منهم بعيدا عن تلك النقطة. الجافية هو بإحكامملفوفة حول بصيلات الشم، ويمكن بسهولة نفسها شريحة من خلال الأنسجة بينما يتم إزالته. تجنب الأضرار التي لحقت السطح الإنسي من البصلة الشمية وAOB نفسها. ملاحظة: إذا الجافية يقاوم تمزق بسهولة عند هذه النقطة، وإدخال قطع صغيرة مع غرامة مقص تشريح قمة الربيع لتسهيل الانفصال.
- ببطء وبعناية قشر بعيدا القشرة الأمامية مع ملقط غرامة دون الإضرار بصيلات الشم الأساسية. مراقبة مجموعة من الأوعية الدموية التي تظهر كشبكة شبه شفافة الذيلية فورا إلى AOB. إزالة هذه الشبكة مع ملقط غرامة لتسهيل اختراق القطب في التجارب الكهربية. فهم صافي مع ملقط لأنه يفصل من AOB خلال القشرة الأمامية التراجع وإزالته عن طريق سحب نحو caudally وإعلامي، والحرص على عدم لمس AOB. مرة واحدة وقد تم فصل القشرة الأمامية من بصيلات الشم، إزالته عن طريق قطع مع ملقط بطني والخلفي للAOB. ملاحظة: خذ السابقينTREME الرعاية مع صافي الإزالة، لأنه إذا تم ذلك تقريبا أيضا يمكن أن تصبح طبقة كبيبي التالفة.
- في تجويف الأنف المقابل المكشوفة، وإزالة أي المتبقية الأنسجة الحاجز المقابل (ورقة صفراء واهية تحتوي على الأوعية الدموية) باستخدام ملقط غرامة. فهم الأنسجة في المنطقة الذيلية / الظهرية (بالقرب من الحاجز العظام) ومن ثم سحب / رفع الأنسجة نحو الجانب الأمامي. ملاحظة: الأنسجة الحاجز المقابل يمكن إزالتها دون قصد خلال خطوة تنصيف (الخطوة 3.20). في مثل هذه الحالة، ومراقبة بيضاء، اوعائي الغضروف الحاجز وشفافة قليلا، الحاجز أوعية دموية العظام. إذا كان هذا هو الحال، الخطوة 4.4 يمكن تخطي.
- إزالة بعناية VNO المقابل عن طريق تشغيل نقطة واحدة من ملقط غرامة بين غضروف الحاجز و "الجناح" VNO (قطعة رقيقة من الأنسجة العظمية الذي يمتد على طول الحافة الظهرية كل VNOs.
- بعد انفصال الجناح من الغضروف، نقل غيض من ملقط البطنيفي المقابل VNO بالقرب من خط الوسط. كرر هذه الخطوة في عدة مواقع على طول محور الذيلية / منقاري من VNO المقابل لتخفيف ذلك، مما مكنها من إزالتها عن طريق استيعاب مع ملقط ورفع بعيدا.
- إعداد لإزالة الغضروف الحاجز بجعل خفض على حافة بطني / الذيلية (حيث يضيق إلى أبيض اوعائي قطاع تشغيل على طول حافة بطني من عظم الحاجز) مع ملقط غرامة.
- إزالة الغضروف الحاجز بواسطة معسر معا ملقط غرامة لجعل شبه نقطة حادة. التعرف على قطع مصنوعة في الخطوة 4.6، إدراج ملقط مقروص وراء (الوحشي) لأنه قطع، ومن ثم رفع ببطء الغضروف بعيدا عن الأنسجة الحاجز والمضي rostrally. ملاحظة: لا تعطيل الأنسجة الحاجز الأساسي. كما يتم رفع الغضروف، ومراقبة الميزانية الكامنة وراء الحاجز تمتد الأنسجة بسبب التصاقات فضفاضة إلى الغضروف. حركة دورية، لطيف، ومستقرة من ملقط غرامة مقروص على طول هذا موقع فضفاضةdhesion يمكن أن يسهل إلى حد كبير فصل ناجحة من الهيكلين.
- استخدام زوج من ملقط # 3 مع طرف عازمة على إزالة العظام الحاجز. الاقتراب من الحاجز العظام في زاوية موازية تقريبا لطائرة من العظم الحاجز. إدراج طينة المنحني بين الأنسجة الحاجز والحاجز العظام. فهم العظام مع ملقط وبلطف تحريك العظام ذهابا وإيابا حتى الشقوق بالقرب من لوحة مثقب. ملاحظة: في بعض الحالات، فإن العظام الحاجز كسر مقاومة بالقرب من لوحة مثقب. في هذه الحالة، استخدم ملقط غرامة ليسجل بلطف العظام الحاجز على طول ظهري / بطني المحور الأمامي فقط لوحة مثقب، ثم كرر الخطوة 4.8.
- إزالة الغضروف الأبيض فقط منقاري إلى VNO بواسطة معسر مع زوج واحد من ملقط غرامة عند المدخل وسحب rostrally مع زوج آخر من ملقط غرامة.
- إرفاق قنية بوليميد إلى جهاز نضح سريع وبدء تدفق الحل رينغر (0.1-0.3 مل / دقيقة) من خلال قنية بوليميد.ملاحظة: قياس معدل التدفق مع في الخط، وحجم صغير تدفق متر. استخدام جهاز الكمبيوتر التي تسيطر عليها التبديل التحفيز الهوائية يقلل من معدل تدفق التغييرات خلال التحفيز. مقارنة الاستجابات العصبية لاختبار المحفزات مع الردود على التحفيز وهمية (السيطرة حل رينغر) لضمان استجابات محددة التحفيز.
- توجيه موازية قنية إلى مدخل VNO. عندما قنية ومرض موازية لمدخل VNO، يتفرجون على منفذ الضغط يسبب VNO الى "تضخيم"، مما أدى إلى إجلاء الأوعية الدموية. إدراج الفور قنية في VNO، والحفاظ على زاوية ثابتة قنية بحيث يظل بالتوازي مع افتتاح VNO. ملاحظة: يمكن أن تكون مفيدة لعقد قنية مع زوج واحد من ملقط غرامة ضد لوح من البلاستيك واستخدام زوج آخر من ملقط غرامة لزاوية نهاية قنية صعودا طفيفا. إذا كان واحد يضع عن غير قصد قنية وراء VNO، ويمكن أيضا أن يسبب تدفق الأوعية الدموية VNOلاجلاء، مما يؤدي إلى انطباع تم إجراء القسطرة المناسبة. ويمكن التأكد من الموقع الصحيح من خلال دمج صبغة في حل رينغر. عندما يتم وضع قنية بشكل صحيح، يجب أن الصبغة فقط الخروج عبر المدخل VNO. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء التأكد من تحديد المكان المناسب من خلال ضمان أن قنية مرئيا بسهولة من خلال الجانب الإنسي شبه شفافة من VNO.
- نقل لوح البلاستيك ببطء حتى AOB هو في تدفق مباشرة للACSF القياسية، والحرص على عدم طرد قنية من VNO. تشريح كاملة وتقييم وظيفة فسيولوجية يمكن أن تبدأ على الفور. الخطوة 5 يصف بإيجاز نهج واحد لصنع مثل هذا التقييم.
5. التقييم
- اختراق سطح AOB مع 2-4 MΩ الزجاج البورسليكات مسرى مكروي تعلق على مكبر للصوت خارج الخلية والذبذبات.
- تقدم ببطء مسرى مكروي على عمق 100-200 ميكرون منسطح بمعدل 50 ميكرون / دقيقة. ملاحظة: في هذا العمق الأنسجة، واحدة تواجه العمل العفوي الطول الموجي المحتملة في بعض الأحيان والتي تجسدت حادة، قصيرة (1-2 ميللي ثانية ~) الانحرافات في مسرى مكروي الجهد.
- على مواجهة إجراء الموجي المحتملة، والتوقف عن المضي قدما في مسرى مكروي.
- مراقبة و / أو تسجيل معدل إمكانات العمل أثناء تغيير الحل التسليم التحفيز من السيطرة رينغر إلى المنشط المعروف النشاط VSN (على سبيل المثال، حل رينغر يحتوي على 50 ملي بوكل). إذا كان تشريح ناجحة، تغيير تعتمد على التحفيز في العمل معدل المحتملة أو المحتملة الميدانية المحلية يمكن ملاحظتها. ملاحظة: ليست كل الخلايا العصبية AOB الرد على كل التحفيز مع زيادة في معدل اطلاق النار (بما في ذلك حل رينغر يحتوي على 50 ملي بوكل). ويشير الانخفاض تعتمد على التحفيز في معدل إطلاق النار أيضا اتصال وظيفية وتشريح ناجحة. في حال أن اثنين أو أكثر من الخلايا العصبية التي واجهتلا تستجيب لتحفيز VNO، أو إذا لم يلاحظ أي إمكانات العمل بعد الاختراقات القطب متعددة، وهذا يدل على وجود تشريح ناجحة. إذا كان هذا هو الحال، يمكن الشروع في تشريح جديد في الخطوة 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحقيق النجاح مع هذا التحضير يأخذ الممارسة واسعة، ولها العديد من الخطوات التي يمكن أن تفشل. ينبغي للمرء أن يتوقع أن تتطلب العديد من المحاولات قبل تحقيق النجاح. مطلوب غرفة مخصصة لتشريح الانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، ويجب الحصول عليها قبل البدء في مراحل لاحقة من تشريح. تصميم غرفة المعروضة في الشكل 1 ويكفي لهذا الغرض، ويمكن أن تكون مصنوعة من البلاستيك غير مكلفة نسبيا مع مطالب بالقطع الحد الأدنى. إذا كان واحد يفتقر إلى القدرة على إنتاج مثل هذه الغرفة، وشركات تصنيع الآلات المحلية أو عبر الإنترنت يمكن الرجوع ويمكن بناء غرفة للرسم.
وقال مصدر كبير من التباين في الاستعدادات هي كثافة وهشاشة عظام الجمجمة والخطم من حيوانات التجارب. خلال الخطوات تنصيف (خطوات 3،14-3،20)، والهدف هو عزل الجهازين الميكعي جنبا إلى جنب مع أنسجة الحاجز المماثل والمماثل البصلة الشمية التبعي. ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف بالنسبة للأنسجة الحاجز أن تظل تعلق على نصف الكرة الأرضية المقابل، نقاط التعلق قرب خصوصا في العظام الظهرية من الخطم. يبين الشكل 2 مثالا على تنصيف فعالة وغير فعالة.
تنشأ أخطاء تشريح المشتركة الأخرى أثناء تشريح غرامة، وخلالها يمكن أن تتلف محاور عصبية من العصب الميكعي في الأنسجة الحاجز بالقرب من الجهاز الميكعي (أرقام 3A 3B و) أو بالقرب من AOB (أرقام 3C و 3D). فإن هذه الأحداث وما شابه يؤدي إلى اتصال غير مكتملة بين VSNs وAOB، وجعلها غير صالحة للاستعمال الاستعدادات.
العقبة النهائية لنجاح إعداد هو الخطوة القسطرة VNO (الخطوة 4.11). وتحديد المكان المناسب للقنية VNO يؤدي إلى الضغط من التجويف VNO، مما تسبب في الطرد الفوري من الدم المتبقية من المضخة الميكعي. يجب أن تكون واضحة للعيان قنية تحت ظهارة الميكعي شفافة نسبيا ويجب أن يكون مظهر قنية موحدة على طوله داخل VNO. عند الانتهاء بنجاح من هذا الإجراء، يمكن للمرء أن تحقق من الاتصال وظيفية باستخدام مقايسة الفسيولوجية مثل وحدة واحدة التسجيلات الكهربية من النشاط العصبي في الاستجابة لتحفيز VNO مع مصدر معروف من عطر VSN (الشكل 4).
الشكل 1. A) الرسومات الهندسية للغرفة تشريح مخصصة المستخدمة في خطوات 3،22 حتي 5،4. ملاحظة: قد يتم حفر الثقوب الصغيرة لاستيعاب الحل وبالغاز مداخل ومنافذ كما تريد B) مثال صورة لغرفة تشريح المستخدمة في هذا البروتوكول. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. A، B) وصور الممثل الناجح (A) وغير الناجحة (B) بعد مرحلة التحضيرات تنصيف (الخطوة 3.20). وVNO والأنسجة الحاجز، وبصيلات الشم (OBS) ويجب علينا جميعا أن يستمر من نصف الكرة المماثل (في هذه الحالة، والحق (القاع) نصف الكرة الغربي. إذا المحارات الأنفية واضحة على نصف الكرة المماثل، فشلت تشريح. ضع علامة علامات هي 1 مم وبصرف النظر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
d/51813/51813fig3highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الرقم 3. A، B) وصور ممثل سليمة وتلف الأنسجة الحاجز بين VNO وAOB. في B، أدلى ملقط تشريح احتكاكه مع الأنسجة، وإتلاف مساحات محوار VN. C، D) AOBs السليمة والتالفة. في D، أدت إزالة الجافية المحيطة OB المماثل في قطع العصب الميكعي بالقرب من AOB، مما تسبب فقاعة مرئية من الأنسجة بالقرب من AOB وسطي. أشرطة النطاق هي 1 ملم في الطول.
الشكل 4 ألف) مثال مؤامرة النقطية من إمكانات العمل المسجلة من الخلايا العصبية AOB (خارج الخلية تسجيل وحدة واحدة) في الإعداد الناجح. آثار في المعرض الأسود أي تغيير في معدل اطلاق النار عندما تم تسليم السيطرة حل رينغر إلى VNO لمدة 5 ثانية (رمادي بثور). آثار في المعرض الأحمر الاستجابة من نفس الخلايا العصبية لتحفيز VNO مع BALB / ج الإناث البول المخفف الماوس 100 أضعاف في رينغر المالحة. ب) الوقت شبه التحفيز الرسم البياني لنفس الردود في A. أشرطة الخطأ تمثل الأخطاء المعياري للمتوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وVNO-AOB فيفو السابقين إعداد الموصوفة في هذا البروتوكول هو بديل مفيد للتخدير في الجسم الحي 5-7 وشريحة الحية الحادة 17 تجارب ظيفة AOB. على عكس التجارب الحادة شريحة AOB، التي تعرض أيضا عناصر الدائرة الكهربية للتسجيلات والبصرية، وهذا التحضير يحتفظ كل afferents الحسية والاتصالات داخل AOB. على الرغم من أن هذا يمكن أن يقال أيضا للتخدير في النهج الجسم الحي، وجود مواد التخدير يغير بالضرورة وظيفة العصبية والتوازن وهي مثير / المثبطة، وهو أمر حاسم لمعالجة المعلومات في هذا المجال والدوائر الأخرى حاسة الشم 18. لأن إعداد يتجنب استخدام التخدير، وذلك لأن سطح AOB يتعرض تماما لsuperfusate، فمن قابلة للاستفسارات الدوائية في معالجة العصبية المحلية.
هناك، بطبيعة الحال، بعض القيود هذا المستحضر. هناك EVidence للانحطاط تدريجي من أعمق طبقات AOB، وهي الأجزاء العميقة من الطبقة الخلوية الداخلية، الذي يضم العديد من الخلايا الحبيبية المثبطة 16. بالإضافة إلى ذلك، قطعت المدخلات الطرد المركزي أثناء تشريح، والقضاء عليها من المشاركة الفعالة في وظيفة AOB. القسطرة من VNO يتجاوز العمل العادي للمضخة الميكعي، والإحمرار بعيدا السوائل الذاتية الموجودة في التجويف VNO.
الخطوات الحاسمة لتحقيق النجاح مع هذا الأسلوب هي تنصيف حساسة (الخطوة 3.20) وVNO القسطرة (الخطوة 4.11). يمكن للمرء أن يتوقع أن يتطلب ممارسة واسعة النطاق لإنتاج موثوق فيفو السابقين الاستعدادات مرتبطة وظيفيا. غرفة تشريح الثانوية المستخدمة هنا يمكن أن تستخدم لتقييم الربط الوظيفية باستخدام تسجيلات أحادية القطب خلال تحفيز VNO مع مصادر الفيرومونات الماوس (مثل البول المخفف). 13،15 تعديلات للغرفة تشريح الثانوية يمكن به جعل التي تسمح للإعداد لاستدارة إلى زوايا مناسبة لأغراض أخرى، مثل التصوير multiphoton.
والعديد من العقبات التقنية لدراسة AOB يعيشون طرحت منذ فترة طويلة عائقا أمام فهمنا لرائحة فرمون الاجتماعية ومعالجة الحسية. بواسطة تشريح بعيدا أقرب مكونات العصبية الحسية من هذا المسار في هذا البروتوكول تشريح، واحد قادر على الوصول تجريبية لهذه الدوائر يصعب الدراسة. لقد استخدمت هذا المستحضر لتحقيقات مفصلة في معالجة الحسية الميكعي 19 ورسم الخرائط الحسية (هامين وآخرون، غير منشورة). وسوف تكون هذه التقنية مفيدة للدراسات المستقبلية في معالجة الحسية في AOB، وخاصة تلك التي تتطلب الوصول إلى الأنسجة البصرية (على سبيل المثال، والتصوير multiphoton وoptogenetics). فوائد هذا النهج تكمل تلك التي في الجسم الحي النهج، وتحسين أدوات من أجل التحقيق في الآليات العصبية من ذلك بوساطة الميكعيالسلوكيات االجتماعية والإنجابية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم صراعات كبيرة من الفائدة في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث من قبل R00 DC011780 (JPM: NINDS، NIH)، F30 DC011673 (بيت التمويل الخليجي: NINDS، NIH) وأموال بدء التشغيل UT دولي (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
