We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Epitelovariecancer er den mest dødelige gynækologisk malignitet i USA. Selvom patienterne initialt reagere på den nuværende standard for pleje, der består af kirurgisk debulking og kombinationskemoterapi bestående af platin og taxanforbindelser, næsten 90% af patienterne igen inden for et par år. Hos disse patienter begrænser udviklingen af kemoresistent sygdom Effekten af for tiden tilgængelige kemoterapeutiske stoffer og derfor bidrager til den høje dødelighed. At opdage nye behandlingsmuligheder, der kan målrette tilbagevendende sygdom, er egnede dyremodeller, der nøje efterligner den kliniske profil af patienter med recidiverende ovariecancer påkrævet. Udfordringen i overvågningen intra-peritoneal (ip) sygdom begrænser brugen af ip modeller og således de fleste xenotransplantater er etableret subkutant. Vi har udviklet en følsom optisk billeddannelse platform, der muliggør påvisning og anatomiske placering af ip tumormasse. Platformen omfatter use af optiske reportere, der strækker sig fra det synlige lys til nær infrarødt, som i kombination med 2-dimensional X-ray co-registrering kan give anatomiske placering af molekylære signaler. Detection forbedres væsentligt ved anvendelse af et rotationssystem, der driver dyret til flere vinkelstillinger for 360 graders billeddannelse, som muliggør identifikation af tumorer, der ikke er synlige i en enkelt orientering. Denne platform giver en unik model til ikke-invasivt monitor tumorvækst og evaluere effekten af nye terapier til forebyggelse eller behandling af æggestokkræft.
Dyremodeller er uundværlige værktøjer i life science forskning. I kræft især data indhentet fra dyreforsøg give de nødvendige oplysninger, der kræves for at indlede afprøvning af nye diagnostiske eller terapeutiske anvendelser i mennesker 1-3. Dyremodeller for solide kræftformer er klassisk etableret subkutant, da det giver en nem måde at måle tumorbyrde og evaluere behandlingseffekt uden at ofre dyr. Faktisk intraperitoneal (IP) modeller kræver, at dyr aflives for at detektere og måle eventuelle ændringer i tumorvækst. Men for ip kræftformer sådan ovariecancer, orthotrope modeller har den fordel at studere sygdommen i dens rette omgivelser 4-6. For at en sådan model være af i evalueringen af anti-tumor aktivitet, der skal udvikles, der tillader kvantificering af ip tumorbyrde i levende mus ikke-invasive billeddannende metoder.
En stor udfordring ianvendelse af ip dyremodeller er vanskeligheden ved nøjagtigt at kvantificere tumorbyrde ved fysisk undersøgelse. Nøjagtig kvantificering af ip tumorer kræver normalt musene at blive ofret for dissektion. Denne fremgangsmåde kræver anvendelse af store antal dyr, som vil blive aflivet på forskellige tidspunkter. Ud over omkostninger, det indfører høj variabilitet data på grund af iboende variationer inden for hvert dyr. Non-invasiv in vivo optisk billedbehandling giver en mere passende fremgangsmåde til at overvåge ip tumor byrde i levende mus.
Adskillige non-invasive imaging metoder der i øjeblikket anvendes i præ-klinisk forskning for overvågning af tumorvækst og terapeutiske respons. Heriblandt computertomografi (CT), ultralyd (US), magnetisk resonans (MRI), positron emission tomografi (PET), og optisk billeddannelse, såsom fluorescens og bioluminescens 7-12. CT er en transmission imaging proces, der kombinerer X-ray og comare teknologi. Den producerer et tværsnit billede af detekterede stråler af høj energi fotoner, der passerer gennem kroppen med forskellig hastighed. USA er en form for refleksion billede, som sender højfrekvente lyde til kroppen skaber lydbølger, der afspejles med forskellig hastighed afhængig af væv tæthed og genkendes af computeren til at frembringe et visuelt billede. MRI og PET er emission billeddannende modaliteter, der anvender magnetisk energi og kernepartikler, henholdsvis at frembringe billedet. MRI skaber et stærkt magnetfelt, der inducerer celler til at producere deres egne radiofrekvenser, som bruges til at skabe et billede, mens PET kræver en følsom kamera til at opdage radioaktivitet administrerede mærket 2-fluorodeoxy-D-glucose 7,9,11. Endelig er optisk billeddannelse baseret på påvisning af emissionen af lys bioluminescerende eller fluorescerende reportere eller prober 9,12.
I denne rapport beskriver vi brugen af fluorescens, som tilbydernogle fordele i forhold til andre typer af billeddannende modaliteter. Med fluorescensimagografi kan celler gensplejses til at udtrykke fluorescerende proteiner konstant uden at kræve tilsætning af et substrat eller ligerings–baserede prober, som er nødvendige for bioluminescens og magnetisk resonans, henholdsvis. Fluorescens reportere også typisk udtrykke en lysere signal således tillader anvendelse af et mindre følsomt påvisningsmetode 8,12. Desuden med fluorescensimagografi, er det muligt at detektere tumorer mindre end 1 cm, hvilket ikke kan opnås med CT 7-9. Endelig, i modsætning til bioluminescens, fluorescenssignal kræver ikke et aerobt miljø og dermed signalet er ikke begrænset i hypoxiske miljøer, som normalt forekommer i kernerne af store tumorer 13.
Men som enhver anden teknologi, fluorescerende-baserede billeddannende metoder har sine ulemper. Hvoraf den ene er den manglende evne til machine-genereret lavenergi fotoner at trænge igennem til en tilstrækkelig dybde. Således, at minimere mængden af diffust væv fotoner dyrene skal afbildes i forskellige vinkler. Vi beskriver en protokol for at etablere en ip æggestokkræft i nøgne mus og en tilgang til IP Tumorovervågningssystem der giver hele dyret billeddannelse gennem rotation. Rotator vinkler musen til specifikke og reproducerbare positioner faldende vævet interferens, der ofte forekommer mellem lyskilden og detektoren. Dette optimerer visualiseringen af mindre tumorer, som ellers kan blive savnet.
Vi beskriver en protokol for at etablere en ip human ovariecancer dyremodel, der efterligner den kliniske profil observeret hos patienter. Endvidere beskriver vi anvendelse af et dyr rotationsindretning, der løser følsomhed begrænsning af 2D-billedbehandling. Tilsammen kan disse teknikker tjene som platforme for at opdage nye forbindelser, som kan målrette kemoterapi tilbagevendende ovariecancer. Desuden kan en sådan model kan bruges til at forstå biologi cancer tilbagefald og progression.
På grund af sin retroperitoneal placering, er næsten umulige at påvise ved fysisk at undersøge mus tidlige fase ip kræft i æggestokkene xenotransplantater. I de fleste tilfælde, når sygdommen kan palperes, tumorbyrden er allerede stor og begrænser derfor evaluering af behandlingseffekt. Anvendelse af fluorescensmærkede celler tillader os at vurdere fastsættelsen af ip tumor i realtid og dermed identificere det optimale tidspunkt til at begynde treatment. På en lignende måde, fluorescerende-mærkede xenotransplantaterne tillade overvågning af behandlingsrespons. Det skal bemærkes ud imidlertid, at ip tumorer dybere end 1 cm er typisk ikke påviselig uanset reporter system.
Anvendelse af menneskelige ovariecancerceller stamceller 14,15,17,22 genererer xenotransplantater, der efterligner den kliniske profil observeret hos patienter. Som en primær sygdom, modellen er lydhør over for paclitaxel, men behandlingsophør sidste ende fører til kemoresistent tilbagevendende sygdom. Introduktion af cellerne gennem livmoderhornene på tæthed nærmere specificeret i protokol afsnittet normalt resulterer i æggestokkræft inden for 10 dage med et par peritoneale implantater, og derfor efterligner den tidlige fase af sygdommen. Anvendelsen af fluorescens-mærkede celler giver os mulighed for at vurdere fastsættelsen af ip tumor i realtid og dermed identificere det optimale tidspunkt at begynde behandling. På lignende måde, fluorescensmærkede xenotransplantater muligt at overvåge of respons på behandlingen. Hvis der anvendes, ovarie- eller på anden måde andre typer af cancer cellelinjer, er det muligt, at denne profil ikke kan observeres. Når SKOV3 anvendes for eksempel er det blevet rapporteret, at de oprindelige ip tumorer er allerede resistente 23. Men hvis mærket med en reporter, såsom fluorescens, ip, sygdom kan følges i realtid.
Hvis der anvendes andre fluorescerende reporter, er det vigtigt at udføre indledende billeddannelse med en kontrol (ingen tumor) dyr. Dette vil give en optimal billeddannelse protokol for at opnå den bedste baggrund at signalere ratio. Det er vores erfaring, nøgne mus har typisk høj baggrund, når filmede med indstillingerne GFP erhvervelse.
Det er vigtigt, at celler injiceres intra-uterin er i enkelt suspension at undgå etableringen af tumorer i livmoderen. Det er også vigtigt at undgå at ridse den uterine epitel lag, som også letter indpodning af kræftcellens i livmoderen, hvorved der frembringes en intrauterin tumor i stedet for en IP sygdom. Desuden under dataanalyse, er det vigtigt at indstille gamma værdien 1. Dette sikrer, at intensiteten af billederne er lineær og muliggør en sammenligning mellem billeder.
Under erhvervelsen af MARS billeder, er det vigtigt at sikre, at tubed ende af den sammenklappelige Næsekeglen er i næsekeglens fordybning. Næsekeglen fungerer som et kontaktpunkt for musen, og er derfor påkrævet for at opnå præcist kalibrerede vinkler. Ved længere imaging protokoller (dvs. længere end 1 time), injiceres 100 pi sterilt saltvand subkutant for at forhindre dehydrering. Dyrekroppen temperatur bør holdes ved hjælp af varm luft strømme gennem systemet på ca. 37 ° C. En begrænsning af MARS system er, at kun et dyr kan afbildes på et tidspunkt med en total kørselstid på ca. 1 time pr dyr.
Afslutningsvis beskriver vi establishment af en dyremodel, der nøje efterligner ovariecancer, både primær og tilbagevendende sygdom. Denne model kan anvendes til at vurdere effektiviteten af nye diagnostiske eller terapeutiske modaliteter.
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af NIH tilskud RO1CA118678 og RO1CA127913 ved Sands Family Foundation, og Discovery at helbrede Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |