Summary
De muis accessoire reukbol (AOB) is moeilijk te bestuderen in de context van zintuiglijke codering. Hier tonen we een dissectie dat een ex vivo preparaat waarin AOB neuronen blijven functioneel verbonden met hun perifere ingangen, het vergemakkelijken van onderzoek naar de informatieverwerking van de muis feromonen en kairomonen produceert.
Abstract
De muis accessoire olfactorisch systeem (AOS) is een gespecialiseerde zintuiglijke route voor het opsporen van niet-vluchtige sociale geuren, feromonen, en kairomonen. De eerste neurale circuit in de AOS route, genaamd de accessoire reukbol (AOB), speelt een belangrijke rol bij het vaststellen van het geslacht-typisch gedrag zoals territoriale agressie en paring. Dit kleine (<1 mm 3) circuit beschikt over de capaciteit om unieke gedrags-staten, zoals geslacht, spanning en stress van chemosensory signalen in de af-en uitscheiding van soortgenoten te onderscheiden. Terwijl de compacte organisatie van dit systeem biedt unieke mogelijkheden voor het opnemen van grote delen van het circuit gelijktijdig, onderzoek naar sensorische verwerking in de AOB blijft uitdagend, grotendeels te danken aan haar experimenteel nadelig locatie in de hersenen. Hier tonen we een multi-stage dissectie dat de intacte AOB verwijdert in een enkel halfrond van de voorste muis schedel, waardoor een verbindingionen zowel de perifere vomeronasal sensorische neuronen (VSNs) en lokale neuronale circuits intact. De procedure loopt de AOB oppervlak directe visuele inspectie te vergemakkelijken elektrofysiologische en optische opnamen van AOB circuitelementen in de afwezigheid van anesthesie. Bij het inbrengen van een dunne canule in de vomeronasale orgaan (VNO), die VSNs huizen, kan men direct de omtrek bloot aan sociale geuren en feromonen tijdens het opnemen stroomafwaarts activiteit in de AOB. Deze procedure maakt het mogelijk gecontroleerde onderzoeken naar AOS informatieverwerking, die licht kunnen werpen op de mechanismen koppelen feromoon blootstelling aan veranderingen in het gedrag.
Introduction
Sensorische verwerking in de hersenen van zoogdieren omvat meestal meerdere onderling verbonden neuronale circuits, die elk extracten bijzonderheden van sensorische input. In sensorische paden, vroege informatieverwerking is van vitaal belang voor de normale waarneming en gedrag. In het accessoire olfactorische systeem (AOS), het accessoire reukbol (AOB) is de belangrijkste neurale circuit die de sensorische periferie naar downstream structuren die hormonale evenwicht 1,2, agressie 3, en opwinding 4 dicteren. Als zodanig is het verwerken van informatie binnen dit circuit sterk gekoppeld aan veranderingen in het gedrag van dieren.
Het accessoire reukorgaan ligt bij muizen en ratten met de dorsale / staart / posterieure aspect van de belangrijkste reukbol (MOB) onder de dichte, gevasculariseerd rhinal sinus. De AOB ontvangt afferente innervatie van axonen van perifere vomeronasal sensorische neuronen (VSNs) die in de Vomeronasal (VNO) woont, een small blind-ended buis in de voorste snuit net boven het zachte gehemelte. Deze axonen doorkruisen de delicate vel septum weefsel aan de mediale grens van de neusholtes. Verschillende studies hebben AOB neurale reacties gepeild naar bronnen van AOS geuren (zoals muis urine) in vivo gebruik van verdoofde muizen 5-7 of vrij-het verkennen van dieren 8. De heldhaftige verdoofd in vivo studies betrokken (a) tracheotomies diepe narcose te waarborgen en te voorkomen dat de aspiratie van vloeistof stimuli 5-7, (b) stimulatie van het sympathische ganglion cervicale 6 of directe cannulatie van de Vomeronasal 5,7 tot vluchtige geuren introduceren en (c) craniotomies met of zonder frontale kwab ablaties aan elektrode ontwikkelingen mogelijk te maken in de AOB 6. Awake / gedraagt studies 8-10 betrokken chirurgische implantatie van een Microdrive. Kortom, deze experimentele paradigma's zijn krachtig, maar zeer moeilijk en vereisen vaak anesthesie.
(ex vivo) onderhouden met enig succes 11-15. Omdat de verbindingen tussen de VNO en AOB blijven ipsilaterale en omdat de middellijn septum weefsel kan worden blootgesteld aan zuurstof superfusate in een hemisfeer, wilden wij dit ene hersenhelft ex vivo benadering ontwikkelen deze structuren isoleren behoud van hun functionele connectiviteit. We hebben onlangs in geslaagd dit doel te bereiken 16. Deze voorbereiding houdt beide VNO en AOB levend en functioneel verbonden minstens 4 - 6 uur omdat zowel de axonen (langs de middellijn septum zachte weefsel) en AOB zijn relatief ondiep <600 urn functies die toegankelijk geoxygeneerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof (superfused zijn aCSF). Dit VNO-AOB ex vivo bereiding maakt introductie van gecontroleerde stimuli in de VNO via een dunne canule, endirecte visuele toegang tot de kleine AOB voor gerichte plaatsing van de elektroden en / of live-fluorescentie microscopie. Deze werkwijze is voordelig indien men wenst om de circuits te bestuderen in de afwezigheid van anesthesie. Omdat deze benadering doorsnijdt centrifugale verbindingen, is het niet geschikt om onderzoek naar centrifugale modulatie van AOB functie. De VNO-AOB ex vivo voorbereiding is moeilijk om te leren, maar eenmaal bereikt produceert een betrouwbaar platform waarop circuit organisatie, informatieverwerking, en neurale plasticiteit onderzoeken in deze krachtige zintuiglijke circuit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Westers Institutional Animal Care en gebruik Comite UT goedgekeurd uitgevoerd, en werden zo gekozen dat stress, ongemak en pijn ervaren door de proefdieren te minimaliseren.
1. Dissection Chamber
Een aangepaste dissectie kamer en kleine, dunne plastic plank vereist voor de beste resultaten (figuur 1). Bouwen of verkrijgen van een dergelijke kamer op voorhand van een poging dit protocol.
2. Dissection Solutions
- Bereid 1 L standaard kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF) voor gebruik in de stappen 3,22-5,4. Voeg NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 1 mM, 25 mM NaHCO 3, NaH 2 PO 4 1,25 mM myo-inositol 3 mM, 2 mM natriumpyruvaat, natriumascorbaat 0,4 mM en glucose 25 mm tot 1 L van pyrogeenvrij water.
- Bereid de initiële dissectie aCSF (200 ml)te gebruiken in stappen 3,3-3,22. Neem 200 ml van Standard aCSF en de MgCl2 concentratie te verhogen met 9 mm door het toevoegen van 0,366 g MgCl2 hexahydraat.
- Bereid standaard Ringer-oplossing stimuli VNO dragen door de canule voor gebruik in stappen 4,11-5,4 die NaCl 115 mM, KCl 5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 2 mM, 25 mM NaHCO 3, HEPES 10 mM, glucose 10 mM.
- Bubble de 0,8 L standaard aCSF en 0,5 L Ringer met 95% O2, 5% CO2 gas in een 37 ° C waterbad gedurende ten minste 15 min. tot gebruik.
- Bel 200 ml initiële dissectie aCSF met 95% O2, 5% CO2 gas op ijs gedurende 15-20 min. totdat 4 ° C bereikt
3. Primaire Dissection
- Bereid de dissectie gebied. Plaats drie 35 mm petrischaaltjes, zuurstofrijk aCSF, onthoofding schaar, gebogen ontleden schaar, recht dissectieschaar, Adson pincet, een # 11 hoofdhuidel blad en handvat en een scheermesje op ijs.
- Nadat geoxygeneerde aCSF afkoeling tot 4 ° C, diep verdoven dier in een uitdroogtolerantie kamer met 2-5 ml Isothesia (99,9% isofluorane). Voer staart en voeten knijpen testen om ervoor te zorgen het dier is diep verdoofd.
- Zodra diepe narcose wordt bevestigd, onthoofden het dier en onmiddellijk het hoofd in een petrischaal gevuld met de gekoelde dissectie aCSF. OPMERKING: Dompel het weefsel gekoelde dissectie aCSF te koelen tijdens de gehele procedure wanneer niet in gebruik.
- Verwijder de onderste aspect (ventrale keelholte, onderkaak en tong) met een gebogen schaar.
- Met behulp van Adson pincet deglove (schil) de oppervlakkige huid en spieren bijlagen van de schedel. Schil de hoofdhuid van caudaal van rostrale totdat de enige site van gehechtheid is over de voortanden. Snijd het weefsel op het bevestigingspunt met een gebogen schaar. Verwijder de ogen door het vast te pakken met een pincet en trek hem uit de buurt van de voorbereiding. Noor het einde van de degloving procedure voorkomen overmatige kracht op de gevoelige nasale kraakbeen door de Adson tang om vrij aanhechtingen van de bovenkaak botten. OPMERKING: Maak de hoofdhuid van de caudale aspect van de schedel met rechte schaar.
- Met de rechte schaar, het kappen van de middellijn van de schedel van caudaal van rostrale totdat de schaar tips zijn een paar mm in de voorhoofdsbeenderen (net voor de rhinal sinus).
- Verwijder de pariëtale en frontale beenderen van de schedel met behulp van Adson pincet. OPMERKING: Stukken van de frontale bot zal blijven vaak aan de nasale botten caudaal van de rhinal sinus bevestigd. Verwijder deze stukken met zorg genomen niet om contact met de olfactorische bollen.
- Gebruik de scalpel om een coronale snede te maken via de frontale kwab 2 mm caudaal van de sinussen en verwijder de hersenen caudaal van de snede. Zorg ervoor dat de punt van het scalpel contacten de benige contour van de ventrale schedel volledig verbreken van de achterste weefsel. OPMERKING: Dit maaktverwijdering van de meerderheid van de hersenen zonder dat mechanische belasting van de laterale olfactorische traktaten of reukbollen.
- Verwijder de blootgestelde caudale aspecten van het ventrale schedel met rechte schaar. Laat de sinussen en de resterende zenuwweefsel.
- Verwijder de jukbeenboog en gezichtsspieren op de anatomische rechterkant van de schedel het gebruik van rechte schaar
- Draai de snuit boven (ventrale zijde naar boven) op het dak van de mond bloot.
- Knip het gehemelte direct caudaal van de snijtanden. Doe dit door de tip van de scalpel onder het gehemelte parallel aan het dak van de mond en beweeg het mes in de richting van de snijtanden.
- Pak de vrijgekomen (rostrale) rand van het gehemelte met Adson pincet en verwijderen door caudaal trekken.
- Op de anatomische linkerkant van de schedel, gebruik dan de scalpel aan de Palatijn foramen caudaal te breiden, te beginnen bij de kleine foramen nabij de kiezen. Dit te bereiken door de tip van de scalpel blaDe in de leegte in de buurt van de kiezen en draaien van de pols. LET OP: Wees uiterst voorzichtig om alleen gebruik maken van de punt van het mes - een diepe snede kan het septum weefsel beschadigen.
- Gebruik de punt van het scalpel, gesneden uit de Palatijn foramen via de snijtanden, te beginnen rostraal van de anatomische links Vomeronasal. Gebruik meerdere scoren bezuinigingen. Heeft de septum weefsel en vomeronasal zenuwen niet beschadigd door het invoegen van het blad te diep.
- Draai het weefsel, zodat het dorsale schedel naar boven is gericht en vervolgens oriënteren het rechte scheermes verticaal (parallel aan de middellijn) aan de caudale rand van de voorbereiding.
- Aan de ventrale rand van het weefsel, raakt het snijvlak van het scheermesje direct links van de middellijn. Schud het blad en bewegen langs de linker Palatijn foramen (cut regio geïntroduceerd in stap 3.14).
- Aan de dorsale rand van het weefsel, plaats de snijkant van het scheermes direct links van de middellijn (minder dan 1 mm).
- Bewaringhet mes evenwijdig aan de middellijn, rock de scheermes voorzichtig met druk in de richting van de voorste van het weefsel. Let op weerstand bij de getralied plaat. Onmiddellijk na het doorbreken van deze weerstand te stoppen. OPMERKING: Op dit punt wordt de rechterhelft losgemaakt van de linker hersenhelft. De enige resterende verbinding is tussen de hersenhelften langs de dorsale snuit juist voor de getralied plaat.
- Scheid de hemisferen door grijpen ze in de buurt van de staart kanten met gehandschoende vingers en voorzichtig zijwaarts en naar voren te draaien. Opmerking: Deze stap is een bron van experimentele variabiliteit, vooral muizen met afwijkende of brosse snuiten (bijvoorbeeld oudere muizen). Ook, tijdens een poging om de hemisferen van elkaar roteren, als sterke weerstand stuit scoren de dorsale snuit (juist voor de zeefplaat) de bindweefsels verzwakken. Terwijl u dit doet, neem uiterst voorzichtig niet aan de scalpel diep in te voegen, die het septum ti kunnen beschadigenssue en vomeronasal zenuwen.
- Breng een kleine hoeveelheid (50-100 pl) van weefsel lijm op de plank en plaats voorzichtig het laterale rand van de rechterhersenhelft op de lijm met behulp van de Adson tang. Verwijder overtollig vocht uit de zijkant van het preparaat met een papieren handdoek om voortijdige lijm polymerisatie en losse hechting aan de plank te voorkomen. OPMERKING: Breng een paar druppels van de gekoelde dissectie aCSF op het monster om de lijm polymerisatie te versnellen nadat het weefsel wordt geplaatst op de lijm. Dit zorgt ervoor dat het weefsel blijft stevig vastgehouden op de plank.
- Plaats een kleine hoeveelheid (3-5 mm diameter 2 mm diep) van vacuüm vet in het midden van de secundaire dissectie kamer en plaats de zijkant van de plank tegenover het weefsel stevig tegen het vet. Onmiddellijk vul de dissectie kamer met gekoelde dissectie aCSF, over te dragen aan de fijne dissectie gebied en beginnen perfusie met zuurstofrijk standaard aCSF. Richt de plank zodat het reukorgaan is direct in hetstroom van vers zuurstofrijk standaard aCSF.
4. Secundaire Dissection
- Verwijder alle zichtbare contralaterale (links) reukbol of corticale weefsel van de voorbereiding met behulp van fijne pincet. Knijp samen het fijn pincet (het vormen van een semi stompe punt), en plaats het op de dorsale en caudale deel van het weefsel in de buurt van de middellijn. Voorzichtig lopen de geknepen tang over de middellijn, het schillen van de weefsel weg van de rechter hersenhelft langzaam in anterieure beweging. Verwijderen van de contralaterale weefsel, zoals de contralaterale bulbus olfactorius weefsel. Wees uiterst voorzichtig niet te steken door het weefsel, waardoor er schade aan de AOB of vomeronasal zenuw kan veroorzaken.
- Let op de witte dura mater langs de dorsale / mediale oppervlak van het reukorgaan. Scheur deze dura mater langs de dorsale / caudale rand van de reukbol door grijpen op het witste deel van de dura met twee paar fijne pincet en trek ze uit de buurt van dat punt. De dura is strakrond de reukkwabben en gemakkelijk zich doorsnijden weefsel terwijl het wordt verwijderd. Voorkom beschadigingen aan de mediale zijde van de bulbus olfactorius en AOB zelf. OPMERKING: Als de dura weerstaat scheuren gemakkelijk op dit punt, de invoering van een klein sneetje met fijne voorjaar tip dissectie schaar om scheiding te vergemakkelijken.
- Langzaam en voorzichtig afpellen de frontale cortex met fijn pincet zonder beschadiging van de onderliggende reukbollen. Observeer een verzameling van bloedvaten die te zien zijn als een semi-transparante netto direct caudaal van de AOB. Verwijder deze net met fijne tang om elektrode penetratie in elektrofysiologische experimenten te vergemakkelijken. Pak het net met een tang als het scheidt van de AOB tijdens frontale cortex intrekken en verwijderen door caudaal en mediaal trekken, zorg dat u de AOB niet aanraakt. Zodra de frontale cortex is gescheiden van de olfactorische bollen, verwijderen door te snijden met een pincet ventrale en posterior aan de AOB. OPMERKING: Neem extreme voorzichtig met netto verwijderen, als het te ruw wordt gedaan de glomerulaire laag kan beschadigd raken.
- In de blootgestelde contralaterale neusholte, haal dan contralaterale septum weefsel (dun geelachtig blad met bloedvaten) met de fijne pincet. Pak het weefsel op de caudale / dorsale regio (in de buurt van het septum bot) en trek / til het weefsel naar de voorste zijde. OPMERKING: De contralaterale septum weefsel kan per ongeluk worden verwijderd tijdens de hemisectie (stap 3.20). In dat geval acht witte, avasculaire septum kraakbeen en licht transparant, gevasculariseerde septum bot. Als dit het geval is, kan stap 4.4 worden overgeslagen.
- Verwijder de contralaterale VNO zorgvuldig door het uitvoeren van een enkel punt van de fijne tang tussen de septum kraakbeen en de VNO "vleugel" (een dun stukje botweefsel dat langs de dorsale rand van beide VNOs loopt.
- Na de vleugel onthechting van het kraakbeen, bewegen de punt van tang ventraalin de contralaterale VNO buurt van de middellijn. Herhaal deze stap op verschillende locaties langs de rostrale / caudale as van de contralaterale VNO om het los te maken, waardoor het kan worden verwijderd door met een pincet vast te pakken en op te tillen.
- Bereid je voor om het septum kraakbeen te verwijderen door het maken van een snede in de buik / caudale rand (waar het versmalt tot een witte avasculaire strook die langs de ventrale rand van het septum bot) met fijne pincet.
- Verwijder het septum kraakbeen door te knijpen de fijne tang samen om een semi stompe punt te maken. Identificeer de snede gemaakt in stap 4.6, steek de geknepen pincet achter (lateraal) aan die snee, en dan langzaam til het kraakbeen van het septum weefsel en gaan rostraal. OPMERKING: Sluit de onderliggende septum weefsel niet verstoren. Als het kraakbeen wordt opgeheven, acht de onderliggende vel septum weefsel stretch vanwege losse verklevingen aan het kraakbeen. Een periodieke, zachte en stabiele beweging van de geknepen fijne tang langs deze plaats van losse eendhesion kunnen zeer bevorderlijk succesvolle scheiding van de twee structuren.
- Gebruik een paar # 3 tang met een gebogen tip om het septum bot te verwijderen. Nader de septale been schuin bijna evenwijdig aan het vlak van de septale bot. Steek de gebogen tand tussen de septum weefsel en septum bot. Pak het bot met de tang en beweeg het been heen en weer tot het scheuren in de buurt van de getralied plaat. OPMERKING: In sommige gevallen zal het septum bot weerstaan breken in de buurt van de getralied plaat. In dit geval kunt u fijne tang om voorzichtig te scoren het septum bot langs de dorsale / ventrale as anterieure de getralied plaat, herhaal dan stap 4.8.
- Verwijder de witte kraakbeen net rostraal van de VNO door te knijpen met een paar fijne tang bij de ingang en rostraal trekken met een ander paar fijne pincet.
- Bevestig de polyimide canule een snelle perfusie apparaat en start de stroom van Ringer-oplossing (0,1-0,3 ml / min) door de polyimide canule.LET OP: Meet debiet met een in-line, klein volume debietmeter. Het gebruik van computergestuurde pneumatische stimulus schakelunit vermindert debiet verandert tijdens de stimulatie. Vergelijk neurale reacties op stimuli te testen met reacties op een mock stimulus (controle Ringer-oplossing) om ervoor te zorgen reacties zijn stimulus specifiek.
- Richt de canule parallel aan de VNO ingang. Als de canule bevredigende evenwijdig aan VNO ingang kijken als de uitlaatdruk veroorzaakt VNO aan "opblazen", waardoor evacuatie van het bloedvat. Plaats onmiddellijk de canule in het VNO, het bijhouden van de hoek van de canule constant zodat het parallel aan de VNO opening blijft. Opmerking: Het kan nuttig zijn om de canule te houden met een paar fijne tang tegen de plastic plank en een andere paar fijne tang hoek het einde van de canule iets omhoog. Als men per ongeluk plaatst de canule achter het VNO, kan de uitstroom ook leiden tot de VNO bloedvatte evacueren, waardoor de indruk juiste cannulatie uitgevoerd. De juiste locatie kan worden bevestigd door het opnemen van een kleurstof in de Ringer-oplossing. Als de canule goed is geplaatst, moet de kleurstof enige uitgang via de VNO ingang. Bovendien kan een juiste plaatsing bevestigen verbeteren door de canule gemakkelijk zichtbaar door de semi-transparante mediale aspect van de VNO.
- Verplaats de plastic plank langzaam tot de AOB is in de directe stroom van de standaard aCSF, zorg dat u de canule niet te verjagen uit het VNO. De dissectie is voltooid en de beoordeling van een fysiologische functie kan direct beginnen. Stap 5 beschrijft in het kort een aanpak voor het maken van een dergelijke beoordeling.
5. Evaluatie
- Dringen het oppervlak van de AOB met 2-4 MQ borosilicaatglas micro-elektrode bevestigd aan een extracellulaire versterker en oscilloscoop.
- Langzaam vooruit de micro-elektrode tot een diepte van 100-200 micrometer uit deoppervlak met een snelheid van 50 um / min. OPMERKING: In dit weefsel diepte, zal men tegenkomen occasionele spontane actiepotentiaal golfvormen geïllustreerd door scherpe, korte (~ 1-2 msec) doorbuiging van de micro-elektrode spanning.
- Bij het tegenkomen van een actiepotentiaal golfvorm, stop het bevorderen van de micro-elektrode.
- Observeren en / of noteer de actiepotentiaal koers tijdens het verwisselen van de stimulus levering oplossing van controle Ringer een bekende activator van VSN activiteit (bv., Ringer-oplossing met 50 mM KCl). Als de dissectie succesvol was, kan een stimulus-afhankelijke verandering in actiepotentiaal tarief of lokale veld potentieel worden waargenomen. Opmerking: Niet alle AOB neuronen reageren op elke stimulus met een toename vuursnelheid (inclusief Ringer's oplossing met 50 mM KCl). Een stimulus-afhankelijke afname in vuursnelheid geeft ook functionele connectiviteit en een succesvolle dissectie. Indien twee of meer neuronen aangetroffen datniet reageren op VNO stimulatie, of als er geen actiepotentialen worden waargenomen na meervoudige elektrode penetraties, suggereert dit een mislukte dissectie. Als dit het geval is, kan een nieuwe ontleding bij stap 3 worden gestart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het bereiken van succes met deze voorbereiding duurt uitgebreide praktijk, en heeft verschillende stadia waarin het kan mislukken. Men zou verwachten dat vele pogingen nodig voor het bereiken van succes. De aangepaste dissectie kamer nodig is voor een succesvolle afronding van dit protocol, en dient voorafgaand aan de latere stadia van de dissectie worden verkregen. De kamer ontwerp in figuur 1 is voldoende voor dit doel, en kan worden gemaakt van relatief goedkope kunststof met minimale bewerking eisen. Als men niet over de capaciteit om een dergelijke kamer te produceren, kunnen lokale of online bewerking bedrijven worden geraadpleegd en kan de kamer te bouwen voor een vergoeding.
Een grote bron van variabiliteit over de voorbereidingen is de dichtheid en de broosheid van de botten van de schedel en de snuit van de proefdieren. Tijdens de hemisectie stappen (stappen 3,14-3,20), is het doel om zowel vomeronasal organen isoleren met de ipsilaterale septum weefsel enipsilaterale accessoire reukorgaan. Het is echter niet ongebruikelijk dat de septale weefsel blijft vastzitten aan de contralaterale hemisfeer, vooral bij bevestigingspunten aan de dorsale beenderen van de snuit. Figuur 2 toont een voorbeeld van een effectieve en ineffectieve hemisectie.
Andere gebruikelijke dissectie fouten ontstaan bij de fijne dissectie, waarbij de axonen van de vomeronasale zenuw kan worden beschadigd in het septum weefsel bij Vomeronasal (Figuren 3A en 3B) of bij de AOB (Figuren 3C en 3D). Deze en soortgelijke gebeurtenissen zullen leiden tot onvolledige verbinding tussen VSNs en de AOB, waardoor de voorbereidingen onbruikbaar.
Het laatste obstakel voor het succes van de voorbereiding is het VNO infusen (stap 4.11). Juiste plaatsing van de VNO canule zal resulteren in onder druk van het VNO lumen, waardoor onmiddellijke uitwijzing van resterende bloed uit de vomeronasal pomp. De canule moet duidelijk zichtbaar zijn onder de relatief transparante vomeronasal epitheel en het uiterlijk van de canule moet uniform langs zijn lengte in het VNO zijn. Na succesvolle afronding van de procedure, kan men functionele connectiviteit te controleren met behulp van een fysiologische test zoals enkele eenheid elektrofysiologische opnames van neurale activiteit in reactie op VNO stimulatie met een bekende bron van VSN geurstoffen (figuur 4).
Figuur 1. A) technische tekeningen van het aangepaste dissectie kamer gebruikt in de stappen 3,22-5,4. OPMERKING: Kleine gaten kunnen worden geboord om de oplossing en vergassen en uitlaten zoals gewenst B) Voorbeeld foto van dissectie kamer gebruikt in dit protocol tegemoet te komen.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. A, B) Vertegenwoordiger beelden van succesvolle (A) en mislukte (B) preparaten na de hemisectie fase (stap 3.20). VNO, septum weefsels en reukbollen (OB) moeten alle worden gehouden van de ipsilaterale hemisfeer (in casu rechts (onder) halfrond. Bij neusschelpen zichtbaar op de ipsilaterale hemisfeer is de dissectie mislukt. Tick merken 1 mm van elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 3. A, B) Vertegenwoordiger beelden van intacte en beschadigde septum weefsel tussen de VNO en AOB. In B, het ontleden tang gemaakt onbedoeld contact met het weefsel, beschadiging van de VN axon traktaten. C, D) Intact en beschadigd AOB. In D, het verwijderen van de dura rond de ipsilaterale OB resulteerde in het doorsnijden van de vomeronasal zenuw in de buurt van de AOB, waardoor een zichtbare vlek van weefsel in de buurt van de mediale AOB. Schaalbalken zijn 1 mm.
Figuur 4. A) Voorbeeld raster plot van actiepotentialen opgenomen vanaf een AOB neuron (extracellulaire eenheid opname) in een succesvolle voorbereiding. Sporen in zwart tonen geen verandering vuren wanneer de controle Ringer-oplossing werd geleverd aan de VNO gedurende 5 sec (grijs box). Sporen rood tonen de respons van de zelfde neuron VNO stimulatie met BALB / c vrouwtjes urine 100-voudig verdund in zoutoplossing. B Ringer's) Peri-stimulus time histogram van dezelfde reacties in A. Fout balken geven standaardfouten van het gemiddelde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De VNO-AOB ex vivo voorbereiding beschreven in dit protocol is een nuttig alternatief voor verdoofd in vivo 5-7 en acute live-schijfje 17 experimenten van AOB functie. In tegenstelling tot acute AOB slice experimenten, die ook circuit elementen voor elektrofysiologische en optische opnamen bloot, dit preparaat behoudt alle sensorische afferenten en intra-AOB verbindingen. Hoewel dit kan ook gezegd worden van verdoofde in vivo benaderingen, de aanwezigheid van anesthetica noodzakelijkerwijs verandert neurale functie, namelijk prikkelende / remmende balans, die cruciaal is voor de verwerking van informatie in deze en andere olfactorische circuits 18. Omdat de bereiding vermijdt het gebruik van verdovingsmiddelen, en omdat de AOB oppervlak volledig blootgesteld aan de superfusate, is vatbaar voor farmacologische onderzoeken naar lokale neurale verwerking.
Er zijn natuurlijk enkele beperkingen van dit preparaat. Er is evfeiten laten geleidelijke degeneratie van het diepste AOB lagen, namelijk de diepe delen van de interne cellaag, die vele remmende granule cellen huizen 16. Daarnaast zijn centrifugale ingangen verbroken tijdens de dissectie, af te schaffen van actieve deelname aan AOB functie. Canulatie van de VNO omzeilt de normale werking van de vomeronasale pomp, en spoelt weg de endogene vocht aanwezig is in de VNO lumen.
Kritische stappen voor succes met deze methode zijn de delicate hemisectie (stap 3.20) en VNO infusen (stap 4.11). Men kan verwachten dat uitgebreide oefening nodig om betrouwbaar te produceren functioneel verbonden ex vivo preparaten. De secundaire kamer dissectie hier gebruikt kunnen worden om functionele connectiviteit beoordelen enkelvoudige-elektrode opnames tijdens stimulatie van het VNO bij bronnen van muis feromonen (bijvoorbeeld verdunde urine). 13,15 Modificaties van de secundaire kamer kan dissectie be gemaakt waardoor het preparaat gedraaid hoeken geschikt voor andere doeleinden, zoals multiphoton beeldvorming.
De vele technische hindernissen te bestuderen van de levende AOB hebben lang vormde een belemmering voor ons begrip van sociale geur en feromonen sensorische verwerking. Door ontleden weg de eerste neurale componenten van dit sensorische route in deze dissectie protocol men in staat experimentele toegang tot deze moeilijk studie circuits krijgen. We hebben dit preparaat voor gedetailleerde onderzoeken naar vomeronasal sensorische verwerking 19 en sensorische mapping (Hammen et al.., Ongepubliceerd) gebruikt. Deze techniek zal nuttig zijn voor toekomstige studies in sensorische verwerking in de AOB, vooral die waarbij optische toegang tot het weefsel (bv. multiphoton beeldvorming en optogenetics). De voordelen van deze aanpak een aanvulling op die van in vivo technieken en het verbeteren van onze toolkit voor het onderzoek naar de neurale mechanismen van vomeronasal gemedieerde zociële en reproductieve gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen significante belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door R00 DC011780 (JPM: NINDS, NIH), F30 DC011673 (GFH: NINDS, NIH) en de UT Southwestern opstarten fondsen (JPM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Straight Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Fine Scissors-Straight | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Scissors-Curved | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Scalpel Blades | Fisher Scientific | 3120030 | |
| Straight Carbon Steel Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 35 mm Petri Dish | Fisher Scientific | 08-772-21 | |
| Dissection Chamber | Custom | N/A | See Figure 1 |
| Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm | Custom | N/A | |
| Dow Corning Silicon Vacuum grease | Fisher Scientific | 146355D | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| #5 Forceps, Biologie Tip | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| #5 Forceps, Student | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | EW-45505-00 | |
| 1/16" Tubing | Fisher Scientific | 14-171-129 | |
| Two ton epoxy | Grainger | 5E157 | |
| ValveBank Pressurized Perfusion Kit | AutoMate Scientific | 09-16 | |
| ValveLink digital/manual controller | AutoMate Scientific | 01-18 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | various | |
| KCl | Sigma-Aldrich | various | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| MgCl2 hexahydrate | Sigma-Aldrich | various | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | various | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | various | |
| myo-inositol | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | various | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | various | |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | various | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | various |
References
- Bruce, H. M. An exteroceptive block to pregnancy in the mouse. Nature. 184, 105 (1959).
- Bellringer, J. F., Pratt, H. P., Keverne, E. B. Involvement of the vomeronasal organ and prolactin in pheromonal induction of delayed implantation in mice. J Reprod Fertil. 59, 223-228 (1980).
- Bean, N. J. Modulation of agonistic behavior by the dual olfactory system in male mice. Physiol Behav. 29, 433-437 (1982).
- Meredith, M. Vomeronasal organ removal before sexual experience impairs male hamster mating behavior. Physiol Behav. 36, 737-743 (1986).
- Hendrickson, R. C., Krauthamer, S., Essenberg, J. M., Holy, T. E. Inhibition shapes sex selectivity in the mouse accessory olfactory bulb. J Neurosci. 28, 12523-12534 (2008).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (2010).
- Tolokh, I. I., Fu, X., Holy, T. E. Reliable sex and strain discrimination in the mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 13903-13913 (2013).
- Luo, M., Fee, M. S., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the accessory olfactory bulb of behaving mice. Science. 299, 1196-1201 (2003).
- Binns, K. E., Brennan, P. A. Changes in electrophysiological activity in the accessory olfactory bulb and medial amygdala associated with mate recognition in mice. Eur J Neurosci. 21, 2529-2537 (2005).
- Leszkowicz, E., et al. Noradrenaline-induced enhancement of oscillatory local field potentials in the mouse accessory olfactory bulb does not depend on disinhibition of mitral cells. Eur J Neurosci. 35, 1433-1445 (2012).
- Ames, A. 3r, Gurian, B. S. Electrical Recordings from Isolated Mammalian Retina Mounted as a Membrane. Arch Ophthalmol. 70, 837-841 (1963).
- Flock, A. F., Strelioff, D. Studies on hair cells in isolated coils from the guinea pig cochlea. Hear Res. 15, 11-18 (1984).
- Woodbury, C. J., Ritter, A. M., Koerber, H. R. Central anatomy of individual rapidly adapting low-threshold mechanoreceptors innervating the 'hairy' skin of newborn mice: early maturation of hair follicle afferents. J Comp Neurol. 436, 304-323 (2001).
- Llinas, R., Muhlethaler, M. An electrophysiological study of the in vitro, perfused brain stem-cerebellum of adult guinea-pig. The Journal of physiology. 404, 215-240 (1988).
- Riviere, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459, 574-577 (2009).
- Meeks, J. P., Holy, T. E. An ex vivo preparation of the intact mouse vomeronasal organ and accessory olfactory bulb. J Neurosci Methods. 177, 440-447 (2009).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405, 792-796 (2000).
- Kato, H. K., Chu, M. W., Isaacson, J. S., Komiyama, T. Dynamic sensory representations in the olfactory bulb: modulation by wakefulness and experience. 76, 962-975 (2012).
- Meeks, J. P., Arnson, H. A., Holy, T. E. Representation and transformation of sensory information in the mouse accessory olfactory system. Nature. 13, 723-730 (2010).
