Abstract
Раком яичников является самым смертоносным гинекологическое злокачественное в Соединенных Штатах. Хотя пациенты изначально реагировать на нынешний стандарт медицинской помощи, состоящей из хирургической циторедукция и комбинированной химиотерапии, состоящей из платины и таксановых соединений, почти 90% пациентов повторяются в течение нескольких лет. У этих больных развитие заболевания химиорезистентных ограничивает эффективность имеющихся в настоящее время химиотерапевтических агентов и, следовательно, способствует высокой смертностью. Чтобы обнаружить новые варианты терапии, что может нацелены рецидив заболевания, соответствующие модели на животных, что тесно имитируют клинический профиль больных с рецидивами рака яичников необходимы. Задача в мониторинге внутрибрюшинную (IP) болезнь ограничивает использование моделей IP и, таким образом, большинство ксенотрансплантаты устанавливаются подкожно. Мы разработали чувствительный оптический платформу визуализации, который позволяет обнаруживать и анатомическое расположение опухолевой массы ф. Платформа включает в себя USE оптических репортеров, которые простираются от диапазона видимого света до ближнего инфракрасного излучения, который в сочетании с 2-мерного рентгеновской со-регистрации может обеспечить анатомической локализации молекулярных сигналов. Обнаружение значительно улучшается за счет использования системы вращения, что приводит к животному нескольких угловых положениях для 360 градусов изображений, что позволяет идентифицировать опухоли, которые не видны в одной ориентации. Эта платформа предоставляет уникальную модель неинвазивного роста опухоли мониторинг и оценку эффективности новых методов лечения для профилактики или лечения рецидивирующего рака яичников.
Introduction
Животные модели незаменимыми средствами в жизни научных исследований. При раке особенно, данные, полученные из исследований на животных обеспечивают необходимую информацию, необходимую для начала тестирование новых диагностических или терапевтических целях у человека 1-3. Животные модели для солидных раков в классическом создана подкожно, как это обеспечивает легкий способ для измерения опухолевой и оценить эффективность лечения без необходимости жертвовать животных. В самом деле, внутрибрюшинным (IP) модели требуют, что животные в жертву, чтобы обнаружить и измерить любые изменения в росте опухоли. Тем не менее, в случае рака ИС, рака яичников, ортотропные модели имеют то преимущество, изучая заболевание в его надлежащем среды 4-6. Для такой модели, чтобы быть полезным в оценке противоопухолевой активности, неинвазивные методы визуализации должны быть разработаны, что позволит количественно оценить опухолевой IP в живых мышей.
Одна из основных задач вИспользование IP-моделях на животных, является трудность в точно количественного опухолевой медицинский осмотр. Точная количественная оценка ИС опухолей обычно требуют мышей, которые будут принесены в жертву для вскрытия. Этот подход требует использования большого количества животных, которые были бы в жертву в различные моменты времени. В дополнение к стоимости, он вводит высокую изменчивость данных из-за присущих вариаций в пределах каждого животного. Неинвазивная в естественных оптических изображений обеспечивает более подходящий подход для мониторинга IP-опухолевой в живых мышей.
Несколько неинвазивные методы визуализации в настоящее время используются в доклинических исследований для мониторинга роста опухоли и терапевтических ответов. К ним относятся компьютерная томография (КТ), ультразвуковое исследование (США), магнитно-резонансная томография (МРТ), позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), и оптических изображений, таких как флуоресценции и биолюминесценции 7-12. КТ является процессом визуализации передачи объединения рентген и Computэ технологии. Он производит сечение образ обнаруженных лучей высоких энергий фотона, который проходит через тело с разной скоростью. США является одним из видов отражения образа, который посылает высокочастотные звуки в организме создания звуковых волн, которые отражаются с разной скоростью в зависимости от плотности ткани и распознается компьютером, чтобы произвести визуальный образ. МРТ и ПЭТ являются методами визуализации выбросов, использующие магнитную энергию и ядерные частицы, соответственно для получения изображения. МРТ создает сильное магнитное поле, которое индуцирует клетки производить свои собственные радиочастоты, которые используются для создания образа в то время как ПЭТ требует чувствительная камера для обнаружения радиоактивности вводимого с надписью 2-fluorodeoxy-D-глюкозы 7,9,11. Наконец, оптических изображений основано на обнаружении излучения света биолюминесцентного или флуоресцентных зондов репортеров или 9,12.
В этом докладе мы описываем использование флуоресценции, которые предлагаетнесколько преимуществ по сравнению с другими типами методов визуализации. С флуоресцентной томографии, клетки могут быть генетически сконструированы для экспрессии флуоресцентных белков постоянно без необходимости добавления субстрата или лигирования основе зондов, которые являются необходимым условием для биолюминесценции и магнитно-резонансной томографии, соответственно. Флуоресцентные Журналисты также обычно выражают более яркий сигнал таким образом, что позволяет использовать менее чувствительный метод обнаружения 8,12. Кроме того, с визуализации флуоресценции, можно обнаружить опухоли меньшего размера, чем 1 см, что не может быть достигнуто с CT 7-9. Наконец, в отличие от биолюминесценции, сигнал флуоресценции не требует аэробной среды и, следовательно, сигнал не ограничен в гипоксических условиях, которые обычно встречающихся в ядрах крупных опухолей 13.
Тем не менее, как и любой другой технологии, способы визуализации, основанные на флуоресцентный имеют свои недостатки. Одним из которых является неспособность макиNE-генерируется низкие энергетические фотоны проникать на достаточную глубину. Таким образом, чтобы свести к минимуму количество фотонов диффузионных тканей животных следует изображаемых под разными углами. Мы опишем протокол о создании рака яичников IP в голых мышей и подход к ИС мониторинга опухоли, которая обеспечивает визуализаацию животных путем ротации. Ротатор углы мыши к конкретным и повторяемых позиций уменьшением помех ткани, что часто происходит между источником света и детектором. Это оптимизирует визуализацию мелких опухолей, которые в противном случае могут быть упущены.
Protocol
Институциональный комитет по уходу за животными и использование Йельского университета утверждает всю работу в естественных условиях, описанный. Образец коллекция была выполнена с согласия пациента и одобрен Комитетом по правам Следственного Йельского университета медицины по.
1. Подготовка клеток рака яичников человека
- Перед приготовлением клетки убедитесь, что все материалы, необходимые для внутриутробного введения описанного ниже готовы и легко доступны. Вводите клеточной суспензии, как только он будет готов.
- Выращивают меченные флуоресцентными раковые клетки в культуре. Мы используем F2 поколения человеческого CD44 + / MyD88 + эпителиальных клеток рака яичников, который мы ранее продемонстрированной в гавань стволовости свойства, такие как туморогенности, химической устойчивости и высокой емкости для ремонта опухоли 14-19. Эти клетки были получены стабильно выразить флуоресценции mCherry (F2-mCherry, рис. 1) с использованием лентивирус производится из полиэтиленимином(PEI) протокол 20,21.
- На день инъекции, сбора клеток путем обработки трипсином и мыть один раз фосфатным буферным раствором (PBS).
- Определить число клеток и приостановить клетки в 3 х 10 6 клеток / 50 мкл в соответствующих средствах массовой информации роста. Для клеток рака яичников мы используем RPMI 160 с 10% FBS. Держите клетки в инкубаторе до готовности вводят, но не держать дольше, чем 15 минут. Этого достаточно для одной инъекции мыши.
2. Внутриматочное инъекции клеток рака яичников человека в бестимусных голых мышей
Обратите внимание, что следующая процедура требует помощи от второго человека. Кроме того, так как это операция выживания, использовать стерильные хирургические инструменты. Эта процедура выживание операция должна занять примерно от 10 до 15 мин.
- Обезболить мышь, используя 2% изофлуран. 7- до 8-недельного возраста бестимусных голых мышей обычно используется.
- Убедитесь, что животное завершенаЭли анестезируют, зажимая ноги площадку, используя пальцы или пинцет. Животное должно быть абсолютно не реагируют на боль перед началом операции.
- Поместите под наркозом мыши вентральной стороной вверх на стерильной марлевой салфеткой с главой от следователя.
- Применить мазь на глазах с помощью хлопчатобумажного наконечника аппликатора, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
- Сразу вставить голову в системе нос конуса, соединенного с изофлурана испарителя (рис. 2А). Это обеспечивает обезболивание в течение всего хирургического вмешательства.
- Лечить левую (или правую) сторону живота с помощью алкоголя колодки (рис. 2В) с последующим йода затем поместите стерильный хирургический драпировка на месте операции.
- Использование стерильные хирургические ножницы и щипцы сделать 1-2 см разрез кожи на левом нижнем квадранте мыши (рис. 2, в).
- Поднимите мышцы и сделать надрез, чтобы достичь брюшины. <литий> Рассеките косой мышцы, чтобы разоблачить брюшной полости.
- Найти и идентифицировать левый рог матки (рис. 2D).
- Использование стерильного кровоостанавливающего, зажать обе передние и задние стороны рога (рис. 2Е). Поместите переднюю зажим прямо под маточной трубе и зажим задний правый выше шейки матки.
- Есть второй человек привнести клеточной суспензии. Поместите иглу, содержащую клетки, под углом 45 °, перпендикулярной рога (рис. 2F). Очень медленно вводят 50 мкл клеточной суспензии в просвет рога матки.
- Удалите иглу и отпустите переднюю скобу.
- Отпустите задний хомут и заменить рог матки в брюшной полости.
- Закройте брюшины с использованием синтетического рассасывающийся шовный и закрыть оболочку с использованием тканевого адгезива.
- Отключив мышь от носового конуса и поместить обратно в клетку. При необходимости изменить постельные принадлежности для обеспечения Клион клетка после операции. Убедитесь, что все животные бодрствуют и активны, прежде чем покинуть без присмотра.
- Обеспечить ибупрофен в 0,11 мг / мл питьевой воды в течение первых 48 ч после хирургии. Впоследствии, заменить при регулярном питьевой воды.
- Примечание: если бестимусных голых мышей используются и кожа закрыт с помощью тканевой клей вместо швов, что нет необходимости, чтобы отделить мышей после операции. SCID мышей являются более агрессивными и, возможно, должны быть отделены.
- Внимательно следить за участок разреза на возможную инфекцию из-за открытой раны.
3. Обнаружение ранней стадии Intra-перитонеального рака яичников с помощью жить в естественных изображений
Определить наличие интраперитонеального болезни ИС жить в естественных изображений. Мультимодальные животных Вращение системы (МАРС) используется в данном протоколе.
- Доступ к программное обеспечение захвата MARS изнутри программного обеспечения MI. Этот модуль обеспечиваетскоординированное управление МАРС захватить настройки, используя при этом сбор и анализ возможностей системы формирования изображения в. Оптимизация индивидуальных настроек захвата для каждого механизма, используя один-просмотра изображений до разработки протокола вращения в шаге 3.4.
- Входной заданные значения захвата. Для захвата флуоресценции, использовать 10 сек экспозиции, 2 х 2 биннинга, диафрагме 2,8, FOV 120 мм, например: 550 нм, ет: 600 нм настройки захвата фильтр. Для захвата рентгеновского, использовать экспозицию 10 сек, 2 х 2 биннинга, диафрагме 2,8, FOV 120 мм, 35 КВП, 0,4 мм Al параметр захвата фильтр.
- Сохранить параметры в шаге 3.2 в качестве индивидуальных файлов сеансов.
- Создать протокол порядковый вращения, выбрав Create / кнопку Edit Протоколы из окна приобретают системный интерфейс.
- Выберите предварительно сохраненный файл флуоресценции сеанса и сохранение в первом шаге. Далее, выберите соответствующий файл рентгеновский сеанса и сохранить как Шаг второй.
- С Шаг выбран, использовать Set RotationСерия из Перед Image Capture всплывающем меню, чтобы установить нужный начальный угол, круг, и приращение для обеспечения бесшовной визуализации функций. Конкретные значения включают начальный угол -180 градусов, диапазон 375 градусов, и приращение 15 градусов.
- Сохранить протокол и нажмите кнопку Готово, чтобы инициализировать MARS и сопоставить позиции шагового двигателя, соответствующие каждому из приращений угловых.
- Выполните окончательную калибровку, как описано ниже, чтобы выровнять вентральной, спинной и боковой вид для конкретного животного, расположенный в опоре животного с конкретным градусов поворота для использования протокола программного обеспечения.
- Обезболить мыши с использованием смеси медицинского воздуха и 2% изофлуран при скорости потока 2 л / мин.
- Начните выравнивание, нажав кнопку Preview из меню Acquire воспитывать вкладку Rotator. Используйте отражающий свет модальность, а не Многоволновые или X-рау формы, чтобы ускорить процесс.
- Выберите опцию Load мыши и перейдите через серию меню позиционирования.
- Убедитесь, что камерная конец складной головная находится в головная углублении и поместите курсор в лежачем ориентации с ее головой в головная.
- Начните калибровку в положении 0 градусов с брюшной стороне животного вниз. Используйте две ручки на систему вращения позиционировать животное так, что оно кажется по центру в окне предварительного просмотра.
- Повторите процесс, как запрос на -180, - 90, +90, и +180 градусов позиций и нажмите Готово.
- Выполнить ранее сохраненный протокол, нажав кнопку Protocol Выполнить из главного окна приобретают. В ходе выполнения протокола, наблюдать окно состояния обеспечения обновления статуса в реальном времени для текущего Capture, экспозиции Продолжительность и общей шага протокола.
- Соберите отдельные изображения в формате фильма, используяВращение программное обеспечение. Использовать дисплей для регулировки яркости / контраста, прозрачности, а также установить цвет отображения сигнала флуоресценции.
- Экспорт окончательный последовательность изображений в формате файла * .avi для презентации.
4. Администрация 1-го и 2-го Круглого химиотерапии
- После внутрибрюшинно обнаружения опухоли Марсом, определения начальной опухолевой области интереса (ROI) с помощью стандартного двумерного позиционирования. Это выполняется на прозрачной лоток животного, установленного в системе формирования изображения, как описано ниже в разделе 5. После того, как первоначальное ROI определяется, администрирование 4 дозы 12 мг / кг паклитаксела IP каждые три дня. Паклитаксел получают из Hospira Inc. в готовом к использованию композиции с cremaphor в качестве транспортного средства. Ранее мы показали, что эта схема лечения имеет значительную противоопухолевую активность в отношении модели ксенотрансплантата по сравнению с контролем-носителем и индуцирует полной ликвидации обнаруживаемого тumor бремя 20. Тем не менее, из-за природы заболевания, опухоли IP повторяются через несколько дней после обработки заканчивается 20.
- Монитор ответ на лечение по визуализации каждые 3 дня с помощью стандартного двумерного позиционирования.
- После четвертой дозы паклитаксела, классифицировать мышей как имеющий полный ответ (ROI менее 2000), частичный ответ (до 35% снижение от исходной ROI, полученного на стадии 4.1, стабильное заболевание (до 50% больше, чем начальный ROI ), или прогрессирование с лечением (более 50% по сравнению с первоначальной ROI) на основе флуоресцентного сигнала, наблюдаемой.
- Для мышей с полным ответом, контролировать рецидив по визуализации каждые 3 дня. После того, как рецидив наблюдается (ROI = к первоначальным ROI в шаге 4.1), повторно инициировать второй раунд паклитаксела, как описано в 4.1.
- У мышей с частичной заболевания, стабилизация заболевания, или те, которые прогрессировали с лечения, повторное инициировать второй раунд Паклитаксел 3 дня после 4-го дозыпаклитаксела. Аналогичным образом, изображение них раз в три дня.
5. Мониторинг ответа на лечение с помощью стандартного двумерного позиционирования
- Обезболить мышей, чтобы быть отображены с использованием смеси медицинского воздуха и 2% изофлуран при скорости потока 2 л / мин.
- Поместите голову из под наркозом мышей в отдельных nosecones в прозрачном лотке животных в пределах изображения камеры (рис. 3).
- Входной заданные параметры экспозиции для флуоресценции (10 сек экспозиции, 2 х 2 биннинга, е-стоп 2.8, FOV 120 мм, например: 550 нм, Em: 600 нм) и рентген (экспозиция 20 сек, 2 х 2 биннинга, е-стоп 2.8, FOV 120 мм, 35 КВП, 0,4 мм Al фильтр).
- Нажмите Expose захватить оба изображения в последовательности.
- Откройте изображения в программном обеспечении Bruker М.И. для визуального осмотра и области процентной анализа.
6. Наложение изображений и анализ
Чтобы обеспечить корректное сравнение для бого визуального и количественного анализа времени процесса последовательности Конечно изображений все изображения и фона изображения аналогично.
- Откройте как изображение переднего плана (т.е. флуоресценции) и фоновый изображений в программном обеспечении и выберите функцию плитка из меню Window в верхней (рис. 4, а).
- Чтобы обработать изображение переднего плана; откройте вкладку Image Display на верхней панели (рис. 4А, красная стрелка) и установить мин / макс значения до 260 и 5000, соответственно (рис. 4А, синяя стрелка)
Примечание: Диапазон Image Display отличается от исследования к исследованию в зависимости от интенсивности флуоресценции сигналов, захваченных в изображениях. Изображения должны быть противопоставлены с мин / макс, который покажет опухолевые массы, еще не показать фон от автофлуоресценции животного. - Следующая открытая Авто-трансформирования Tab от навигационной панели слева (рис. 4В, красная стрелка) и выберите Set New ROI из меню (рис. 4С, красныйrrow). Настройте параметры для использования алгоритма порог, при 630 уровней яркости и снимите Ограничить максимальный размер для обеспечения всех потенциальных ROI, учитывались (рис. 4в).
Примечание: Настройки порогов может отличаться от исследования к исследованию в зависимости от интенсивности флуоресценции сигналов, захваченных в изображениях. Изображения порогами на сигнал от опухолевых масс количественного еще не измерять сигнал от фона от автофлуоресценции животного. - Изнутри Display Окне изображения выберите функцию Mask. Теперь будет отображаться только площадь, соответствующие пикселям, которые имеют значения, равные или превышающие пороговое значение 630 уровней яркости.
- Для просмотра количественные результаты выберите вкладку Analysis от верхней строке меню и выберите вкладку Вид (рис. 4, красные стрелки).
- В меню Display выберите серийный номер, сумма, среднее значение, и Площадь флажки и нажмите кнопку ОК.
- Сохранить изображение таким образом, значения могут быть экспортирован вместе, когда все флуоресцентные изображения обрабатываются.
- Далее, выделите рентгеновское изображение и снова открыть дисплей изображений с верхней строке меню. Установите значения для мин, макс и гамма, чтобы дать лучшее визуальное представление скелета мыши.
Примечание: Поскольку ни один количественный не выполняется на рентгеновских снимках каждый человек рентгеновское изображение с временной последовательности могут быть обработаны (т.е. мин, макс и значения гаммы) для получения наилучшего глядя представление этого набора данных. - Опять же с рентгеновского изображения подчеркнул флажок Overlay и выберите соответствующее имя файла флуоресценции изображения из выпадающего меню (рис. 4Е).
- Чтобы извлечь накладывается выход, выберите вкладку Аннотации в меню навигации (рис. 4В, синяя стрелка) слева. Выберите соответствующие вкладки, чтобы добавить дополнительные данные или текст и, наконец, добавить масштабную интенсивность бар, так что данные интенсивность флуоресценции можно быстро определить из имвозраст.
- После аннотации будут завершены выделить все объекты на странице Аннотации и выберите Копировать из меню Правка в верхней и вставить данные Облицовочные изображение в соответствующем файле (например, Word, PowerPoint, и / или Photoshop) для отображения.
- Повторите шаги 6.1- 6.11 для всех пар флуоресценции и рентгеновских снимков в последовательности. Обязательно безопасных всех изображений до их закрытия.
- Для окончательного количественного открыть все флуоресцентные изображения в то же время и выбрать Плитка из меню Window вдоль верхней.
- Далее выберите Экспорт все открытые документы, чтобы просмотреть данные.
Примечание: При отсутствии программы Excel, снимите вкладку. MI будет генерировать табуляцией текстовый (т.е. .txt) файл, который может быть передан в соответствующий компьютер для дальнейшего анализа.
Representative Results
Неинвазивная живой визуализации позволяет контролировать прогрессирования опухоли ф от тех же мышей через время. Внутриматочное инъекция mCherry-меченых F2 клеток рака яичников с использованием описанного протокола генерирует видимые опухоли ИС на 5-й день и карциноматоза в день 32 (рис. 5). Рисунок 6 показывает корреляцию полученных изображений с карциноматоза наблюдаемое после жертвуя мышей ,
Изображений с помощью MARS позволяет обнаруживать IP опухолей, которые в противном случае будут пропущенных если изображение получают только один одной плоскости. Рисунок 7 (верхнюю панель) показывает, что даже в контрольных мышей с тяжелым бременем опухоли, размер опухоли может быть недооценена в зависимости от угла Изображение было получено с. Способность гарантировать, что масса опухоли не пропустил или недооценивать еще более важно, при заключении 1-го круглого химиотерапии, когда животные отнесены либо полного реагируютэ-э, частичная ответчик, или не отвечающий (рис. 7 средняя панель). Точно так же, во время терапии он имеет первостепенное значение для определения очень малых текущие опухоли правильно дней назначить возникновения рецидива, который определяет без прогрессирования интервал (рис. 7 средняя панель).
Количественная оценка опухолевой оптимизирован путем ротации животных. Вращение животного углами, что позволит свести к минимуму возбуждение глубины и излучение света проходит через позволит наиболее точного захвата фотонов флуоресценции, что свидетельствует о количестве опухолевых клеток и, таким образом бремя опухоли. Следовательно, количественное оптимизирован для конкретных опухолей у животного в зависимости от ее положения в последовательности вращения.
Представляя образы наборов данных поворота, важно назначить изображения в мин / макс диапазон контрастности изображения, которые будут эффективно отображать все массы опухоли, позволяя при этом для Visu аль разграничение отдельных опухолевых масс. Для этого исследования, идеальный диапазон контраста было установлено, что, как минимум, 50 отсчетов, и не более 1200 отсчетов. Эти значения можно рассматривать в качестве ориентира для других исследований, однако, оптимальные интервалы контрастные будет отличаться от исследования к исследованию в зависимости от уровня опухоли бремени, люминесцентных уровней экспрессии пептида в клетках, конфигурации системы визуализации и настройки захвата.
Рисунок 1: F2 клеток рака яичников стабильно выразить флуоресценции mCherry. () Фазового изображения; (Б) изображение флуоресценции; (С) наложение А и В. Следует отметить, что 100% клеток экспрессируют флуоресценции репортера.
s.jpg "ширина =" 600 "/>
На рисунке 2: Внутриматочное инъекции клеток рака яичников. (A) анестезия постоянно вводить через носовой конус; (BE) кожи вырезается, чтобы найти и зажать рог матки; (F) раковые клетки вводят медленно в просвет матки.
На рисунке 3: (А) 2D изображений с контролируемой температурой и близко схема вентилируемой прозрачной лоток животных в камере формирования изображения; (B, C) Лоток оснащен головных частей для доставки анестезии и может вместить до пяти мышей.
<сильные> Рисунок 4: представитель оконные панели, сделанные из программного обеспечения для анализа, чтобы помочь в анализе данных. Пожалуйста, см текст для объяснения.
Рисунок 5: Обнаружение mCherry флуоресценции со-локализуется с рентген в продольном последовательности изображений. Три мышей с опухолью внутрибрюшинно следуют во времени, чтобы оценить IP опухолевой прогрессии. Следует отметить, что прогрессирование опухоли может изменяться. Рисунок является представителем образ 3 мышей с разными темпами прогрессирования опухоли и, следовательно, различной опухолевой во времени.
Рисунок 6: Корреляция между опухолевой IP (верхняя панель) и флуоресценции / рентгеновской наложения IMAGE (нижняя панель). О 32 дней после инъекции из F2-mCherry клеток рака яичников, 2D-изображения производится и мышей жертву соотнести фактические опухолевой с полученного изображения. Красные стрелки указывают на опухолевой.
Рисунок 7: Поворот наборы данных, позволяющие разными углами визуализация и обнаружение опухолей в контроле (верхняя панель), Паклитаксел обработанную (средняя панель), и регулярную мышей (нижняя панель). Рисунок показывает изображение одной мыши на панели, как он повернут с помощью системы MARS. Обратите внимание, что даже в контрольных мышей с тяжелым бременем опухоли, размер опухоли может быть недооценена в зависимости от угла образ был взят из.
Discussion
Мы опишем протокол для установления IP человеческого рака яичников животную модель, которая имитирует клиническую профиль наблюдаемый у пациентов. Кроме того, мы опишем использование в ротации устройства животного, которая учитывала бы ограничение чувствительности 2D изображений. Взятые вместе, эти методы могут служить в качестве платформы, чтобы открыть новые соединения, которые могут ориентироваться химиорезистентных рецидив рака яичников. Кроме того, такая модель может быть использована, чтобы понять биологию рецидива рака и прогрессии.
Благодаря своей забрюшинного расположения, ранней стадии IP яичников ксенотрансплантаты рака почти невозможно обнаружить физически исследовать мышь. В большинстве случаев, когда болезнь можно пропальпировать, бремя опухоли уже значительное, и поэтому ограничивает оценку эффективности лечения. Использование флуоресцентно меченых клеток позволяет оценивать создание опухоли внутрибрюшинно в реальном времени и, следовательно, определение оптимального времени, чтобы начать тreatment. Аналогичным образом, меченных флуоресцентными ксенотрансплантатов позволить мониторинг реакции на лечение. Следует отметить, однако, что из IP опухоли глубже, чем на 1 см, как правило, не обнаруживается независимо от репортерной системы.
Использование человеческих рака яичников стволовых клеток 14,15,17,22 генерирует ксенотрансплантаты, которые имитируют клинического профиля наблюдается у пациентов. В качестве первичного заболевания, модель реагирует на паклитаксела, но прекращение лечения в конечном итоге приводит к химиорезистентных рецидива заболевания. Представляя клетки через рога матки при плотности, указанных в разделе протокола, как правило, приводит к опухоли яичников в течение 10 дней с несколько брюшины имплантатов, и, следовательно, имитирует ранней стадии заболевания. Использование флуоресцентно меченых клеток позволяет нам оценить создание опухоли интеллектуальной собственности в режиме реального времени и, следовательно, определение оптимального времени для начала лечения. Аналогичным образом, меченных флуоресцентными ксенотрансплантатов позволить мониторинга Oе ответ на лечение. Если другие типы линий раковых клеток используются, яичников или иным образом, не исключено, что этот профиль может быть не наблюдалось. Когда SKOV3 используется, например, было сообщено, что начальные опухоли IP уже устойчивы 23. Тем не менее, если помечен репортерной такие как флуоресценции, IP, болезнь может следовать в режиме реального времени.
Если используется другой флуоресцентный репортер, важно, чтобы выполнить начальное изображений с контролем (без опухоли) животного. Это позволит оптимизации протокола изображения для достижения наилучшего фона соотношение для сигнала. По нашему опыту, голые мыши, как правило, имеют высокий фон, когда изображается с помощью настроек приобретение GFP.
Важно, что клетки вводят внутриматочное которые в суспензии отдельных чтобы избежать создание опухолей в матке. Важно также, чтобы не поцарапать матки эпителиальный слой, который также облегчает приживление раковой клеткиы в матке таким образом производя внутриутробной опухоль, а не одно заболевание IP. Кроме того, в процессе анализа данных, важно, чтобы установить значение гаммы до 1. Это гарантирует, что интенсивность изображений является линейным и дает сравнение между изображениями.
Во время приобретения MARS изображений, важно, чтобы гарантировать, что камерная конец складной головная часть находится в углублении головная часть. Головная часть служит точкой контакта для мыши и, следовательно, требуется для получения точно откалиброванных углов. Для более длинных протоколов изображений (т.е. более 1 часа), вводят 100 мкл стерильного физиологического раствора подкожно, чтобы помочь предотвратить обезвоживание. Температура тела животного должны быть сохранены с помощью теплого воздуха протекает через систему при температуре приблизительно 37 ° С. Ограничением системы MARS является то, что только одно животное могут быть отображены одновременно с общим временем выполнения от около 1 часа на одно животное.
В заключение мы опишем ESTablishment животной модели, которые тесно имитирует рака яичников, начальную и рецидив заболевания. Эта модель может быть использована для оценки эффективности новых диагностических или терапевтических методов.
Disclosures
Публикация сборы для этой статьи были частично спонсируется Bruker Corporation.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано NIH грантов RO1CA118678 и RO1CA127913, по пески Family Foundation, и Открытия вылечить программу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
