Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

Summary

Die Maus akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) ist schwierig gewesen, im Rahmen der sensorischen Kodierung zu studieren. Hier zeigen wir eine Dissektion, die eine Ex-vivo-Vorbereitung, in der AOB Neuronen funktionell bleiben, um ihre angeschlossenen Peripherieeingänge, die Erleichterung der Forschung in der Informationsverarbeitung von Maus Pheromone und Kairomonen produziert.

Abstract

Die Maus akzessorischen olfaktorischen System (AOS) ist eine spezialisierte Sinnespfad zur Erfassung nichtflüchtigen sozialen Gerüche, Pheromone und Kairomonen. Die erste neuronalen Schaltkreis in der AOS-Weg, die so genannte akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB), spielt eine wichtige Rolle bei der Gründung Sex-typische Verhaltensweisen wie Aggression und territorialen Paarung. Diese kleine (<1 mm ^3)-Schaltung besitzt die Fähigkeit, einzigartige Verhaltenszustände, wie z. B. Geschlecht, Belastung, Stress und von chemosensorischen Signale in den Sekreten und Ausscheidungen von Artgenossen zu unterscheiden. Während die kompakte Organisation dieses Systems präsentiert einzigartige Möglichkeiten für die Aufnahme von großen Teilen der Schaltung gleichzeitig bleibt Untersuchung der sensorischen Verarbeitung in der AOB eine Herausforderung, vor allem wegen seiner nachteiligen Lage experimentell im Gehirn. Hier zeigen wir einen mehrstufigen Präparation, die die intakte AOB in einem einzigen Halbkugel der vorderen Schädel Maus entfernt, so dass eine VerbindungIonen sowohl der peripheren sensorischen Neuronen vomeronasal (VSN) und der lokalen neuronalen intakt. Das Verfahren macht die AOB Oberfläche einer Sichtprüfung zu leiten, erleichtert elektrophysiologischen und optischen Aufnahmen von AOB Schaltungselemente in Abwesenheit von Anästhetika. Nach dem Einlegen einer dünnen Kanüle in das Vomeronasalorgan (VNO), die die VSNs beherbergt, kann man direkt aussetzen, die den Umfang der sozialen Gerüchen und Pheromonen bei der Aufnahme Downstream-Aktivität in der AOB. Dieses Verfahren ermöglicht kontrollierte Untersuchungen über AOS Informationsverarbeitung, die Licht auf die Mechanismen Verknüpfung Pheromon Exposition zu Veränderungen im Verhalten zu vergießen kann.

Introduction

Sinnesverarbeitung im Gehirn von Säugetieren umfasst in der Regel mehrere wechselseitig verbundenen neuronalen Schaltkreisen, die jeweils bestimmte Merkmale extrahiert aus sensorischen Input. In sensorischen Bahnen, ist eine frühzeitige Informationsverarbeitung entscheidend für normale Wahrnehmung und Verhalten. In der akzessorischen olfaktorischen System (AOS) ist der akzessorischen olfaktorischen Bulbus (AOB) die Haupt neuronalen Schaltkreis die Verknüpfung der sensorischen Peripherie zum nachgeschalteten Strukturen, die Hormonhaushalt ^1,2, Aggression ^{3, 4} und Erregung zu diktieren. Als solches wird die Informationsverarbeitung innerhalb dieser Schaltung stark auf Veränderungen in Tierverhalten verbunden.

Das Zubehör Riechkolben ist bei Mäusen und Ratten an der dorsalen / Schwanz / hinteren Teil des Hauptriechkolben (MOB), die unter dem dichten befindet, vaskularisiert rhinal Höhle. Die AOB erhält afferente Innervation von Axone der peripheren sensorischen Neuronen vomeronasal (VSN), die in der Vomeronasalorgan (VNO) wohnen, eine kl blind endenden Schlauch im vorderen Schnauze knapp über den weichen Gaumen. Diese Axone durchqueren die empfindlichen Bogen von septalen Gewebe am medialen Rand der Nasenwege. Mehrere Studien haben AOB neuronalen Antworten auf Quellen von AOS Gerüche (wie Maus Urin) in vivo untersucht mit narkotisierten Mäusen ^5-7 oder frei-Erkundung ⁸ Tiere. In-vivo-Studien beteiligt sind (a) Luftröhrenschnitt zu tiefe Narkose zu gewährleisten und zu verhindern das Ansaugen von Flüssigkeit Reize ^5-7, (b) Stimulation des sympathischen Halsganglion ⁶ oder direkte Kanülierung der Vomeronasalorgans ^5,7 in den nichtflüchtigen Gerüche einführen Die heroische betäubt und (c) Kraniotomien mit oder ohne Stirnlappen Ablationen zur Elektrode Aufstieg in die AOB ⁶ ermöglichen. Awake / verhalten Studien ^8-10 beteiligten chirurgischen Implantation eines Microdrive. In der Summe sind diese experimentellen Paradigmen mächtig, aber extrem schwierig und erfordern oft Anästhesie.

(ex vivo) mit einigem Erfolg ^11-15 erhalten. Da die Verbindungen zwischen dem VNO und AOB bleiben ipsilateral und weil die Mittellinie Septum-Gewebe um oxidierte Superfusat in einem einzigen Halbkugel ausgesetzt werden, haben wir versucht, so ein Single-Hemisphäre ex vivo Ansatz zu entwickeln, um diese Strukturen zu isolieren und gleichzeitig ihre funktionelle Konnektivität. Wir haben vor kurzem bei der Erreichung dieses Ziels ¹⁶ gelungen. Dies hält sowohl die Herstellung VNO und AOB lebendig und funktionell für mindestens 4 verbunden - 6 Stunden, da sowohl die Axone (entlang der Mittellinie weiche Gewebe Septum) und AOB sind relativ flach <600 um Funktionen, die zugänglich oxygenierten künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (strömt sind aCSF). Das VNO-AOB ex vivo Vorbereitung ermöglicht Einführung der kontrollierten Reize in der VNO über eine dünne Kanüle, unddirekten visuellen Zugang zum kleinen AOB für gezielte Platzierung der Elektroden und / oder Live-Fluoreszenzmikroskopie. Dieses Verfahren ist vorteilhaft, wenn man wünscht, diese Schaltungen in Abwesenheit von Anästhetika zu studieren. Da dieser Ansatz trennt Kreisel Verbindungen, ist es nicht gut, Ermittlungen zu Schleuder Modulation der AOB-Funktion geeignet. Das VNO-AOB ex vivo Vorbereitung ist schwer zu lernen, aber einmal erreicht, erzeugt eine zuverlässige Plattform zur Schaltung Organisation, Informationsverarbeitung und neuronaler Plastizität in dieser leistungsfähigen Sinnes Schaltung zu untersuchen.

Protocol

Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Protokollen von der UT Southwestern Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss genehmigt wurde, und wurden so gewählt, dass Stress, Beschwerden und Schmerzen, die durch den Versuchstieren erlebt zu minimieren.

1. Dissection Kammer

Eine benutzerdefinierte Dissektion Kammer und kleinen, dünnen Plastikplanke für die besten Ergebnisse (Abbildung 1) erforderlich. Bauen oder zu erhalten, wie eine Kammer im Vorfeld versucht, dieses Protokoll.

2. Dissection Lösungen

1. Herstellung von 1 l Standard künstlichen Cerebrospinalflüssigkeit (aCSF) zur Verwendung in Stufen von 3,22 bis 5,4. Hinzufügen NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, CaCl _{2 2} mM, 1 mM MgCl _2, 25 mM NaHCO _3, NaH ₂ PO ₄ 1,25 mM, myo-Inosit 3 mM, 2 mM Natriumpyruvat, Natriumascorbat, 0,4 mM und Glucose 25 mM bis 1 l pyrogenfreiem Wasser.
2. Bereiten Sie die Anfangs Dissektion aCSF (200 ml) fürverwenden in Schritten von 3,3 bis 3,22. Nehmen Sie 200 ml Standard-aCSF und erhöhen die MgCl _{2-Konzentration} von 9 mM durch Zugabe von 0,366 g _{MgCl2-Hexahydrat.}
3. Vorbereitung Standardringerlösung um Stimuli an das VNO durch die Kanüle zur Verwendung in Schritten von 4,11 bis 5,4, enthaltend NaCl 115 mM, KCl 5 mM, CaCl _2, 2 mM MgCl _{2, 2} mM, 25 mM NaHCO _3, 10 mM HEPES tragen, Glucose 10 mM.
4. Blasen die 0,8 l Standard aCSF und 0,5 L Ringer mit 95% O _2, 5% CO _2-Gas in einem 37 ° C Wasserbad für mindestens 15 min bis zum Gebrauch.
5. Blase die 200 ml anfänglichen Präparation aCSF mit 95% O _2, 5% CO _2-Gas auf Eis für 15-20 Minuten, bis es 4 ° C erreicht

3. Primäre Dissection

1. Bereiten Sie die Dissektion Bereich. Platzieren Sie drei 35 mm Petrischalen, sauerstoff aCSF, Enthauptung Schere gebogen Dissektionsscheren, gerade Dissektionsscheren, Adson Pinzette, ein # 11 Kopfhautel Klinge und Griff und eine Rasierklinge auf Eis.
2. Nach oxygenierten aCSF wurde auf 4 ° C abgekühlt, tief anästhesiert das Tier in einer Trocknungskammer unter Verwendung von 2-5 ml Isothesia (99,9% Isofluran). Führen Schwanz und Fuß Prise Tests, um sicherzustellen, das Tier tief anästhesiert.
3. Sobald tiefe Narkose bestätigt wird, das Tier zu enthaupten und sofort legen den Kopf in einer Petrischale mit Kalt Dissektion aCSF gefüllt. HINWEIS: Tauchen Sie die Gewebe in gekühlten Dissektion aCSF es kühl zu halten während des gesamten Verfahrens, wenn nicht in Gebrauch.
4. Entfernen Sie die untere Seiten (ventralen Rachen, Unterkiefer und Zunge) mit einer gebogenen Schere.
5. Mit Pinzette Adson deglove (Schale) die oberflächliche Haut-und Muskelansätze aus dem Schädel. Schälen Sie die Kopfhaut vor kaudal bis rostral die einzige Website der Befestigung ist über die vorderen Zähne. Schneiden Sie das Gewebe an der Befestigungspunkt mit einer gebogenen Schere. Die Augen entfernen, indem Sie sie mit einer Pinzette und ziehen Sie sie aus der Vorbereitung. NOhr das Ende der degloving Verfahren vermeiden übermäßige Kraft auf den empfindlichen Nasenknorpel mit den Adson Pinzette kostenlos Muskelansätze aus den oberen Kieferknochen. HINWEIS: Nehmen Sie die Kopfhaut vor der Schwanz Aspekt der Schädel mit geraden Schere.
6. Mit den geraden Schere, schneiden Sie die Mittellinie des Schädels von kaudal bis rostral die Scherenspitzen sind ein paar mm in die Stirnbein (kurz vor der rhinal Sinus).
7. Entfernen Sie den Scheitel-und Stirn Knochen des Schädels mit Adson Pinzette. HINWEIS: Stücke des Stirnbeins oft bleiben an der nasalen Knochen kaudal der rhinal Sinus angebracht. Entfernen Sie diese Stücke mit Sorgfalt, nicht die Riechkolben zu kontaktieren.
8. Verwenden Sie das Skalpell, um einen koronalen Schnitt durch den Frontallappen 2 mm kaudal der Nasennebenhöhlen machen und entfernen Sie dann das Gehirn kaudal der Schnitt. Sicherstellen, dass die Spitze des Skalpells Kontakte die knöcherne Kontur des ventralen Schädel, um die hinteren Gewebe vollständig zu durchtrennen. HINWEIS: Dies ermöglichtEntfernung der Mehrheit des Gehirns, ohne die mechanische Belastung auf den seitlichen Flächen oder olfaktorischen Bulbus olfactorius.
9. Entfernen Sie die freiliegenden Schwanz Aspekte des ventralen Schädel mit geraden Schere. Lassen Sie die Nasennebenhöhlen und übrigen Nervengewebe.
10. Entfernen Sie den Jochbogen-und Gesichtsmuskulatur auf dem anatomischen rechten Seite des Schädels mit geraden Schere
11. Drehen Sie die Schnauze über (Bauchseite nach oben), um das Dach des Mundes aus.
12. Cut und entfernen Sie den Gaumen unmittelbar kaudal der Schneidezähne. Tun Sie dies, indem Sie die Spitze des Skalpellklinge unter dem Gaumen parallel zum Dach der Mund und bewegen Sie die Klinge in Richtung der Schneidezähne dann.
13. Fassen Sie die befreit (rostral) Rand der Gaumen mit Adson Pinzette und kaudal durch Ziehen entfernen.
14. Auf der anatomischen linken Seite des Schädels, verwenden Sie das Skalpell, um die Gaumen Foramen kaudal sich ausgehend von den kleinen Foramen in der Nähe der Backenzähne. Sie erreichen dies, indem Sie die Spitze des Skalpells blade in die Leere in der Nähe der Backenzähne und Drehen des Handgelenks. HINWEIS: Seien Sie besonders vorsichtig, nur die Spitze der Klinge - ein tiefer Schnitt kann das Septum-Gewebe schädigen.
15. Mit der Spitze des Skalpellklinge, von den Pfalz Foramen durch die Schneidezähne geschnitten, beginnend rostral des anatomisch links Vomeronasalorgans. Verwenden Sie mehrere Scoring-Schnitte. Sie das Septum-Gewebe und Nerven vomeronasal nicht beschädigen, indem Sie die Klinge zu tief.
16. Schalten Sie das Gewebe, so dass die Rücken Schädel nach oben orientieren und dann das Rasiermesser Klinge vertikal (parallel zur Mittellinie) am kaudalen Rand der Zubereitung.
17. Am ventralen Rand des Gewebes, berühren die Schneidkante der Rasierklinge sich unmittelbar links von der Mittellinie. Schütteln Sie die Klinge und bewegen sich entlang der linken Gaumen Foramen (Schnittbereich in Schritt 3.14 eingeführt).
18. Am dorsalen Rand des Gewebes, legen die Schneidkante des Rasierers unmittelbar links von der Mittellinie (weniger als 1 mm).
19. Keepingdie Klinge parallel zur Mittellinie, rocken die Rasierklinge langsam mit Druck in Richtung der vorderen des Gewebes. Beachten Widerstand an der Lamina cribrosa. Stoppen Sie sofort nach durch diesen Widerstand zu brechen. HINWEIS: An dieser Stelle wird die rechte Hemisphäre von der linken Hemisphäre gelöst. Die einzige verbleibende Verbindung zwischen den Halbkugeln entlang der dorsalen Schnauze anterior der Siebplatte.
20. Trennen Sie die Hemisphären durch Greifen sie in der Nähe der Schwanz Seiten mit behandschuhten Fingern und sanft seitlich und vorne Drehen auf. HINWEIS: Dieser Schritt ist eine Quelle der experimentellen Variabilität, vor allem in Mäusen mit abweichenden oder spröde Schnauzen (zB ältere Mäuse). Auch beim Versuch, die Halbkugeln voneinander weg zu drehen, wenn starke Widerstand stößt punkten die dorsale Schnauze (anterior der Lamina cribrosa), um das Bindegewebe schwächen. Während Dabei nehmen extreme Vorsicht nicht das Skalpell tief einfügen, die die Septum-ti schädigen könnenUSGABE vomeronasal und Nerven.
21. Eine kleine Menge (50-100 ul) Gewebekleber auf dem Brett zu platzieren und vorsichtig den seitlichen Rand der rechten Hemisphäre auf den Leim mit den Adson Pinzette. Überschüssige Feuchtigkeit von der lateralen Seite des Präparats mit einem Papiertuch, um eine vorzeitige Polymerisation Klebstoff und lose Haftung auf dem Brett zu verhindern. HINWEIS: Geben Sie einige Tropfen des Kühl Dissektion aCSF auf die Probe, um den Kleber Polymerisation zu beschleunigen, nachdem Gewebe wird auf den Leim gelegt. Dies stellt sicher, dass das Gewebe bleibt fest mit dem Brett statt.
22. Setzen Sie einen kleinen Betrag (3-5 mm Durchmesser, 2 mm tief) von Vakuumfett in der Mitte der Sekundär Dissektion Kammer und legen Sie die Seite der Planke gegenüber dem Gewebe fest gegen das Fett. Die Dissektion Kammer sofort füllen mit gekühltem Dissektion aCSF, Transfer zum feinen Sezierung Bereich und beginnen Perfusion mit sauerstoff Standard aCSF. Richten Sie das Brett, so dass der Riechkolben ist direkt in dieStrom von frisch mit Sauerstoff angereicherte Standard aCSF.

4. Sekundär Dissection

1. Entfernen Sie alle sichtbaren kontralateralen (links) Riechkolben oder Rindengewebe von der Vorbereitung mit feinen Pinzette. Pinch zusammen die feinen Pinzette (Bildung einer halb stumpfen Punkt), und dann legen Sie sie an der Rücken-und Schwanzteil der Gewebe in der Nähe der Mittellinie. Sanft laufen die Zange eingeklemmt entlang der Mittellinie, Peeling das Gewebe von der rechten Hemisphäre langsam in anterioren Bewegung. Entfernen Sie alle kontralateralen Gewebe, einschließlich der kontralateralen Riechkolben Gewebe. Seien Sie äußerst vorsichtig, um nicht durch das Gewebe, die Schäden an der AOB oder vomeronasal Nerven verursachen können stechen.
2. Beachten Sie die weißen Dura Mater entlang der dorsalen / medialen Fläche des Bulbus olfactorius. Reißen Sie diese Dura mater entlang der dorsalen / kaudalen Rand des Riechkolbens durch Greifen an der weißesten Teil der Dura mit zwei Paaren von feinen Pinzette und ziehen sie weg von diesem Punkt. Die Dura dichteingewickelt um den Riechkolben, und kann leicht selbst durch das Gewebe schneiden, während es entfernt wird. Schäden an der medialen Fläche des Bulbus olfactorius und den AOB selbst zu vermeiden. HINWEIS: Wenn die Dura wider reißen leicht an dieser Stelle vorstellen einen kleinen Schnitt mit feinen Federspitze Dissektion Schere, um die Trennung zu erleichtern.
3. Langsam und vorsichtig abziehen der frontalen Kortex mit einer feinen Pinzette, ohne die zugrunde liegende Riechkolben. Beobachten Sie eine Sammlung von Blutgefäßen als semi-transparent netto sofort kaudal der AOB erscheinen. Entfernen Sie dieses Netz mit einer feinen Pinzette, um die Elektrode Eindringen in elektrophysiologischen Experimenten erleichtern. Fassen Sie das Netz mit Zange, wie es von der AOB trennt während frontalen Kortex Rückzug und entfernen Sie sie von kaudal und medial ziehen, wobei darauf geachtet das AOB nicht zu berühren. Sobald der frontale Kortex hat sich von den Riechkolben getrennt worden ist, entfernen Sie es durch Schneiden mit einer Pinzette ventralen und hinter der AOB. HINWEIS: Nehmen Sie abtreme Pflege mit Nettoabbau, denn wenn es zu grob ist getan die glomeruläre Schicht beschädigt werden kann.
4. In der exponierten kontralateralen Nasenhöhle, entfernen Sie alle verbleibenden kontralateralen Septum-Gewebe (fadenscheinigen gelblich Blatt mit Blutgefäßen) mit den feinen Pinzette. Fassen Sie das Gewebe an der Schwanz / Rückenbereich (in der Nähe des Septum-Knochen) und ziehen / heben das Gewebe auf der vorderen Seite dann. HINWEIS: Die kontralateralen Septum-Gewebe kann während der Hemisektion (Schritt 3.20) versehentlich entfernt werden. In einem solchen Fall beobachten, eine weiße, avaskuläre Septumknorpels und leicht transparent, gefäß Septum-Knochen. Wenn dies der Fall ist, kann der Schritt 4.4 übersprungen werden.
5. Entfernen Sie vorsichtig die kontralateralen VNO, indem Sie einen einzigen Punkt der feinen Pinzette zwischen der Scheidewandknorpel und der VNO "Flügel" (ein dünnes Stück Knochengewebe, die entlang der dorsalen Rand der beiden VNOs läuft.
   1. Nach der Loslösung von der Flügelknorpel, bewegen Sie die Spitze der Zange ventralin das kontralaterale VNO in der Nähe der Mittellinie. Wiederholen diesen Schritt an mehreren Stellen entlang des rostralen / kaudale Achse des kontralateralen VNO um sie zu lösen, so dass es durch Ergreifen mit einer Zange und Abheben entfernt werden.
6. Bereiten Sie die Septumknorpels durch einen Schnitt in der Bauch / kaudalen Rand (wo es verengt sich zu einem weißen avaskulären Bandlauf entlang der ventralen Rand des Septum-Knochen) mit einer feinen Pinzette entfernen.
7. Entfernen Sie die Septumknorpels durch Kneifen zusammen die feinen Pinzette, um eine halb stumpfen Punkt zu machen. Identifizieren Sie den Schnitt im Schritt 4.6 aus, legen Sie die Zange eingeklemmt hinter (seitlich) zu diesem Schnitt, und dann langsam heben Sie die Knorpel aus dem Septum-Gewebe und rostral fortfahren. HINWEIS: die zugrunde liegende Scheidewandgewebe stören Sie nicht. Da der Knorpel angehoben wird, beobachten die zugrunde liegende Blatt Septum-Gewebe Stretch durch lose Verwachsungen an den Knorpel. Eine periodische, sanft und stabilen Bewegung der feinen Pinzette eingeklemmt auf dieser Website von losen eindhesion stark erleichtern erfolgreiche Trennung der beiden Strukturen.
8. Verwenden Sie ein Paar Nr. 3 Pinzette mit gebogener Spitze, um das Septum-Knochen zu entfernen. Ansatz der septalen Knochen in einem Winkel nahezu parallel zu der Ebene des septalen Knochen. Legen Sie die gebogenen Zinken zwischen dem Septum-Gewebe-und Knochen Septum. Fassen Sie die Knochen mit der Zange und sanft bewegen die Knochen hin und her, bis es Risse in der Nähe der Lamina cribrosa. HINWEIS: In einigen Fällen wird das Septum-Knochen in der Nähe der wider Siebbeinplatte brechen. In diesem Fall verwenden Sie feinen Pinzette vorsichtig erzielt das Septum Knochen entlang der dorsalen / ventralen Achse nur anterior der Lamina cribrosa, dann wiederholen Sie Schritt 4.8.
9. Entfernen Sie die weiße Knorpel nur rostral des VNO durch Kneifen mit einer feinen Pinzette am Eingang und rostral ziehen mit einem anderen feinen Pinzette.
10. Befestigen Sie die Polyimid-Kanüle zu einer schnellen Perfusionsvorrichtung und starten Sie den Fluss der Ringer-Lösung (0,1 bis 0,3 ml / min) durch die Polyimid-Kanüle.HINWEIS: Messen Sie mit einer Durchflussrate in-line, kleines Volumen-Durchflussmesser. Einsatz von Computer-gesteuerten pneumatischen Schaltgerät Stimulus reduziert Strömungsgeschwindigkeit ändert während der Stimulation. Vergleichen neuronale Reaktionen auf Reize mit Reaktionen auf eine Schein Reiz (Ringer-Lösung zu kontrollieren) testen, um sicherzustellen Antworten sind spezifische Reiz.
11. Richten Sie die Kanüle parallel zur VNO Eingang. Wenn die Kanüle zufriedenstellend parallel zur VNO Eingang, zusehen, wie der Ausgangsdruck bewirkt, dass das VNO auf "aufblasen", was zu einer Evakuierung des Blutgefäßes. Die Kanüle sofort in die VNO einzufügen, halten die Winkel der Kanüle konstant, so daß sie parallel zu der VNO Öffnung verbleibt. HINWEIS: Es kann hilfreich sein, um die Kanüle mit einer feinen Pinzette gegen den Kunststoff Planke halten und ein anderes Paar feine Pinzette Winkel das Ende der Kanüle leicht nach oben. Wenn man versehentlich legt die Kanüle hinter dem VNO, kann der Abfluss auch die VNO Blutgefäßes führenzu evakuieren, um den Eindruck einer ordnungsgemäßen Kanülierung wurde durchgeführt, führt. Richtigen Stelle kann durch Einbau eines Farbstoffes in der Ringerlösung bestätigt werden. Wenn die Kanüle richtig platziert ist, sollte der Farbstoff nur über den Ausgang VNO Eingang. Zusätzlich kann eine geeignete Anordnung sichergestellt wird, dass die Kanüle durch die halbtransparente medialen VNO leicht sichtbar zu bestätigen.
12. Bewegen Sie den Kunststoff-Brett langsam, bis der AOB ist in der direkten Fluss von der Standard-aCSF, man aufpassen, nicht die Kanüle aus dem VNO entfernen. Die Präparation ist abgeschlossen und Beurteilung der physiologischen Funktion kann sofort begonnen werden. Schritt 5 wird kurz beschrieben, ein Konzept für eine solche Bewertung.

5. Auswertung

1. Dringen die Oberfläche des AOB mit 2-4 M &OHgr; Borsilikatglas-Mikroelektrode an eine extrazelluläre Verstärker und Oszilloskop angeschlossen.
2. Langsam voran die Mikroelektrode in eine Tiefe von 100-200 um aus derOberfläche mit einer Geschwindigkeit von 50 um / min. HINWEIS: Bei dieser Gewebetiefe, wird man gelegentlich spontane Aktionspotential Wellenformen durch scharfe, kurze (~ 2.1 ms) Ausschläge in der Mikroelektrodenspannung beispielhaft zu begegnen.
3. Bei der Begegnung ein Aktionspotential Wellenform, Stopp Förderung der Mikroelektrode.
4. Beobachten und / oder aufzeichnen das Aktionspotential Rate, während die Konjunktur Delivery-Lösung von Steuer Ringer-zu einem bekannten Aktivator der VSN-Aktivität (zB Ringer-Lösung, die 50 mM KCl). Wenn die Zerlegung erfolgreich war, kann ein Stimulus-abhängige Veränderung in Aktion Potenzialrate oder lokale Feldpotential beobachtet werden. HINWEIS: Nicht alle Neuronen AOB wird jedem Reiz mit einer Erhöhung der Brenngeschwindigkeit (einschließlich Ringer-Lösung, enthaltend 50 mM KCl) reagieren. Ein Reiz abhängige Abnahme der Feuerrate zeigt auch funktionelle Konnektivität und eine erfolgreiche Dissektion. In dem Fall, dass zwei oder mehr Neuronen auf, daßreagieren nicht auf VNO Stimulation, oder wenn keine Aktionspotenziale nach mehreren Elektrodenbrüche beobachtet werden, deutet dies auf einen erfolglosen Dissektion. Wenn dies der Fall ist, kann eine neue Sektion in Schritt 3 eingeleitet werden.

Representative Results

Der Weg zum Erfolg mit diesem Präparat nimmt umfangreiche Praxis, und hat mehrere Schritte bei der es nicht kann. Man sollte erwarten, dass viele Versuche, vor den Erfolg benötigen. Der Brauch Dissektion Kammer ist für den erfolgreichen Abschluss dieses Protokolls erforderlich und sollte vor Beginn der späteren Stadien der Präparation erhalten werden. Die Kammerkonstruktion in Fig. 1 dargestellt ist, für diesen Zweck ausreichend, und kann relativ kostengünstig Kunststoff mit minimaler Bearbeitungs Anforderungen gestellt werden. Wenn man die Fähigkeit, eine solche Kammer zu produzieren fehlt, können lokale oder Online-Bearbeitungsunternehmen konsultiert werden und kann die Kammer für eine Gebühr zu konstruieren.

Eine große Quelle der Variabilität über Vorbereitungen ist die Dichte und Brüchigkeit der Knochen von Schädel und Schnauze der Versuchstiere. Während der hemisection Schritte (Schritte von 3,14 bis 3,20), ist das Ziel, beide vomeronasal Organe zusammen mit der ipsilateralen Septum-Gewebe zu isolieren undipsilateral akzessorischen olfaktorischen Bulbus. Es ist jedoch nicht ungewöhnlich, dass die Scheidewandgewebe zu bleiben, um der kontralateralen Hemisphäre befestigt ist, insbesondere in der Nähe Befestigungspunkte an der dorsalen Knochen der Schnauze. Fig. 2 zeigt ein Beispiel für eine wirksame und unwirksame Halbquerschnitt.

Andere häufige Dissektion Fehler entstehen während der Fein Dissektion, bei der die Axone der Nerven vomeronasalen in der Septum-Gewebe in der Nähe der Vomeronasalorgan (3A und 3B) oder in der Nähe der AOB (3C und 3D) beschädigt werden. Diese und ähnliche Veranstaltungen werden in unvollständige Konnektivität zwischen VSN und der AOB zur Folge, wodurch die Vorbereitungen unbrauchbar.

Das letzte Hindernis für den Erfolg der Vorbereitung ist der VNO Kanülierung Schritt (Schritt 4.11). Die richtige Platzierung der Kanüle wird in VNO Druckbeaufschlagung der VNO Lumen führen, was sofortige Ausweisung von Restblut aus der vomeronasal Pumpe. Die Kanüle sollte deutlich sichtbar unter der relativ transparent vomeronasal Epithel und das Aussehen der Kanüle ist entlang seiner Länge innerhalb des VNO einheitlich sein. Nach erfolgreichem Abschluss des Verfahrens kann eine funktionelle Konnektivität zu überprüfen mit Hilfe eines physiologischen Test wie Einheit elektrophysiologischen Ableitungen der neuronalen Aktivität in Reaktion auf VNO Stimulation mit einer bekannten Quelle von VSN Geruchsstoffe (Abbildung 4).

Abbildung 1. A) Technische Zeichnungen der benutzerdefinierten Dissektion Kammer in Schritten von 3,22 bis 5,4 eingesetzt. HINWEIS: Kleine Löcher gebohrt werden, um Lösung und Vergasung und Auslässe wie gewünscht B) Beispiel Fotografie Dissektion Kammer in diesem Protokoll aufzunehmen.. m/files/ftp_upload/51813/51813fig1highres.jpg "target =" _blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. A, B) Repräsentative Bilder von erfolgreichen (A) und erfolglose (B) Zubereitungen nach der Hemisektion Stufe (Schritt 3.20). Die VNO, Septum-Gewebe und Riechkolben (OBs) müssen alle von der ipsilateralen Hemisphäre (in diesem Fall das Recht (unten) Halbkugel gehalten werden. Wenn Nasenmuscheln auf der ipsilateralen Hemisphäre sichtbar sind, hat sich die Dissektion fehlgeschlagen. Striche sind 1 mm auseinander. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

d/51813/51813fig3highres.jpg "width =" 600 "/>
3. A, B) Repräsentative Bilder der intakten und geschädigten Gewebe zwischen dem Septum VNO und AOB. In B, machten die Präparierzange unbeabsichtigten Kontakt mit dem Gewebe, Beschädigung der VN Axon Wege. C, D) Intakte und beschädigte AOB. In D, Entfernung der Dura rund um die ipsilateralen OB führte Trennen der Nerven vomeronasal in der Nähe der AOB, was zu einer sichtbaren Blob von Gewebe in der Nähe der medialen AOB. Maßstabsbalken sind 1 mm lang.

Abbildung 4. A) Beispiel Raster Grundstück von Aktionspotentialen von einem AOB Neuron (extrazellulären Einheit Aufnahme) in eine erfolgreiche Vorbereitung aufgezeichnet. Spuren in schwarz zeigen keine Veränderung in Feuerrate, wenn die Steuer Ringer-Lösung wurde der VNO für 5 sec (b grau geliefertox). Spuren in rot zeigen die Reaktion der gleichen Neuron zu VNO Stimulation mit weiblichen BALB / c Maus Urin verdünnt 100-fach in Ringer-Kochsalzlösung. B) Peri-Stimulus-Zeit-Histogramm der gleichen Reaktionen in A. Fehlerbalken zeigen die Standardfehler des Mittelwerts.

Discussion

Die in diesem Protokoll beschrieben VNO-AOB ex vivo-Herstellung ist eine nützliche Alternative zu den in vivo ^5-7 und akute Live Scheibe ¹⁷ Experimente AOB Funktion anästhesiert. Im Gegensatz zu akuten AOB Scheibe Experimente, die auch Schaltungselemente für elektrophysiologische und optische Aufnahmen belichten, behält diese Vorbereitung alle sensorischen Afferenzen und intra-AOB-Verbindungen. Sie können aber auch von betäubten gesagt werden, in-vivo-Ansätzen, die Anwesenheit von Anästhetika notwendigerweise verändert neuronalen Funktion, nämlich exzitatorischen / inhibitorische Gleichgewicht, die von entscheidender Bedeutung für die Informationsverarbeitung in dieser und anderen Geruchsschaltungen ¹⁸ ist. Da die Herstellung vermeidet die Verwendung von Anästhetika, und weil die AOB Oberfläche vollständig zu dem Superfusat ausgesetzt sind, ist es offen für pharmakologische Untersuchungen in lokalen neuronalen Verarbeitung.

Es gibt natürlich einige Einschränkungen dieser Zubereitung. Es gibt evidence allmähliche Degeneration der tiefsten AOB Schichten, nämlich die tiefen Abschnitte der inneren Zellschicht, die viele inhibitorische Körnerzellen ¹⁶ untergebracht ist. Zusätzlich sind Kreiseleingänge während der Präparation durchtrennt, durch aktive Teilnahme an AOB Funktion eliminieren. Kanülierung des VNO umgeht die normale Aktion des vomeronasal Pumpe und spült den im VNO Lumen vorliegenden endogenen Flüssigkeiten.

Kritische Schritte für den Erfolg mit dieser Methode sind die zarten Hemisektion (Schritt 3.20) und VNO Kanülierung (Schritt 4.11). Man kann erwarten, umfangreiche Praxis benötigen, um funktionell verbundenen Ex-vivo-Präparate zuverlässig produzieren. Die hier eingesetzte Sekundär Dissektion Kammer kann verwendet werden, um funktionelle Konnektivität bewerten mit Single-Elektroden-Aufnahmen während der Stimulation des VNO mit Quellen Maus Pheromone (wie verdünnter Urin) werden. ^13,15 Änderungen der Sekundärkammer Dissektion kann bE hergestellt, dass die Zubereitung auf Winkel für andere Zwecke, wie beispielsweise Multiphotonen-Imaging geeignet gedreht zu ermöglichen.

Die vielen technischen Hürden, die das Studium der lebenden AOB seit langem stellte eine Barriere für unser Verständnis von sozialer Geruch und Pheromon sensorischen Verarbeitung. Durch sezieren entfernt die frühesten neuronalen Komponenten dieses sensorische Bahn in diesem Dissektion Protokoll ist in der Lage, ein experimenteller Zugang zu diesen schwer zu Studienkreise zu gewinnen. Wir haben diese Vorbereitung für detaillierte Untersuchungen zu vomeronasal sensorischen Verarbeitung ¹⁹ und sensorische Mapping (Hammen et al., Unveröffentlicht) eingesetzt. Diese Technik wird für zukünftige Studien in sensorischen Verarbeitung in der AOB, insbesondere die optischen Zugang zum Gewebe (z. B. Multiphotonen-Imaging und Optogenetik) erfordern, nützlich sein. Die Vorteile dieses Ansatzes ergänzen die in-vivo-Ansätze und Verbesserung unserer Toolkit für die Untersuchung der neuronalen Mechanismen der vomeronasal-vermittelte soSozial-und Paarungsverhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Straight Scissors	Fine Science Tools	14002-14
Fine Scissors-Straight	Fine Science Tools	14060-10
Fine Scissors-Curved	Fine Science Tools	14061-10
Adson Forceps	Fine Science Tools	11006-12
#3 Scalpel Handle	Fine Science Tools	10003-12
#11 Scalpel Blades	Fisher Scientific	3120030
Straight Carbon Steel Razor Blades	Fisher Scientific	12-640
35 mm Petri Dish	Fisher Scientific	08-772-21
Dissection Chamber	Custom	N/A	See Figure 1
Delrin plastic plank 0.6 cm x 1.5 cm x 0.1 cm	Custom	N/A
Dow Corning Silicon Vacuum grease	Fisher Scientific	146355D
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
#5 Forceps, Biologie Tip	Fine Science Tools	11295-10
#5 Forceps, Student	Fine Science Tools	91150-20
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08
1/16" Male Luer	Cole-Parmer	EW-45505-00
1/16" Tubing	Fisher Scientific	14-171-129
Two ton epoxy	Grainger	5E157
ValveBank Pressurized Perfusion Kit	AutoMate Scientific	09-16
ValveLink digital/manual controller	AutoMate Scientific	01-18
NaCl	Sigma-Aldrich	various
KCl	Sigma-Aldrich	various
CaCl2 dihydrate	Sigma-Aldrich	various
MgCl2 hexahydrate	Sigma-Aldrich	various
NaHCO3	Sigma-Aldrich	various
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	various
myo-inositol	Sigma-Aldrich	various
Na-pyruvate	Sigma-Aldrich	various
Na-ascorbate	Sigma-Aldrich	various
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	various
Glucose	Sigma-Aldrich	various