Abstract
Epithelialen Ovarialkarzinom ist die tödlichste gynäkologischen Malignomen in den Vereinigten Staaten. Obwohl die Patienten zunächst auf die aktuelle Standardtherapie bestehend aus chirurgischen debulking und Kombinationschemotherapie bestehend aus Platin und Taxan-Verbindungen reagieren, fast 90% der Patienten wiederkehren in ein paar Jahren. Bei diesen Patienten ist die Entwicklung von chemoresistenten Krankheits begrenzt die Wirksamkeit der derzeit verfügbaren Chemotherapien und trägt zu der hohen Mortalität daher. Um neue Therapiemöglichkeiten, die wiederkehrende Krankheit zielen können entdecken, werden geeignete Tiermodelle, die das klinische Profil von Patienten mit rezidivierendem Ovarialkarzinom genau imitieren erforderlich. Die Herausforderung bei der Überwachung intraperitoneale (ip) Krankheit schränkt die Verwendung von IP-Modelle und damit die meisten Heterotransplantate etabliert werden subkutan. Wir haben eine empfindliche optische Bildgebungsplattform, die den Nachweis und die anatomische Lage der ip Tumormasse ermöglicht. Die Plattform umfasst die use optischer Reporter, die aus dem Bereich des sichtbaren Lichts bis zum nahen Infrarot, die in Kombination mit 2-dimensionaler Röntgen Coausrichtung anatomische Lage des Molekularsignale erstrecken. Detektions signifikant durch die Verwendung eines Drehsystems, das Tier, um mehrere Winkelpositionen für die 360-Grad-Bildgebung steuert, so dass die Identifizierung von Tumoren, die nicht in Einzel Orientierung sichtbar verbessert. Die Plattform bietet eine einzigartige Modellnichtinvasiv Monitor Tumorwachstum und die Bewertung der Wirksamkeit von neuen Therapien für die Prävention oder Behandlung von rezidivierendem Ovarialkarzinom.
Introduction
Tiermodelle sind unverzichtbare Werkzeuge in der biowissenschaftlichen Forschung. Bei Krebs insbesondere aus tierexperimentellen Studien gewonnenen Daten stellen die erforderlichen Informationen, um das Testen von neuen diagnostischen oder therapeutischen Anwendungen beim Menschen 1-3 initiieren. Tiermodelle für soliden Tumoren sind klassisch eingerichtet subkutan, da es eine einfache Möglichkeit, um die Tumorlast messen und bewerten die Wirksamkeit der Behandlung, ohne die Tiere zu opfern bietet. Tatsächlich erfordern intraperitonealen (ip) Modellen, dass die Tiere getötet, um zu detektieren und zu messen Änderungen im Tumorwachstum werden. , Für IP Krebsarten wie Eierstockkrebs, bieten orthotrope Modelle jedoch den Vorteil des Studiums der Krankheit in ihrem richtige Umgebung 4-6. Für ein solches Modell zur Verwendung bei der Bewertung der Antitumor-Aktivität zu sein, müssen nicht invasive Bildgebungsverfahren entwickelt werden, die die Quantifizierung von ip Tumorlast in lebenden Mäusen ermöglichen.
Eine große Herausforderung in derVerwendung von IP-Tiermodellen ist die Schwierigkeit bei der genauen Quantifizierung der Tumorbelastung durch körperliche Untersuchung. Genaue Quantifizierung von ip Tumoren erfordern in der Regel die Mäuse für die Präparation geopfert werden. Dieser Ansatz erfordert die Verwendung einer hohen Anzahl von Tieren, die zu verschiedenen Zeitpunkten geopfert werden würde. Zusätzlich zu den Kosten, stellt es eine hohe Variabilität der Daten durch die inhärenten Variationen innerhalb jedes Tier. Nicht-invasive in vivo optische Bildgebung bietet eine passendere Ansatz ip Tumorlast in lebenden Mäusen zu überwachen.
Mehrere nicht-invasiven bildgebenden Verfahren sind derzeit in der präklinischen Forschung zur Überwachung von Tumorwachstum und therapeutische Reaktionen verwendet. Diese umfassen Computertomographie (CT), Ultraschall (US), Magnetresonanztomographie (MRI), Positronenemissionstomographie (PET), und optische Bildgebung, wie Fluoreszenz und Biolumineszenz 7-12. CT ist ein Übertragungsabbildungsverfahren kombiniert Röntgen- und ComputER-Technologie. Es erzeugt ein Querschnittsbild des erfassten Strahlen energiereicher Photonen, die durch den Körper mit unterschiedlicher Geschwindigkeit durchläuft. US ist eine Art Reflexionsbild, das Hochfrequenz-Töne an den Körper schaffen Schallwellen, die mit unterschiedlicher Geschwindigkeit, je nach Gewebedichte und vom Computer erkannt, um ein sichtbares Bild zu erzeugen widerspiegeln sendet der. MRT und PET sind Emissionsbildgebungsmodalitäten, die magnetische Energie und nukleare Partikel zu verwenden, bzw. um das Bild zu erzeugen. MRT erzeugt ein starkes Magnetfeld, das Zellen induziert, um ihre eigenen Funkfrequenzen, die verwendet werden, um ein Bild zu erstellen produzieren, während PET erfordert eine empfindliche Kamera, um die Radioaktivität des administriert markierten 2-fluorodeoxy-D-Glucose 7,9,11 erkennen. Schließlich wird die optische Abbildung auf die Detektion des Emissionslichts von Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Reportern oder Sonden 9,12 basiert.
In diesem Bericht beschreiben wir die Verwendung von Fluoreszenz, die bieteteinige Vorteile gegenüber anderen Arten von Bildgebungsmodalitäten. Mit Fluoreszenzabbildung können die Zellen gentechnisch verändert, um fluoreszierende Proteine exprimieren kontinuierlich, ohne dass die Zugabe eines Substrats oder Ligation basierende Sonden, die Bedingung für Biolumineszenz und Magnetresonanztomographie, sind jeweils sein. Fluoreszenz-Reporter exprimieren typischerweise auch ein helleres Signal somit die Verwendung einer weniger empfindlichen Nachweisverfahren 8,12 ermöglicht. Zusätzlich mit Fluoreszenzabbildung ist es möglich, Tumoren kleiner als 1 cm, die nicht erreichbar ist mit CT 7-9 zu erkennen. Schließlich, im Gegensatz zu Biolumineszenz, Fluoreszenz-Signal erfordert keine aeroben Umgebung und damit das Signal nicht in hypoxischen Umgebungen, die normalerweise in den Kernen von großen Tumoren auftreten, werden 13 begrenzt.
Als jede andere Technologie haben jedoch fluoreszenzbasierten Abbildungsverfahren Nachteile. Eines davon ist die Unfähigkeit des machine-generierten Photonen niedriger Energie auf eine ausreichende Tiefe zu durchdringen. Um somit die Menge des diffundierten Gewebe Photonen, sollten die Tiere in verschiedenen Winkeln abgebildet werden minimiert. Wir beschreiben ein Protokoll an eine IP Eierstockkrebs in Nacktmäusen und einen Ansatz für ip Tumorüberwachung, die gesamte Tierbildgebung bietet durch Rotation zu etablieren. Der Rotator Winkeln die Maus auf spezifischen und wiederholbaren Positionen Verringerung der Gewebestörungen, die oft zwischen der Lichtquelle und dem Detektor auftritt. Dies optimiert die Visualisierung von kleineren Tumoren, die sonst übersehen werden könnten.
Protocol
Die Yale University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigen alle in vivo beschriebenen Arbeiten. Probenentnahme wurde mit Zustimmung des Patienten durchgeführt und von der Human Investigations Committee von der Yale University School of Medicine genehmigt.
1. Herstellung von menschlichen Eierstockkrebszellen
- Vor der Herstellung der Zellen sicherzustellen, dass alle für die unten beschriebene intrauterine Injektion benötigten Materialien bereit und leicht zugänglich. Spritzen Sie die Zellsuspension, sobald es fertig ist.
- Wachsen Fluoreszenz-markierten Tumorzellen in Kultur. Wir verwenden eine F2-Generation von menschlichen CD44 + / + MyD88 epithelialen Eierstockkrebszellen, die wir früher gezeigt, um stemness Eigenschaften wie Tumorbildung, Chemoresistenz und eine hohe Kapazität für die Tumorreparatur 14-19 beherbergen. Diese Zellen wurden erzeugt, um stabil mCherry Fluoreszenz exprimieren (F2-mCherry, Fig. 1) unter Verwendung von dem Lentivirus Polyethylenimin hergestellt(PEI) Protokoll 20,21.
- Am Tag der Injektion, Ernte der Zellen durch Trypsinierung und einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zu waschen.
- Zellzahl zu bestimmen, und die Zellen zu suspendieren 3 x 10 6 Zellen / 50 & mgr; l in geeigneten Nährmedien. Für die Eierstockkrebszellen verwenden wir 160 RPMI mit 10% FBS. Halten Sie die Zellen im Brutschrank, bis die Injektion bereit, aber nicht länger als 15 min zu halten. Dies ist ausreichend für eine Maus Injektion.
2. Intra-uterine Injektion von menschlichen Eierstockkrebszellen in Nacktmäusen ohne Thymus
Beachten Sie, dass das folgende Verfahren erfordert Unterstützung durch eine zweite Person. Zusätzlich kann, da dies das Überleben Chirurgie, sterile chirurgische Instrumente. Diese Überlebens Chirurgie Verfahren sollte etwa 10 bis 15 Minuten dauern.
- Anesthetize die Maus mit 2% Isofluran. 7- bis 8-Wochen alten athymischen Nacktmäusen typischerweise verwendet.
- Stellen Sie sicher, dass das Tier completEly durch Einklemmen des Fußballen mit den Fingern oder einer Pinzette anästhesiert. Das Tier sollte vollständig nicht in Reaktion auf den Schmerz vor Beginn der Operation.
- Platzieren Sie den narkotisierten Maus Bauchseite nach oben auf einem sterilen Gaze mit dem Kopf von der Ermittler.
- Bewerben Salbe auf die Augen mit einem Baumwollspitze Applikator zur Trockene, während der Narkose zu verhindern.
- Den Kopf in einer Nasenkonus-System zu einer Isofluran Verdampfer (Abb. 2A) angeschlossen sofort einfügen. Diese liefert die Anästhesie in der gesamten chirurgischen Eingriffs.
- Desinfizieren Sie die linke (oder rechte) Seite des Bauches mit Alkoholtupfer (Abb. 2B), gefolgt von Jod dann einen sterilen Operationstuch über der Operationsstelle.
- Mit einer sterilen chirurgischen Schere und Pinzette machen einen 1-2 cm Hautschnitt in der linken unteren Quadranten der Maus (Abb. 2C).
- Heben Sie den Muskel und einen Einschnitt, um das Peritoneum erreichen. <li> Präparieren Sie die schrägen Muskeln, um die Bauchhöhle aus.
- Suchen und identifizieren das linke Uterushorn (Abb. 2D).
- Mit einer sterilen hemostat, klemmen die beiden vorderen und hinteren Seiten des Horns (Abb. 2E). Legen Sie die vordere Klammer rechts unterhalb der Eileiter und die hintere Klemme direkt über dem Muttermund.
- Haben die zweite Person zu injizieren die Zellsuspension. Die Nadel enthaltenden Zellen bei 45 ° Winkel senkrecht zu dem Horn (Fig. 2F). Sehr langsam injizieren 50 ul Zellsuspension in das Lumen des Uterushorns.
- Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie die vordere Klemme.
- Lassen Sie die hintere Klemme und ersetzen Sie das Uterushorn in der Bauchhöhle.
- Schließen Sie das Bauchfell mit einem synthetischen resorbierbaren Naht und schließen Sie die Haut mit einem Gewebekleber.
- Entfernen Sie die Maus vom Nasenkegel und legen wieder in den Käfig. Falls erforderlich, ändern Sie die Bettwäsche, eine Clea sicherzustellenn Käfig nach der Operation. Achten Sie darauf, alle Tiere wach und aktiv, bevor sie unbeaufsichtigt sind.
- Geben Ibuprofen bei 0,11 mg / ml Trinkwasser für die ersten 48 Stunden nach der Operation. Danach Ersetzen mit regulären Trinkwasser.
- Hinweis: wenn athymischen nackten Mäusen verwendet, und die Haut wird mit Gewebekleber verschlossen anstelle von Nähten, ist es nicht notwendig, den Mäusen nach der Operation trennen. SCID-Mäuse sind aggressiver und müssen voneinander getrennt werden.
- Den Ort der Einschnitt für mögliche Infektion durch offene Wunde genau beobachten.
3. Nachweis der Early Stage Intraperitonealtest Eierstockkrebs durch Live In-vivo-Bildgebung
Bestimmen Sie die Anwesenheit von Intraperitonealtest ip Krankheit durch Live-in-vivo-Bildgebung. Ein multimodales Tier Rotation System (MARS) wird in diesem Protokoll verwendet.
- Besuchen Sie das MARS-Capture-Software aus dem MI-Software. Dieses Modul bietetkoordinierte Steuerung des MARS Aufnahmeeinstellungen bei gleichzeitiger Nutzung Erfassung und Analyse-Funktionen des bildgebenden Systems. Optimieren einzelner Aufnahmeeinstellungen für jede Modalität mit einer Einzelansicht Bildgebung vor der Entwicklung der Drehprotokoll in Schritt 3.4.
- Eingang vorgegebenen Erfassungswerte. Für Fluoreszenzerfassung, verwenden 10 sec Belichtung, 2 x 2 Binning, Blende 2,8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, Em: 600 nm-Filter-Capture-Einstellung. Für X-ray-Capture, verwenden Sie ein 10 sec Belichtung, 2 x 2 Binning, Blende 2,8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al-Filter-Capture-Einstellung.
- Speichern Sie die Parameter in Schritt 3.2 als einzelne Session-Dateien.
- Erstellen Sie eine Drehung Sequenzprotokoll, indem Sie das Create / Edit Protokolle Schaltfläche aus der Systemschnittstelle erwerben Fenster.
- Wählen Sie die zuvor gespeicherte Fluoreszenzsitzungsdatei und speichern als Schritt eins. Als nächstes wählen Sie den entsprechenden Röntgensitzungsdatei und speichern als Schritt zwei.
- Mit Step One ausgewählt, verwenden Sie das Set RotationSerie aus der Vor Bilderfassung Popup-Menü, um die gewünschte Startwinkel, Reichweite und Schrittweite eingestellt, um für eine nahtlose Darstellung von Funktionen zu gewährleisten. Die spezifischen Werte einen Anfangswinkel von -180 Grad, einen Bereich von 375 Grad, und ein Inkrement von 15 Grad.
- Speichern Sie das Protokoll, und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig, um das MARS initialisieren und ordnen Sie die Schrittmotor-Positionen entsprechend jeder der Winkel-Schritten.
- Durchführen des letzten Kalibrierung, wie unten beschrieben, um die ventral, dorsal und Seitenansichten zur spezifischen Tier in der Tierträger mit bestimmten Grad der Drehung positioniert auszurichten, um durch die Software-Protokoll verwendet werden.
- Betäuben die Maus mit einem Gemisch aus Luft und medizinischen 2% Isofluran bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min.
- Starten Sie die Ausrichtung, indem Sie auf die Schaltfläche Vorschau aus dem Menü Erfassen, um das Tab Rotator. Verwenden Sie die Reflexionslicht Modalität statt der Multiwellenlängen-oder X-ray Modalitäten, um den Prozess zu beschleunigen.
- Wählen Sie die Maus Option Laden und fahren durch die Reihe von Positionierungsmenüs.
- Stellen Sie sicher, dass die verrohrt Ende des zusammenklappbaren nosecone im nosecone Aussparung und platzieren Sie die Maus in Bauch Orientierung mit dem Kopf in der Vorsatzhaube.
- Beginnt die Kalibrierung an der 0 Grad-Position mit der Bauchseite des Tieres nach unten. Verwenden Sie die beiden Knöpfe auf der Rotationssystem, das Tier so zu positionieren, dass es im Vorschaufenster angezeigt wird zentriert.
- Wiederholen Sie den Vorgang für -180 aufgefordert, - 90, 90 und 180 Grad-Positionen und klicken Sie auf Fertig.
- Führen Sie die zuvor gespeicherte Protokoll durch Klicken auf die Execute-Protocol-Taste aus dem Hauptfenster erwerben. Während der Ausführung des Protokolls, beobachten ein Statusfenster die Bereitstellung von Echtzeit-Status-Updates für das aktuelle Capture, Expositionsdauer, und die allgemeine Protokoll Schritt.
- Montieren Sie Einzelbilder zu einem Film-Format unter Verwendung derRotation Software. Verwenden Sie die Display-Steuerelemente, um die Helligkeit / Kontrast, Transparenz anzupassen, und die Anzeigefarbe für die Fluoreszenz-Signal gesetzt.
- Exportieren Sie die endgültige Reihenfolge der Bilder im * .avi-Dateiformat für Präsentation.
4. Verwaltung der 1. und 2. Runde Chemotherapie
- Nach ip Tumorerkennung durch MARS, bestimmen die anfängliche Tumorlast Region of Interest (ROI) unter Verwendung von Standard zweidimensionale Positionierung. Dies wird auf einem transparenten Tierwanne in dem Abbildungssystem ausgestattet, wie unten in Abschnitt 5 beschrieben Sobald anfänglichen ROI bestimmt ist, zu verabreichen 4 Dosen von 12 mg / kg Paclitaxel ip alle drei Tage durchgeführt. Paclitaxel wird von Hospira Inc. in einem ready-to-go-Formulierung mit Cremaphor als Fahrzeug erhalten. Wir haben vorher gezeigt, dass dieses Behandlungsschema besitzt signifikante Anti-Tumor-Aktivität gegen das Xenotransplantat-Modell im Vergleich zur Fahrzeugsteuerung und induziert vollständige Ausrottung von nachweisbaren tumor Last 20. Jedoch aufgrund der Natur der Krankheit, ip Tumoren wiederholen wenige Tage nach der Behandlung Enden 20.
- Überwachen Ansprechen auf die Behandlung durch Abbilden alle 3 Tage unter Verwendung von Standard zweidimensionale Positionierung.
- Nach der vierten Dosis von Paclitaxel, klassifizieren die Mäuse als mit vollständigem Ansprechen (ROI weniger als 2000), partielle Remission (bis zu 35% Rückgang gegenüber dem aus dem Schritt 4.1, stabile Erkrankung erhalten anfänglichen ROI (bis zu 50% Steigerung gegenüber dem anfänglichen ROI ) oder Progression mit Behandlung (mehr als 50% Zunahme vom ersten ROI) auf Basis des ermittelten Fluoreszenzsignal.
- Bei Mäusen mit vollständigem Ansprechen, überwachen Rezidiv durch Abbilden alle 3 Tage. Sobald Rezidiv beobachtet (ROI = ROI in Schritt 4.1 initial), re-initiieren die zweite Runde der Paclitaxel wie in 4.1 beschrieben.
- In Mäusen, die mit Teilerkrankung, stabile Erkrankung, oder solche, die mit der Behandlung fortgeschritten ist, re-initiieren zweite Runde der Paclitaxel 3 Tage nach der 4. Dosisvon Paclitaxel. Ebenso Bild diese alle drei Tage.
5. Monitoring Ansprechen auf die Behandlung Verwendung von Standard-Zweidimensionale Positionierung
- Betäuben die Mäuse mit einem Gemisch aus Luft und medizinischen 2% Isofluran bei einer Fließgeschwindigkeit von 2 L / min bebildert werden.
- Legen Sie die Spitze der narkotisierten Mäusen in einzelnen nosecones im transparenten Tier Fach innerhalb des Abbildungskammer (Abb. 3).
- Geben Sie die vorgegebene Belichtungsparameter für die Fluoreszenz (10 sec Belichtung, 2 x 2 Binning, Blende 2,8, FOV 120 mm, ex: 550 nm, Em: 600 nm) und Röntgen (20 sec Belichtung, 2 x 2 Binning, Blende 2.8, FOV 120 mm, 35 kVp, 0,4 mm Al-Filter).
- Klicken Expose, beide Bilder in der Reihenfolge zu erfassen.
- Öffnen Sie die Bilder in der Bruker MI Software für die visuelle Inspektion und Region von Interesse Analyse.
6. Bild-Overlay und Analyse
Um einen gültigen Vergleich für bo bietenth visuelle und quantitative Analyse der Zeitbild natürlich Folge verarbeiten alle Vorder- und Hintergrundbilder ähnlich.
- Öffnen Sie sowohl das Vordergrundbild (dh Fluoreszenz) und die Hintergrund Bildgebung in der Software und wählen Sie die Kachel-Funktion aus dem Menü Fenster an der Spitze (Abb. 4A).
- Zu verarbeiten das Vordergrundbild; öffnen Sie die Registerkarte Bildanzeige in der oberen Leiste (Abb. 4A, roter Pfeil) und stellen Sie die min / max-Werte bis 260 und 5000, jeweils (Abb. 4A, blauer Pfeil)
Hinweis: Bildanzeigebereich unterscheidet sich von Studie in Abhängigkeit von den Fluoreszenzsignalintensitäten in Bildern eingefangen, um zu studieren. Die Bilder sollten mit einer min / max, die Tumormassen zeigen wird, noch Hintergrund von Autofluoreszenz des Tieres nicht zeigen gegenübergestellt werden. - Weiter offene Auto-ROIs Tab aus dem Navigationsbereich auf der linken Seite (Abb. 4B, roter Pfeil) und wählen Sie die neue ROI Set aus dem Menü (Abb. 4C, rot einrrow). Passen Sie die Einstellungen, um die Schwellenalgorithmus bei 630 Graustufen zu verwenden, und deaktivieren Sie die Größe begrenzen Max, alle potenziellen ROI werden aufgezeichnet (Abb. 4C) zu gewährleisten.
Hinweis: Threshold-Einstellungen können von Studie zu Studie in Abhängigkeit von den Fluoreszenzsignalintensitäten in Bildern eingefangen abweichen. Bilder schwellen auf Signal von Tumormassen quantifizieren noch Signal nicht messen vom Hintergrund aus Autofluoreszenz des Tieres. - Aus dem Bildfenster anzeigen wählen Sie das Mask-Funktion. Jetzt nur die Fläche, die den Pixeln, die Werte gleich oder größer als die Schwellenwert von 630 Graustufen erhalten wird angezeigt.
- So zeigen die quantitativen Ergebnisse wählen Sie die Registerkarte Analysis aus der oberen Menüleiste und die Auswahl der Anzeige Registerkarte (Abb. 4D, rote Pfeile).
- Wählen Sie im Menü Anzeige wählen Sie die Seriennummer, Summe, Mittelwert, und Area Kontrollkästchen und klicken Sie dann auf OK.
- Speichern Sie das Bild so können die Werte ex seinportiert entlang sobald alle Fluoreszenzbilder werden verarbeitet.
- Markieren Sie dann das Röntgenbild und aus der oberen Menüleiste öffnen Sie die Bildanzeige wieder. Legen Sie die Werte für min, max und Gamma um das beste visuelle Darstellung der Maus Skelett geben.
Hinweis: Da keine Quantifizierung basiert auf der Röntgenbilder jedes einzelnen Röntgenbild von der Zeitfolge verarbeitet werden kann, durchgeführt (dh min, max und Gamma-Werte), um die beste schau Darstellung dieses Datensatzes zu erzeugen. - Wieder mit dem Röntgenbild markiert das Kontrollkästchen Overlay und wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenzbild Dateinamen aus dem Dropdown-Menü (Abb. 4E).
- Um die überlagert Ausgangs extrahieren, wählen Sie die Registerkarte Anmerkungen vom Navigationsmenü (Abb. 4B, blauer Pfeil) auf der linken Seite. Wählen Sie den entsprechenden Registerkarten, um zusätzliche Daten oder Text addieren und schließlich fügen Sie die Intensitätsskala bar, so dass die Fluoreszenzintensität Daten schnell von der IM bestimmt werdenAlter.
- Sobald die Anmerkungen werden abgeschlossen Highlight alle Objekte auf der Seite Anmerkungen und wählen Sie Kopieren aus dem Menü Bearbeiten am oberen und die überlagerten Bilddaten in die entsprechende Datei einfügen (zB Word, Powerpoint und / oder Photoshop) für die Anzeige.
- Wiederholen Sie die Schritte 6.1- 6.11 für alle Paare von Fluoreszenz und Röntgenbilder in der Sequenz. Seien Sie sicher, sicher alle Bilder vor dem Schließen sie.
- Für die endgültige Quantifizierung öffnen Sie alle Fluoreszenzbilder gleichzeitig und wählen Tile aus dem Menü Fenster am oberen Rand.
- Als nächstes wählen Sie die Export alle geöffneten Dokumente, um die Daten anzuzeigen.
Hinweis: In Abwesenheit von Excel-Programm, deaktivieren Sie die Registerkarte. MI wird eine Registerkarte getrennte Text (dh .txt) Datei, die auf einem geeigneten Computer zur weiteren Analyse übertragen werden können erzeugen.
Representative Results
Nicht-invasive Echtzeit-Bildgebung erlaubt die Überwachung von IP-Tumorprogression von der gleichen Mäusen durch die Zeit. Intrauterine Injektion von mCherry markierten F2 Eierstockkrebszellen unter Verwendung des beschriebenen Protokolls erzeugt sichtbare Tumoren ip am Tag 5 und carcinomatosis am Tag 32 (Fig. 5) Fig. 6 zeigt die Korrelation der erhaltenen Bilder mit carcinomatosis nach dem Töten der Mäuse beobachtet .
Bildgebung mit MARS erlaubt den Nachweis von Tumoren, die sonst ip verpasst wird, sollte das Bild aus nur einer einzigen Ebene erfasst werden. In 7 (oben) zeigt, dass auch bei den Kontrollmäusen mit signifikanten Tumorlast, Tumorgröße unterschätzt werden kann in Abhängigkeit von der Winkel das Bild wurde entnommen. Die Möglichkeit, sicherzustellen, dass Tumormasse wird nicht verpasst oder zu unterschätzen ist bei Abschluss des 1. Runde Chemotherapie umso wichtiger, wenn die Tiere entweder als komplette reagieren kategorisiertäh, Teil Responder oder Non-Responder (Abb. 7 Mitte). Ebenso während der Erhaltungstherapie ist es von größter Bedeutung ist, sehr kleine Rezidivtumoren zu erkennen, richtig zu benennen Tage bis zum Rezidiv, welches das progressionsfreie Intervall (Abb. 7 Mitte) definiert.
Quantitative Beurteilung der Tumorlast durch Tier Drehung optimiert. Rotation des Tieres, um die Winkel, die die Tiefe Erregung minimieren und Emissionslicht durch reist wird für die genaueste Erfassung von Photonen aus dem Fluoreszenz, was auf die Menge der Tumorzellen und damit Tumorlast ist zu ermöglichen. Daher wird die Quantifizierung für spezifische Tumore im Tier in Abhängigkeit von seiner Position in der Rotationssequenz optimiert.
Bei der Präsentation Bilder der Dreh Datensätze ist es wichtig, um die Bilder zu vergeben Sie einen min / max Bildkontrastumfang, die alle Tumormassen effektiv angezeigt werden, während es für Visu al Abgrenzung der einzelnen Tumormassen. Für diese Studie wurde ideale Kontrastumfang gestellt, dass ein Minimum von 50 Grafen und einem Maximum von 1200 zählt sein. Diese Werte können als Leitfaden für andere Studien sehen jedoch optimale Kontrastbereiche wird von Studie zu Studie je nach Tumorlast Ebene fluoreszierenden Peptid-Expressionsniveaus in Zellen, Imaging Systemkonfiguration und Aufnahmeeinstellungen abweichen.
Abbildung 1: F2 Eierstockkrebszellen stabil mCherry Fluoreszenz auszudrücken. (A) Phasenbild; (B) Fluoreszenzbild; (C) Überlagerung von A und B. Man beachte, dass 100% der Zellen das Fluoreszenzreporter.
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Abbildung 2: Intra-uterine Injektion von Eierstockkrebszellen. (A) Narkose kontinuierlich über eine Nasenkegel verabreicht; (BE) Haut eingeschnitten zu lokalisieren und zu klemmen die Uterushorn; (F) Krebszellen sind, langsam in das Lumen der Gebärmutter injiziert.
Figur 3: (A) der 2D-Bildgebung mit einem temperaturgesteuerten Stromkreis schließen und belüfteten transparent Tierschale innerhalb der Abbildungskammer; (B, C) Fach mit Nasenkegel ausgestattet Anästhesie liefern und kann bis zu fünf Mäuse halten.
<strong> Abbildung 4: Repräsentative Fensterscheiben von der Analyse-Software getroffen, um bei der Datenanalyse zu unterstützen. Bitte siehe Text zur Erläuterung.
Figur 5: Nachweis von mCherry Fluoreszenz mit Röntgen in Längsbildgebungssequenz co-lokalisiert. Drei Mäuse mit ip Tumor werden durch die Zeit gefolgt, um ip Tumorprogression zu bewerten. Beachten Sie, dass Tumorprogression kann variieren. Figur ist ein repräsentatives Bild von 3 Mäusen, die mit verschiedenen Raten von Tumorprogression und daher unterschiedlichen Tumorbelastung durch die Zeit.
Abbildung 6: Zusammenhang zwischen ip Tumorlast (oben) und Fluoreszenz / X-ray-Overlay image (Bodenplatte). Etwa 32 Tage nach der Injektion von F2-mCherry Eierstockkrebszellen, 2D-Bildgebung durchgeführt wird und die Mäuse getötet, um tatsächliche Tumorlast mit dem aufgenommenen Bild korrelieren. Rote Pfeile zeigen auf Tumorlast.
Abbildung 7: Rotation Datensätze ermöglicht behandelt Multi-Angle-Bildgebung und Erkennung von Tumoren in der Systemsteuerung (oben), Paclitaxel (Mitte), und wiederkehrenden Mäuse (Bodenplatte). Abbildung zeigt Bild von einem einzigen Mausklick pro Panel, wie es mit der MARS-System gedreht wird. Beachten, dass auch bei den Kontrollmäusen mit signifikanten Tumorbelastung kann die Tumorgröße in Abhängigkeit von dem Winkel, den die Bild entnommen wurde unterschätzt werden.
Discussion
Wir beschreiben ein Protokoll an eine IP menschlichen Eierstockkrebstiermodell, dass das klinische Profil bei Patienten beobachtet nachahmt etablieren. Ferner beschreiben wir die Verwendung eines Tieres Drehvorrichtung, die die Empfindlichkeit der Beschränkung der 2D-Bildgebung Adressen. Zusammengenommen können diese Techniken als Plattformen dienen, neue Verbindungen, die chemoresistenten rezidivierendem Ovarialkarzinom zielen kann entdecken. Darüber hinaus können solche Modell verwendet, um die Biologie von Rezidiv und Progression zu verstehen.
Aufgrund seiner retroperitonealen Lage sind im Frühstadium ip Eierstockkrebs Xenografts fast unmöglich, durch physisches Prüfung der Maus erkennen. In den meisten Fällen, wenn die Krankheit zu tasten, ist die Tumorbelastung bereits erhebliche und begrenzt die Bewertung der Wirksamkeit der Behandlung damit. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen ermöglicht es uns, die Einrichtung von IP-Tumor in Echtzeit und damit die Identifizierung der optimalen Zeit zu beginnen t beurteilenEHANDLUNG. In ähnlicher Weise, fluoreszenzmarkierten Xenografts ermöglichen Überwachung von Therapieansprechen. Es sollte darauf hingewiesen werden-out jedoch, dass IP-Tumoren tiefer als 1 cm sind typischerweise nicht nachweisbar ungeachtet des Reportersystems.
Die Verwendung von menschlichen Eierstockkrebsstammzellen 14,15,17,22 erzeugt Xenotransplantaten, die das klinische Profil in Patienten beobachtet imitieren. Als Primärerkrankung, ist das Modell in Reaktion auf Paclitaxel aber Absetzen der Behandlung führt schließlich zu chemoresistant Rezidiven. Die Einführung der Zellen durch die Gebärmutterhörner an der im Protokoll festgelegten Abschnitt Dichte führt in der Regel Ovarialtumoren innerhalb von 10 Tagen mit ein paar Bauch Implantate und damit ahmt Frühstadium der Krankheit. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Zellen ermöglicht es uns, die Einrichtung von IP-Tumor in Echtzeit zu identifizieren und folglich die optimale Zeit, um die Behandlung zu beginnen beurteilen. In ähnlicher Weise fluoreszenzmarkierten Xenotransplantate ermöglichen die Überwachung of Reaktion auf die Behandlung. Wenn andere Typen von Krebszelllinien verwendet werden, Eierstock- oder andernfalls ist es möglich, dass dieses Profil kann nicht beobachtet werden. Wenn SKOV3 wird verwendet, beispielsweise wurde berichtet, dass die Anfangs ip Tumoren sind bereits resistent 23. Wenn jedoch mit einem Reporter, wie Fluoreszenz, ip markiert Krankheit kann in Echtzeit verfolgt werden.
Wenn andere Fluoreszenzreporter verwendet wird, ist es wichtig, die ursprüngliche Abbildung mit einer Kontrolle (kein Tumor) Tier durchzuführen. Dies ermöglicht die Optimierung der Bildgebungsprotokoll, um die besten Hintergrund-Signal-Verhältnis zu erzielen. Nach unserer Erfahrung haben Nacktmäusen typischerweise hohen Hintergrund, wenn abgebildet mit den GFP Akquisition Einstellungen.
Es ist wichtig, dass die Zellen injiziert intrauterinen in Einzel Aussetzung die von Tumoren in den Uterus zu vermeiden. Es ist auch wichtig, um zu vermeiden Kratzer auf der Uterus Epithelschicht, die auch erleichtert Verpflanzung der Krebszelles in der Gebärmutter wodurch ein intrauterinen Tumor statt einer IP-Krankheit. Zusätzlich wird während der Datenanalyse ist es wichtig, den Gammawert auf 1. Dies stellt sicher, dass die Intensität der Bilder ist linear und ermöglicht den Vergleich zwischen den Bildern gesetzt.
Während der Erfassung der MARS-Bildern ist es wichtig, sicherzustellen, dass die verrohrt Ende des zusammenlegbaren Nasenkonus ist in der Vorsatzhaube Ausnehmung. Die Vorsatzhaube dient als Anlaufstelle für die Maus und ist daher für den Erhalt präzise kalibrierten Winkel erforderlich. Für längere Bildgebungsprotokolle (dh länger als 1 Stunde), injizieren 100 ul steriler Kochsalzlösung subkutan um zu verhindern Austrocknung. Tierkörpertemperatur sollte unter Verwendung von warmer Luft gehalten werden floß durch das System bei etwa 37 ° C. Eine Beschränkung des MARS-System ist, dass nur ein Tier auf einmal mit einer Gesamtlaufzeit von etwa 1 Stunde pro Tier abgebildet wird.
Abschließend beschreiben wir die establishment eines Tiermodells, das imitiert Eierstockkrebs, sowohl primäre als auch wiederkehrende Krankheit. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer Diagnose- oder Therapieverfahren zu bewerten.
Disclosures
Veröffentlichung Kosten für diesen Artikel wurden teilweise durch die Bruker Corporation gesponsert.
Acknowledgments
Diese Studie wurde vom NIH Zuschüsse RO1CA118678 und RO1CA127913, die von der Sands Family Foundation, und die Entdeckung, um Programm zu heilen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
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