Abstract
סרטן השחלות אפיתל הוא הגידול ממאיר גינקולוגיות הקטלנית ביותר בארצות הברית. למרות שמטופלים בתחילה להגיב לטיפול הסטנדרטי בהיקף של debulking הניתוחי וכימותרפיה משולבת הכוללת תרכובות פלטינה וtaxane הנוכחיים, כמעט 90% מהחולים חוזרים על עצמם בתוך כמה שנים. בחולים אלו על התפתחות מחלת chemoresistant מגבילה את יעילותם של סוכני כימותרפיה זמינים כרגע, ולכן תורמת לתמותה הגבוהה. כדי לגלות אפשרויות טיפול חדשות שיכול למקד את המחלה חוזרת, מודלים של בעלי חיים מתאימים המחקים את הפרופיל הקליני של חולים עם סרטן השחלות חוזר ונשנה באופן הדוק נדרשים. האתגר בניטור מחלה תוך הצפק (IP) מגביל את השימוש במודלי IP ומתחת לעור ובכך רוב xenografts מבוססים. פיתחנו פלטפורמת הדמיה אופטית רגישה המאפשרת זיהוי ומיקום האנטומי של מסת גידול IP. הפלטפורמה כוללת את use של כתבים אופטיים הנמשכים מהמגוון הגלוי אור אינפרא-אדום הקרוב, אשר בשילוב עם שיתוף רישום רנטגן 2 ממדים יכולים לספק מיקום האנטומי של אותות מולקולריים. איתור משתפר באופן משמעותי על ידי השימוש במערכת רוטציה שמניעה את בעלי החיים לתפקידים זוויתי מרובים עבור 360 הדמיה תואר, המאפשר זיהוי של גידולים שאינם גלויים בכיוון אחד. פלטפורמה זו מספקת מודל ייחודי להתפתחות גידול צג הלא פולשני ולהעריך את יעילותם של טיפולים חדשים למניעה או הטיפול בסרטן השחלות חוזר ונשנה.
Introduction
מודלים של בעלי החיים הם כלים הכרחיים במחקר בתחום מדעי חיים. בסרטן במיוחד, נתונים שנרכשו ממחקרים בבעלי החיים מספקים את המידע הדרוש כדי ליזום הבדיקה של יישומי אבחון או טיפול חדשניים בבני האדם 1-3. מודלים של בעלי חיים לסוגי סרטן מוצקים בסגנון קלסי הוקמו תת עורי כמו שהיא מספקת אמצעי קל למדוד נטל גידול ולהעריך את יעילות טיפול מבלי להקריב בעלי החיים. ואכן, מודלים תוך הצפק (IP) דורשים כי בעלי חיים שהקריבו כדי לזהות ולמדוד שינויים בצמיחת גידול. עם זאת, לסרטן השחלות כגון סרטן ip, מודלים orthotropic מציעים את היתרון של לימוד המחלה בסביבתו הראויה לו 4-6. למודל כזה להיות שימוש בהערכת הפעילות אנטי-סרטנית, שיטות הדמיה בלתי פולשנית צריכים להיות מפותחות המאפשרות כימות של נטל גידול ip בעכברים חיים.
אתגר גדול בשימוש במודלים של בעלי החיים IP הוא הקושי בצורה מדויקת לכימותי נטל גידול על ידי בדיקה גופנית. כימות מדויק של גידולי IP בדרך כלל דורש העכברים להיות מוקרבים לנתיחה. גישה זו דורשת שימוש במספר גבוה של בעלי חיים, שיוקרב בנקודות זמן שונות. בנוסף לעלויות, הוא מציג השתנות נתונים גבוהה עקב שינויים טבועים בתוך כל חיה. לא פולשני בהדמיה אופטית vivo מספק גישה הולמת יותר כדי לפקח על נטל גידול ip בעכברים חיים.
מספר שיטות הדמיה בלתי פולשנית משמשות כיום במחקר פרה-קליני לניטור צמיחת גידול ותגובות טיפוליות. אלה כוללים טומוגרפיה ממוחשבת (CT), אולטרה-סאונד (US), תהודה מגנטית (MRI), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET), והדמיה אופטית כגון הקרינה ופליטת אור 7-12. CT הוא תהליך הדמיה שידור שילוב רנטגן ואוטוטכנולוגיה אה. היא מייצרת תמונת חתך של קורות מזוהות של פוטונים באנרגיה גבוהה, אשר עובר דרך הגוף במהירות שונה. ארה"ב היא סוג של תמונת השתקפות, ששולחת צלילים בתדר גבוה לגלי קול גוף יצירת שבאות לידי ביטוי במהירות שונה בהתאם לצפיפות רקמה ומוכרת על ידי המחשב כדי לייצר דימוי חזותי. MRI ו PET הם שיטות הדמיה פליטה המשתמשות באנרגיה מגנטית וחלקיקים גרעיניים, בהתאמה כדי לייצר התמונה. MRI יוצר שדה מגנטי חזק שגורם לתאים לייצר תדרים שלהם ברדיו, המשמשים ליצירת תמונה תוך PET דורש מצלמה רגישה לגילוי הרדיואקטיביות של מנוהלים 7,9,11 2-fluorodeoxy-D-גלוקוז שכותרתו. לבסוף, הדמיה אופטית מבוססת על הגילוי של אור הפליטה של כתבים או בדיקות 9,12 bioluminescent או פלורסנט.
בדו"ח זה, אנו מתארים את השימוש של הקרינה, המציעכמה יתרונות על פני הסוגים של שיטות הדמיה האחרות. עם דימות פלואורסצנטי, תאים יכולים להיות מהונדסים גנטי כדי לבטא חלבוני ניאון כל הזמן ללא צורך בתוספת של מצע או בדיקות המבוססת על קשירה, שהם הכרחיים לפליטת אור והדמיה בתהודה מגנטית, בהתאמה. כתבי הקרינה גם בדרך כלל להביע את אות בהירה ובכך מאפשרת שימוש ב8,12 שיטת זיהוי רגישה פחות. בנוסף, עם דימות פלואורסצנטי, ניתן לזהות גידולים קטנים מ 1 סנטימטר, שאינו בר השגה עם CT 7-9. לבסוף, בניגוד לפליטת אור, אות הקרינה אינה דורשת סביבה אירובית ומכאן האות אינה מוגבלת בסביבות חוסר חמצן, אשר בדרך כלל מתרחשות בליבותיהם של גידולים גדולים 13.
עם זאת, כמו כל טכנולוגיה אחרת, יש להם שיטות הדמיה המבוססות על ניאון החסרונות שלה. אחד מהם הוא חוסר היכולת של machiפוטונים באנרגיה נמוכים ne שנוצר כדי לחדור לעומק מספיק. לכן, כדי למזער את כמות הפוטונים רקמה מפוזרות צריכים להיות צילמו בעלי החיים בזוויות שונות. אנו מתארים פרוטוקול להקים סרטן השחלות ip בעכברים בעירום וגישה לניטור גידול IP המספק הדמיה של בעלי חיים שלמים דרך רוטציה. מסובבי זוויות העכבר לתפקידים ספציפיים ודיר להקטין את ההפרעות ברקמות שמתרחשות לעתים קרובות בין מקור האור והגלאים. זה מייעל את ההדמיה של גידולים קטנים יותר שעשויים להיות אחר החמיצו.
Protocol
ועדת בעלי החיים מוסדי אוניברסיטת ייל הטיפול והשימוש לאשר את כל תיארה את עבודת in vivo. איסוף דגימה בוצע בהסכמת חולה ואושר על ידי ועדת חקירות אדם של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת ייל.
1. הכנה של אדם תאי סרטן השחלות
- לפני הכנת התאים לוודא שכל החומרים הדרושים להזרקה תוך רחמית המפורטים להלן הנן מוכנים ונגישים בקלות. להזריק את ההשעיה התא ברגע שהוא מוכן.
- לגדל תאי סרטן שכותרתו ניאון בתרבות. אנו משתמשים בF2 דור של CD44 האדם + / MyD88 + תאי סרטן השחלות אפיתל, שהפגנו בעבר לנמל תכונות stemness כגון tumorigenicity, chemoresistance וקיבולת גבוהה לתיקון גידול 14-19. תאים אלה נוצרו כדי להביע את הקרינה mCherry יציבות (F2-mCherry, איור. 1) באמצעות מיוצר lentivirus מpolyethylenimine(PEI) פרוטוקול 20,21.
- ביום של זריקה, לקצור את התאים על ידי trypsinization ולשטוף פעם עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS).
- לקבוע ספירת תאים ולהשעות את התאים ב 3 x 10 6 תאים / 50 μl בתקשורת צמיחה המתאימה. לתאי סרטן השחלות אנו משתמשים RPMI 160 עם 10% FBS. שמור את התאים בחממה עד מוכן להזריק אבל לא לשמור יותר מ -15 דקות. זה מספיק להזרקת עכבר אחד.
2. הזרקה תוך רחמית של אדם תאי סרטן השחלות בעכברים בעירום athymic
שים לב שההליך הבא דורש סיוע מאדם שני. בנוסף, מאחר שזו ניתוח הישרדות, משתמש במכשירי ניתוח סטרילי. הליך ניתוח הישרדות זה צריך לקחת כ 10-15 דקות.
- להרדים את העכבר באמצעות 2% isoflurane. הוא השתמש בעכברים בעירום athymic 7- 8 שבועות בן בדרך כלל.
- ודא כי בעל החיים הוא completanesthesized Ely על ידי צובט את כרית כף הרגל בעזרת אצבעות או מלקחיים. בעלי החיים צריכים להיות לחלוטין שאינם מגיבים לכאב לפני תחילת הניתוח.
- הנח את צד הגחון העכבר הרדים על פד גזה סטרילי עם הראש מהחוקר.
- החל משחה על עיניים עם המוליך כותנה-טיפ למניעת יובש ואילו בהרדמה.
- מייד להכניס את הראש במערכת חרטום מחוברת לאידוי isoflurane (איור. 2 א). זה מספק את ההרדמה בכל ההליך כירורגי.
- לחטא את השמאל (או ימין) בצד של רפידות בטן באמצעות אלכוהול (איור. 2 ב) ואחריו יוד ואז למקם לעטוף כירורגית סטרילית על האתר כירורגית.
- מספריים באמצעות סטרילי כירורגים ומלקחיים לעשות חתך בעור 1-2 סנטימטר ברבע השמאלי התחתון של העכבר (איור. 2 ג).
- הרם את השרירים ועושה חתך כדי להגיע הצפק. <li> לנתח את השריר האלכסוני כדי לחשוף את חלל הבטן.
- אתר ולזהות את הקרן השמאלית של הרחם (איור. 2 ד).
- באמצעות סטרילית hemostat, מהדק את שני הצדדים קדמי וגם האחוריים של הקרן (איור. 2E). הנח את המהדק הקדמי ממש מתחת לחצוצרה והמהדק האחורי ממש מעל צוואר הרחם.
- יש לי האדם השני להזריק ההשעיה התא. מניחים את המחט המכילה תאים, על 45 מעלות זווית בניצב לקרן (איור. 2F). מאוד לאט להזריק 50 μl של השעיה תא לתוך לומן של קרן הרחם.
- הסר את המחט ושחרר את המהדק הקדמי.
- שחרר את המהדק האחורי ולהחליף את קרן הרחם בחלל הבטן.
- סגור את הצפק באמצעות תפר נספג סינטטי ולסגור את העור באמצעות דבק רקמות.
- הסר את העכבר מהחרטום ומכניס לכלוב. במידת צורך, לשנות את המצעים כדי להבטיח קליאהכלוב n לאחר הניתוח. ודא שכל בעלי החיים ערים ופעילים לפני שעזבת ללא השגחה.
- לספק איבופרופן ב0.11 מ"ג / מיליליטר של מי שתייה לניתוח שלאחר 48 שעות הראשונות. לאחר מכן, להחליף עם מי שתייה רגילה.
- הערה: שאם עכברים בעירום athymic משמשים והעור סגור באמצעות דבק רקמות במקום תפרים, אין צורך להפריד את העכברים לאחר ניתוח. עכברי SCID הם אגרסיביים יותר ועשויים להיות מופרד.
- מקרוב לפקח על האתר של חתך לזיהום אפשרי בשל פצע פתוח.
3. איתור של סרטן השחלות שלב תוך הצפק מוקדם על ידי חי in vivo הדמיה
לקבוע את הנוכחות של מחלת ה- IP תוך הצפק על ידי חי בהדמיה vivo. מערכת Multimodal בעלי החיים סיבוב (MARS) היא שימוש בפרוטוקול זה.
- גש לתוכנה ללכידה MARS מתוך תוכנת MI. מודול זה מספקשליטה מתואמת של MARS ללכוד הגדרות תוך מינוף היכולות הלכידה וניתוח של מערכת ההדמיה. אופטימיזציה של הגדרות לכידה בודדות עבור כל ערוץ באמצעות הדמיה יחידה תצוגה לפני פיתוח פרוטוקול הסיבוב בשלב 3.4.
- קלט שנקבע מראש ערכי לכידה. עבור לכידת הקרינה, שימוש 10 חשיפת שניות, 2 x 2 binning, הפסקה ו 2.8, מ"מ FOV 120, לשעבר: 550 ננומטר,: הגדרת לכידת מסנן 600 ננומטר. עבור לכידת רנטגן, להשתמש חשיפת 10 שניות, 2 x 2 binning, F-Stop 2.8, מ"מ FOV 120, 35 KVP, 0.4 מ"מ הגדרת לכידת מסנן אל.
- שמור את הפרמטרים בשלב 3.2 כקובצי הפעלה בודדים.
- צור פרוטוקול רצף סיבוב על ידי בחירה / כפתור עריכת הפרוטוקולים צור מהחלון לרכוש ממשק המערכת.
- בחר את קובץ הפעלת הקרינה שנשמר בעבר ולשמור כשלב ראשון. בשלב הבא, בחר את קובץ הפעלת רנטגן המתאים ולשמור כשלב שני.
- בצעד אחד נבחר, להשתמש ברוטצית הסטסדרה מהתפריט המוקפץ לכידת תמונה לפני כדי להגדיר את הזווית הרצויה, מגוון, ותוספת מתחילה להבטיח להדמיה חלקה של תכונות. הערכים הספציפיים כוללים זווית התחלה של -180 מעלות, טווח של 375 מעלות, ותוספת של 15 מעלות.
- שמור את הפרוטוקול ולחץ על לחצן סיום כדי לאתחל את MARS ולמפות את עמדות מנוע צעד המתאימות לכל אחד ממרווחי הזווית.
- בצע את הכיול הסופי כפי שיתואר להלן כדי ליישר את הגחון, הגב ונוף לרוחב לבעלי החיים מסוימים ממוקמים בתמיכת בעלי החיים בדרגות מסוימות של סיבוב לשימוש על ידי פרוטוקול התוכנה.
- להרדים את העכבר באמצעות תערובת של אוויר רפואי וisoflurane 2% בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה.
- התחל היישור על ידי הבחירה בלחצן התצוגה המקדימה מתוך התפריט לרכוש כדי להעלות את הכרטיסייה מסובב. השתמש בשיטת האור רעיוני ולא multiwavelength או X-RAשיטות y כדי לזרז את התהליך.
- בחר באפשרות העכבר טען והמשך דרך הסדרה של תפריטי מיצוב.
- להבטיח כי בסופו המוארך של nosecone מתקפל הוא בפגרת nosecone והצב את העכבר בכיוון נוטה עם ראשו בnosecone.
- בגין הכיול במצב של 0 מעלות עם הצד הגחוני של בעלי החיים פונים כלפי מטה. השתמש בשני כפתורי מערכת הסיבוב למצב את בעלי החיים כך שיופיע במרכז חלון התצוגה המקדימה.
- חזור על התהליך כפי שיתבקש ל-180, - 90, +90, ו180 מעלות עמדות ולחץ על Done.
- לבצע את הפרוטוקול שנשמר בעבר על ידי לחיצה על כפתור לבצע פרוטוקול מהחלון לרכוש הראשי. במהלך הביצוע של הפרוטוקול, להתבונן חלון מצב מתן עדכוני סטטוס בזמן אמת ללכידה הנוכחית, משך חשיפה, וצעד פרוטוקול כולל.
- הרכב תמונות בודדות לפורמט סרט באמצעותתוכנת סיבוב. השתמש בפקדי הצג כדי לכוונן את הבהירות / ניגודיות, שקיפות, וכדי להגדיר את צבע התצוגה עבור אותות הקרינה.
- לייצא את הרצף הסופי של תמונות בפורמט של הקובץ * .AVI להצגה.
4. מנהל של 1 st ו- 2 nd כימותרפיה עגולה
- בעקבות גילוי גידולי ip על ידי MARS, לקבוע את אזור נטל גידול הראשוני של העניין (ROI) באמצעות מיצוב דו ממדים סטנדרטיים. זה מבוצע על מצויד במערכת ההדמיה כמתואר להלן בסעיף 5. ברגע שהחזר על השקעה ראשונית נקבעת, לנהל 4 מנות של מ"ג 12 / IP פקליטקסל קילוגרם כל שלושה ימי מגש בעלי חיים שקופים. פקליטקסל מתקבל מHospira Inc בניסוח מוכן לללכת עם cremaphor כרכב. אנחנו הוכיחו בעבר שיש משטר טיפול זה פעילות אנטי-סרטנית ניכרה נגד מודל xenograft בהשוואה לשליטה ברכב וגורמים למיגור t גילוי מלאumor נטל 20. עם זאת, בשל אופי המחלה, גידולי ip חוזרים על עצמם כמה ימים לאחר סיום טיפול 20.
- עקוב אחר תגובה לטיפול על ידי הדמיה כל 3 ימים באמצעות מיצוב דו ממדים סטנדרטיים.
- לאחר המנה הרביעית של פקליטקסל, לסווג את העכברים כבעל (עד 50% מעליית ROI הראשוני תגובה מלאה (ROI פחות מ -2,000), תגובה חלקית (ירידה של עד 35% מהחזר ההשקעה הראשונית המתקבלת משלב 4.1, מחלה יציבה ), או התקדמות בטיפול (עלייה של יותר מ -50% מהחזר ההשקעה ראשונית) המבוסס על אות הניאון שנצפתה.
- לעכברים עם תגובה מלאה, לפקח על הישנות על ידי הדמיה כל 3 ימים. ברגע שההישנות הוא ציין (ROI = ראשוני ROI בשלב 4.1), מחדש ליזום את הסיבוב השני של פקליטקסל כמתואר ב4.1.
- בעכברים עם מחלה חלקית, מחלה יציבה, או אלה שהתקדמו עם טיפול, מחדש ליזום סבב פקליטקסל שני 3 ימים לאחר המנה ה -4של פקליטקסל. באופן דומה, תמונה אלו כל שלושה ימים.
תגובת 5. ניטור לטיפול באמצעות מיקום Standard Two-ממדי
- להרדים את העכברים להדמיה באמצעות תערובת של אוויר רפואי וisoflurane 2% בקצב זרימה של 2 ליטר / דקה.
- מניחים את הראש של העכברים המורדמים בnosecones הבודד במגש בעלי החיים השקוף בתוך חדר ההדמיה (איור. 3).
- קלט הפרמטרים חשיפה שנקבעו מראש לקרינה (10 חשיפת שניות, 2 x 2 binning, F-Stop 2.8, 120 מ"מ, לשעבר FOV: 550 ננומטר,: 600 ננומטר) ורנטגן (חשיפת 20 שניות, 2 x 2 binning, F-Stop 2.8, FOV 120 מ"מ, 35 KVP, 0.4 מ"מ מסנן אל).
- לחץ לחשוף כדי ללכוד את שני התמונות ברצף.
- פתח את התמונות בתוכנת הברוקר MI לבדיקה ואזור של ניתוח עניין חזותי.
6. תמונת כיסוי וניתוח
כדי לספק השוואה תקפה לboניתוח חזותי וכמותית ה של תהליך רצף התמונה כמובן הזמן את כל התמונות של הרקע והחזית דומה.
- פתח את שני תמונת החזית (כלומר הקרינה) והדמית הרקע בתוכנה ובחר את פונקצית האריח מתפריט החלון בחלק העליון (איור. 4 א).
- כדי לעבד את תמונת החזית; פתח את כרטיסיית תצוגת תמונות בסרגל העליון (איור. 4 א, חץ אדום) ולהגדיר את דקות / ערכי מקסימום 260 ו -5,000, בהתאמה (איור. 4 א, חץ כחול)
הערה: טווח תצוגת תמונות שונה ממחקר למחקר, בהתאם לעוצמות אות הקרינה שנתפסו בתמונות. תמונה צריכה להיות בניגוד למינימום / מקסימום שיציג המוני גידול, עדיין לא מראה רקע מautofluorescence של בעלי החיים. - הבא האוטומטית ROIs הפתוחה Tab מחלונית הניווט השמאלי (איור. 4 ב, חץ אדום) ובחר את הקבוצה החדשה ROI מהתפריט (איור. 4C, אדוםrrow). התאם את ההגדרות לשימוש אלגוריתם הסף ב630 רמות גווני אפור ובטל את הגבלת גודל מקסימלי כדי להבטיח את כל ההחזר על ההשקעה הפוטנציאלית של נרשם (איור. 4C).
הערה: הגדרות סף עשויות להיות שונות ממחקר למחקר, בהתאם לעוצמות אות הקרינה שנתפסו בתמונות. תמונות thresholded לכמת אות מהמוני גידול עדיין לא למדוד אות מהרקע מautofluorescence של בעלי החיים. - מתוך חלון תצוגת תמונות לבחור בפונקצית המסכה. עכשיו רק את האזור המתאים לפיקסלים בעלי ערכים שווים או עולה על ערך הסף של 630 רמות גווני אפור יוצג.
- כדי להציג את תוצאות כמותיות בחרו בכרטיסייה ניתוח משורת התפריט העליונה וכרטיסיית התצוגה (איור. 4D, חיצים אדומים) בחר.
- מתפריט התצוגה לבחור את מספר הסידורי, תיבות סימון הסכום, ממוצע, ואזור, ולאחר מכן לחץ על OK.
- שמור את התמונה כל כך את הערכים יכולים להיות לשעברמועבר לאורך פעם אחת את כל תמונות הקרינה מעובדות.
- הבא, סמן את תמונת רנטגן ושוב לפתוח את תצוגת תמונות משורת התפריט העליונה. הגדר את הערכים עבור דקות, מקסימום וגמא לתת הייצוג החזותי הטוב ביותר של שלד העכבר.
הערה: מאחר שלא quantitation מבוצע על תמונות רנטגן כל תמונת רנטגן בודדת מרצף הזמן יכולה להיות מעובד (כלומר דקות, המקסימום וערכי גאמה) כדי לייצר את הייצוג הטוב ביותר למראה של שסט הנתונים. - שוב עם תמונת רנטגן מודגש בחר בתיבת סימון הכיסוי ולבחור את שם קובץ תמונת הקרינה המקביל מתפריט הנפתח (4E איור.).
- כדי לחלץ את הפלט יכסה, בחר בכרטיסייה ההערות והסימונים מתפריט הניווט (איור. 4 ב, חץ כחול) בצד השמאל. בחר כרטיסיות מתאימות להוסיף מידע או טקסט נוסף ולבסוף להוסיף את סרגל קנה המידה אינטנסיביות כל כך ניתן לקבוע את נתוני עוצמת הקרינה במהירות מimגיל.
- ברגע שההסברים הושלמו שיא כל האובייקטים בדף ההסברים ובחר העתקה מתפריט עריכה בחלק העליון ולהדביק את נתוני תמונת overlayed לקובץ המתאים (למשל Word, PowerPoint, ו / או Photoshop) לתצוגה.
- חזרו על שלבי 6.1- 6.11 לכל הזוגות של תמונות הקרינה ורנטגן ברצף. הקפד בטוחות את כל התמונות לפני סגירתם.
- כדי לכמת את הגמר לפתוח את כל תמונות הקרינה באותו הזמן ובחר אריחים מתפריט החלון לאורך החלק העליון.
- הבא לבחור מסמכי היצוא כל פתח כדי להציג את הנתונים.
הערה: בהעדר תכנית Excel, בטל את הבחירה בכרטיסייה. MI יפיק טקסט כרטיסייה מופרד קבצים (כלומר .txt) שניתן להעביר למחשב מתאים לניתוח נוסף.
Representative Results
הדמיה חיה לא פולשנית מאפשרת ניטור של התקדמות גידול IP מאותו העכברים בזמן. הזרקה תוך רחמית של תאי שכותרתו-mCherry F2 השחלות סרטן באמצעות הפרוטוקול המתואר יוצרת גידולי IP גלויים ביום 5 וcarcinomatosis ביום 32 (איור. 5). איור 6 מציג את המתאם של התמונות שהושגו עם carcinomatosis נצפה לאחר להקריב את העכברים .
הדמיה באמצעות MARS מאפשרת זיהוי של גידולי ה- IP שאחרת לפספס אם תמונה שנרכשה ממטוס אחד בלבד. איור 7 (פנל עליון) מראה כי גם בעכברי בקרה עם נטל גידול משמעותי, יכול לזלזל גודל גידול בהתאם לזווית התמונה צולמה מ. היכולת להבטיח כי המסה של גידול לא החמיצה או לזלזל אפילו יותר חשובה בסיומו של טיפול כימותרפי עגול -1 כאשר בעלי חיים מסווגים כמו גם להגיב מלאאה, מגיב חלקי, או שאינו מגיב (איור. 7 אמצע פנל). בדומה לכך, במהלך טיפול תחזוקה זה הוא בעל חשיבות עליונה לגילוי גידולים חוזרים קטנים מאוד לייעד כראוי ימים עד להשנות, המגדיר את המרווח ללא התקדמות מחלה (איור. 7 פנל באמצע).
הערכה כמותית של נטל גידול היא מותאמת באמצעות סיבוב של בעלי חיים. סיבוב של בעלי החיים לזוויות שיהיה למזער את עירור העומק ופליטת האור עובר דרך יאפשר ללכידה מדויקת ביותר של פוטונים מהקרינה, אשר מעידה על הכמות של תאים סרטניים ובכך נטל גידול. לפיכך, כימות הוא מותאם לגידולים ספציפיים בבעלי החיים בהתאם למיקומו ברצף הסיבוב.
בהצגת תמונות של ערכות נתונים רוטציה, חשוב להקצות את תמונות דקות / טווח ניגוד תמונת מקסימום שיהיה יעיל להציג את כל המוני גידול, תוך מתן האפשרות לVisu תיחום אל של המוני גידול בודדים. במחקר זה, מגוון ניגוד אידיאלי נמצא מינימום של 50 ספירות ומקסימום של 1,200 ספירה. ניתן לראות את הערכים הללו כקו מנחה למחקרים אחרים, לעומת זאת, טווחי ניגוד אופטימליים יהיו שונים ממחקר למחקר, בהתאם לרמת גידול נטל, רמות ביטוי פפטיד ניאון בתאים, תצורת מערכת הדמיה, והגדרות לכידה.
איור 1: תאי סרטן השחלות F2 יציבות להביע הקרינה mCherry. (א) תמונת שלב; (ב) תמונת הקרינה; כיסוי (ג) ו- B. שים לב שתאים 100% מבטאים את כתב הקרינה.
"Width =" s.jpg 600 "/>
איור 2: הזרקה תוך רחמית של תאי סרטן השחלות. הרדמה () מנוהלת באופן רציף באמצעות חרטומו; (BE) עור הוא חרות לאתר ומהדק את קרן הרחם; תאים (F) סרטן מוזרקים באיטיות לתוך לומן של הרחם.
איור 3: (א) הדמיה 2D עם טמפרטורה מבוקרת ומעגל סגור מאוורר מגש בעלי חיים שקוף בתוך חדר ההדמיה; מגש (B, C) מצויד בקונוסים האף כדי לספק הרדמה ויכול להכיל עד חמישה עכברים.
<strong> איור 4: לוחות נציג חלון שנלקחו מהתוכנה לניתוח על מנת לסייע בניתוח הנתונים. אנא ראה טקסט עבור הסבר.
איור 5: איתור של הקרינה mCherry שיתוף מקומי עם X-ray ברצף הדמיה אורך. שלושה עכברים עם גידול IP הם אחריו בזמן כדי להעריך התקדמות גידול IP. שים לב כי התקדמות גידול עשויה להשתנות. איור הוא תמונה מייצגת של 3 עכברים עם תעריפים שונים של התקדמות גידול, ולכן משתנה נטל גידול לאורך זמן.
איור 6: מתאם בין נטל גידול IP (פנל עליון) וכיסוי הקרינה / X-ray הר"יג'י (פנל תחתון). כ -32 ימים הודעת הזרקה של תאי סרטן השחלות F2-mCherry, 2D-הדמיה שבוצעה ועכברים הקריבו לתאם נטל גידול בפועל בתמונה שנרכשה. חיצים אדומים מצביעים על נטל גידול.
ערכות נתונים סיבוב המאפשרות הדמיה זווית רבת וזיהוי של גידולים בבקרה (פנל עליון), פקליטקסל שטופל (פנל באמצע), ועכברים חוזרים (פנל תחתון): איור 7. איור מראה תמונה של עכבר אחת לפנל כפי שהוא הסתובב באמצעות מערכת MARS. שים לב כי גם בעכברי בקרה עם נטל גידול משמעותי, גודל גידול יכול לזלזל בהתאם לזווית שהתמונה צולמה מ.
Discussion
אנו מתארים פרוטוקול להקמת מודל ה- IP אנושי סרטן השחלות בעלי חיים המחקה את הפרופיל הקליני שנצפה בחולים. בנוסף, אנו מתארים את השימוש של מכשיר רוטציה של בעלי חיים המתייחס למגבלת הרגישות של ההדמיה 2D. יחדיו, טכניקות אלה יכולים לשמש כפלטפורמות לגלות תרכובות רומן שיכול למקד את סרטן השחלות חוזר ונשנה chemoresistant. בנוסף, מודל כזה יכול לשמש כדי להבין את הביולוגיה של הישנות והתקדמות סרטן.
בשל מיקומו retroperitoneal, xenografts סרטן השחלות IP בשלב מוקדם הם כמעט בלתי אפשרי לזהות על ידי בדיקת העכבר פיזי. ברוב המקרים, ברגע שניתן מששה את המחלה, את נטל הגידול הוא משמעותי כבר, ולכן מגביל את ההערכה של יעילות טיפול. השימוש בתאי שכותרתו fluorescently מאפשר לנו להעריך את הקמתה של גידול IP בזמן אמת וזיהוי הזמן האופטימלי להתחיל t כתוצאה מכךreatment. באופן דומה, xenografts שכותרתו הניאון מאפשר ניטור של תגובה לטיפול. יש לציין-את זה עם זאת IP שגידולים עמוקים יותר מ 1 סנטימטר הוא בדרך כלל לא ניתן לגילוי ללא קשר למערכת הכתב.
השימוש בתאי אדם שחלה בסרטן גזע 14,15,17,22 מייצר xenografts המחקה את הפרופיל הקליני שנצפה בחולים. כמחלה ראשונית, המודל הוא מגיב לפקליטקסל אבל הפסקת טיפול סופו של דבר מובילה למחלות חוזרות ונשנות chemoresistant. הכר את התאים באמצעות קרן הרחם בצפיפות שנקבעה בסעיף הפרוטוקול בדרך כלל תוצאות בגידולים שחלות בתוך 10 ימים עם כמה שתלי הצפק, ולכן מחקה שלב המוקדם של מחלה. השימוש בתאי שכותרתו fluorescently מאפשר לנו להעריך את הקמתה של גידול IP בזמן אמת וזיהוי כתוצאה מכך הזמן האופטימלי להתחיל טיפול. באופן דומה, xenografts שכותרתו הניאון לאפשר o ניטורתגובה ו לטיפול. אם סוגים אחרים של שורות תאי הסרטן נמצאים בשימוש, בשחלות או בדרך אחרת, זה אפשרי, כי פרופיל זה לא יכול להיות שנצפה. כאשר SKOV3 משמש לדוגמא, זה כבר דווח כי גידולי ip הראשוניים כבר עמידים 23. אף על פי כן, אם שכותרתו עם כתב כגון הקרינה, IP, מחלה יכולה להיות מלווה בזמן אמת.
אם נעשה שימוש בכתב ניאון אחר, חשוב לבצע הדמיה ראשונית עם ביקורת (ללא גידול) בבעלי חיים. זה יאפשר אופטימיזציה של פרוטוקול הדמיה כדי להשיג את הרקע הטוב ביותר לאותת יחס. מניסיוננו, בדרך כלל יש לי עכברים בעירום גבוה רקע כאשר צילמו באמצעות הגדרות רכישת GFP.
חשוב שהתאים מוזרקים תוך רחמית נמצאים בהשעיה אחת, כדי למנוע את הקמתה של גידולים ברחם. כמו כן, חשוב להימנע מלגרד את שכבת האפיתל הרחם, שגם מקלה על קליטתם של התאים הסרטנייםשלו ברחם ובכך לייצר גידול תוך רחמית במקום מחלה IP. בנוסף, במהלך ניתוח הנתונים, חשוב לקבוע את ערך גמא 1. זה מבטיח כי עוצמת הדימויים היא ליניארי ומאפשרת השוואה בין תמונות.
במהלך הרכישה של תמונות MARS, חשוב להבטיח כי בסופו המוארך של nosecone מתקפל הוא בפגרת nosecone. Nosecone משמש כנקודת קשר לעכבר ולכן נדרש לקבלת זוויות מכוילות בדיוק. עבור פרוטוקולי הדמיה ארוכים יותר (כלומר שעה יותר מ 1), להזריק מתחת לעור מלח סטרילית 100 μl כדי למנוע התייבשות. טמפרטורת הגוף של בעלי חיים יש לשמור שימוש באוויר חם נע במערכת בכ -37 מעלות צלזיוס. מגבלה של מערכת MARS היא שרק חיה אחת יכולה להיות צילמה בכל פעם עם זמן ריצה כולל של כ 1 שעה לכל בעל חיים.
לסיכום, אנו מתארים את establishment של מודל חיה המחקה סרטן השחלות, שתי מחלות עיקריות וחוזרות באופן הדוק. מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של שיטות אבחון או טיפול חדשניים.
Disclosures
עמלות פרסום לכתבה זו מומנו באופן חלקי על ידי חברת ברוקר.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH RO1CA118678 וRO1CA127913, על ידי קרן חולות המשפחה, וגילוי לרפא תכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
