卵巣がん再発を検出し、モニターするための非侵襲的イメージングのためのマウスモデル

Abstract

上皮性卵巣癌は、米国で最も致命的な婦人科悪性腫瘍である。患者は当初、外科減量および白金及びタキサン化合物からなる多剤併用化学療法からなる現在の標準治療に反応するが、患者のほぼ90％が数年以内に再発する。これらの患者において化学療法抵抗性の疾患の発症は、現在利用可能な化学療法剤の有効性を制限し、したがって、高い死亡率に寄与する。再発性疾患を標的とすることができる新たな治療選択肢を発見するために、密接に再発卵巣癌患者の臨床プロフィールを模倣する適切な動物モデルが必要である。腹腔内（ip）に疾患を監視する課題は、腹腔モデルの使用を制限し、したがって、ほとんどの異種移植片を皮下に確立されている。私たちは、検出およびIP腫瘍塊の解剖学的位置を可能にする高感度光学イメージングプラットフォームを開発しました。プラットフォームは、Uが含まれて2次元X線の同時登録と組み合わせて分子シグナルの解剖学的位置を提供することができる近赤外、可視光領域から伸びる光学レポーターの本質。検出は、かなり単一の向きで表示されていない腫瘍の同定を可能にする、360度の画像化のための複数の角度位置に動物を駆動回転システムを使用することによって改善される。このプラットフォームは、非侵襲的にモニタ腫瘍増殖にユニークなモデルを提供し、再発性の卵巣癌の予防または治療のための新規治療法の有効性を評価する。

Introduction

動物モデルは、ライフサイエンス研究における不可欠なツールです。癌では特に、動物実験から得られたデータは、ヒト^1-3新規の診断または治療用途のテストを開始するために必要な情報を提供する。それは、動物を犠牲にすることなく、全身腫瘍組織量を測定し、治療効果を評価するための容易な手段を提供するように、固形癌の動物モデルは、古典的に皮下に確立されている。実際に、腹腔内（ip）にモデル動物は、腫瘍増殖の変化を検出し、測定するために犠牲にされることを必要とする。ただし、IP癌、卵巣癌のために、直交異方性のモデルは、その適切な環境^4-6の病気を研究する利点を提供する。このようなモデルは、抗腫瘍活性の評価に有用であるために、非侵襲的画像化法は、生きたマウスにおける腹腔内腫瘍量の定量化を可能にするように開発される必要がある。

における大きな課題腹腔動物モデルの使用は、正確に身体検査によって腫瘍負荷を定量することが困難である。腹腔腫瘍の正確な定量は、通常は解剖のために犠牲にしなければマウスを必要とします。このアプローチは、異なる時点で屠殺される動物の数が多い、の使用を必要とする。コストに加えて、各動物内の固有の変動に起因する高いデータ変動性を導入する。 インビボ光学イメージングにおける非侵襲生きたマウスでip腫瘍負荷を監視するためのより多くのフィッティングアプローチを提供します。

いくつかの非侵襲的イメージング法は、現在、腫瘍増殖および治療応答をモニターするための前臨床研究で使用されている。これらは、蛍光および生物発光^7-12としてコンピュータ断層撮影（CT）、超音波（US）、磁気共鳴画像法（MRI）、陽電子放出断層撮影（PET）、および光学イメージングを含む。 CTは、X線及びcomputを組み合わせた透過イメージングプロセスであるER技術。それは、異なる速度で身体を通過する高エネルギー光子の検出ビームの断面画像を生成する。 USは高周波組織密度に応じて異なる速度で反射され、可視画像を生成するためにコンピュータによって認識される音波を生成する身体に聞こえる送信し、反射画像の種類である。 MRI及びPET画像を生成するために、それぞれ、磁気エネルギー、核粒子を用いる発光イメージングモダリティである。 PETは投与標識2-fluorodeoxy -D-グルコース^7,9,11の放射能を検出するために感度カメラを必要とするMRI画像を生成するために使用される独自の無線周波数を生成するために細胞を誘導する強力な磁場を生成する。最後に、光学イメージングは、生物発光または蛍光レポーターまたはプローブ^9,12の放出光の検出に基づいている。

本稿では、その申し出、蛍光の使用を記載イメージングモダリティの他のタイプよりいくつかの利点。蛍光イメージングでは、細胞は、遺伝的に、それぞれ基板または生物発光および磁気共鳴イメージングのための前提となるライゲーションベースのプローブの添加を必要とせずに常に蛍光タンパク質を発現するように操作することができる。蛍光レポーターは、典型的には、このようにして感度が低い検出方法^8,12の使用を可能に明るいシグナルを発現する。また、蛍光イメージングでは、CT ^7-9で達成可能ではない、1センチより小さい腫瘍を検出することができる。最後に、生物発光とは対照的に、蛍光シグナルは、好気的環境を必要とせず、したがって、信号は、通常、大きな腫瘍¹³のコアで発生している低酸素環境に限定されるものではない。

しかし、他の技術として、蛍光ベースのイメージング法は、その欠点を有している。の一つは、町のできないことである十分な深さまで浸透するね生成された低エネルギーの光子。したがって、拡散組織光子の量を最小限にする動物は、異なる角度で撮像されるべきである。私たちは、ヌードマウスにおける腹腔卵巣癌と回転によって動物全体像を提供するIP腫瘍監視のためのアプローチを確立するためのプロトコルを記述します。回転子は、多くの場合、光源と検出器との間に生じる組織の干渉を減少させる特異的かつ再現可能な位置にマウス角度。これはそうでなければ見逃しても小さな腫瘍の可視化を最適化する。

Protocol

エール大学施設内動物管理使用委員会は説明した全てのin vivoでの作業を承認する。サンプル収集は、患者の同意を得て実施し、エール大学医学部の人間の調査委員会によって承認された。

ヒト卵巣癌細胞の調製

1. 細胞を調製する前に、後述の子宮内注入のために必要なすべての材料の準備ができ、容易にアクセス可能であることを確認してください。それは準備ができているとすぐに細胞懸濁液を注入する。
   1. 培養物中の蛍光標識癌細胞を成長させる。我々は以前にそのような腫瘍形成、化学療法抵抗性及び腫瘍修理^14-19のための高容量などの幹細胞性の性質を保有することが実証ヒトCD44 + / + MyD88の上皮性卵巣癌細胞のF2世代を使用しています。これらの細胞は、安定にmCherryを蛍光発現するように生成された（F2-mCherryを、 図1）ポリエチレンから製造されたレンチウイルスを用いて（PEI）プロトコル^20,21。
   2. 注射の日に、トリプシン処理により細胞を回収し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一回洗浄する。
   3. 細胞数を決定し、3×10 ⁶細胞/適切な増殖培地中で50ウェルで細胞を懸濁。我々は、10％FBSを含むRPMI 160使用卵巣癌細胞である。注入するために、15分より長く保管しないで準備ができるまでインキュベータで細胞を保管してください。これは、1つのマウスの注射のために十分である。

無胸腺ヌードマウスにおけるヒト卵巣癌細胞の2.子宮内注入

次の手順では、二人目からの支援が必要であることに注意してください。これは生存の手術であるため、また、無菌の手術器具を使用しています。この生存手術手順は、約10〜15分を取るべきである。

1. 2％イソフルランを使用して、マウスを麻酔。 7〜8週齢の無胸腺ヌードマウスに典型的に用いられる。
2. 動物がcompletのあることを確認しますエリー指やピンセットを使って足のパッドをつまんで麻酔。動物は、手術を開始する前に、痛みを完全に非応答でなければなりません。
3. 離れ調査官からヘッドを備えた滅菌ガーゼパッド上で麻酔したマウス腹側を上に置きます。
4. 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、綿先端アプリケーターで目に軟膏を適用します。
5. すぐにイソフルラン気化器（ 図2A）に接続されたノーズコーンシステムで頭部を挿入します。これは、外科的処置を通して麻酔を提供します。
6. その後手術部位の上に滅菌外科用ドレープを配置し、ヨウ素が続くアルコールパッド（ 図2B）を使用して、左を消毒（または右）腹部の側面。
7. 滅菌外科用ハサミとピンセットを使用して、マウスの左下の象限（ 図2C）に1〜2センチメートル皮膚切開を行う。
8. 筋肉を持ち上げて、腹膜に到達するために切開する。
<李>腹腔を露出させる斜筋を解剖。
9. 見つけて左子宮角（ 図2D）を識別。
10. 無菌の止血鉗子を使用して、ホーン（ 図2E）の両方の前部と後部の側面をクランプ。右卵管以下の前部クランプと右頸部上記後部クランプを置きます。
11. 二人は細​​胞懸濁液を注入する必要があります。ホーン（ 図2F）に垂直45°の角度で、細胞を含有する針を配置します。非常にゆっくりと子宮角の内腔に、細胞懸濁液50μlを注入する。
12. 針を外し、前部クランプを解除する。
13. 後部クランプを解除し、腹腔内に子宮角を交換してください。
14. 合成吸収性縫合糸を使用して腹膜を閉じ、組織接着剤を用いて皮膚を閉じます。
15. ノーズコーンからマウスを外し、ケージに戻って置きます。必要に応じて、クレアを確保するために寝具に変更手術後のn個のケージ。すべての動物から離れる前に目を覚まし、アクティブであることを確認してください。
16. 最初の48時間後に手術のために飲料水の0.11 mg / mlのでイブプロフェンを提供する。その後、定期的な飲料水と交換してください。
    1. 注：無胸腺ヌードマウスが使用され、皮膚の代わりに縫合糸の組織接着剤を使用して閉じている場合、それは手術後のマウスを分離する必要がないこと。 SCIDマウスは、より攻撃的であり、分離されなければならない。
17. 密接に傷口を開くことにより、感染の可能性のために切開部位を監視します。

ライブin vivoイメージングによる早期腹腔内卵巣癌の3検出

in vivoイメージングでライブによる腹腔内のIP疾患の存在を決定します。マルチモーダル動物ローテーションシステム（MARS）は、このプロトコルで使用されている。

1. MIソフトウェア内からMARSキャプチャソフトウェアにアクセスします。このモジュールは、提供イメージング·システムのキャプチャと分析機能を活用しながら、MARSの協調制御設定をキャプチャします。ステップ3.4で回転プロトコルを開発する前に、単一のビューイメージングを使用して、各モダリティのための個々のキャプチャ設定を最適化します。
2. インプットキャプチャの値を所定の。 550nmで、EM：600nmのフィルターキャプチャ設定の蛍光捕捉のために、10秒の曝露、2×2ビニングを使用し、2.8、FOV 120ミリメートル、元のFストップ。 X線撮影の場合は、10秒の露出を使用して、2×2ビニングは、2.8、FOV 120ミリメートル、35のkVp、0.4ミリメートルアルフィルタキャプチャの設定をfはストップ。
3. 個々のセッションファイルとしてステップ3.2でパラメータを保存します。
4. システムインタフェースアクイジション·ウィンドウから作成/編集プロトコル]ボタンを選択することにより、回転シーケンスプロトコルを作成します。
5. 以前に保存した蛍光セッションファイルを選択し、ステップ1として保存します。次に、対応するX線セッションファイルを選択して、ステップ2として保存します。
6. ステップ1選択した状態で、 設定された回転を使う特徴のシームレスな可視化のために確実にするために、所望の開始角度、範囲、および増分を設定する前に、イメージキャプチャポップアップメニューからシリーズ。具体的な値は、-180度の開始角度375度の範囲、15度の増分を含む。
7. プロトコルを保存して、MARSを初期化し、角度増分のそれぞれに対応するステッピングモータ位置をマッピングするために[完了 ]ボタンをクリックします。
8. ソフトウェアプロトコルによって使用される特定の回転度を有する動物のサポートに位置決め特定の動物のための腹側、背側及び側面図を整列させるために下記のように最終的なキャリブレーションを行う。
9. 2 L / minの流量で医療空気との混合物、2％イソフルランを用いてマウスを麻酔。
10. ローテータ]タブを開き[取得]メニュー内から[プレビュー ] ボタンを選択することにより、アライメントを開始します。多波長またはX-RAのではなく、反射光のモダリティを使用して、プロセスを促進するには、Yモダリティ。
11. ロードマウスオプションを選択して、位置決め一連のメニューを進む。
12. 折りたたみ可能なノーズコーンのチューブ入り端はノーズコーン凹部になっていることを確認し、ノーズコーンにその頭に発生しやすい向きにマウスを置く。
13. 下向きに動物の腹側で0度の位置でのキャリブレーションを開始します。それはプレビューウィンドウの中央に表示されるように動物を配置する回転システム上の2つのノブを使用してください。
14. -180の入力を要求されるように、プロセスを繰り返します- 90、90、および180度の位置と[完了 ] をクリックします。
15. メインアクイジション·ウィンドウから実行プロトコル ] ボタンをクリックして、以前に保存したプロトコルを実行します。プロトコルの実行中に、現在のキャプチャ、曝露期間、および全体的なプロトコルのステップのためのリアルタイムのステータスアップデートを提供するステータスウィンドウを観察します。
16. 使ってムービー形式に個々の画像を組み立てる回転ソフトウェア。明るさ/コントラスト、透明度を調整するために、蛍光シグナルの表示色を設定するために表示コントロールを使用してください。
17. プレゼンテーションのための* .AVIファイル形式での画像の最終シーケンスを書き出す。

1 ^番目と2 ^番目のラウンド化学療法4.管理

1. MARSによるIP腫瘍の検出に続いて、標準的な2次元測位を使用して関心領域（ROI）の初期腫瘍負荷の領域を決定。セクション5で以下に説明するように、初期ROIが決定されると、この撮像システムに嵌透明動物トレイ上で実行される、3日ごとに12mg / kgのパクリタキセルの腹腔内の4用量を投与。パクリタキセルは、車両などのクレマホールとすぐに使える製剤中ホスピーラ社から得られる。我々は以前、この治療計画は、ビヒクル対照と比較して、異種移植モデルに対して有意な抗腫瘍活性を有し、検出可能な、tの完全な根絶を誘導することを実証したumor負担^20。しかしながら、疾患の性質に、腹腔の腫瘍は治療の^20を終了^し 、数日後に再発する。
2. 標準的な2次元測位を使用して3日ごとに画像化することによって、治療への応答を監視します。
3. パクリタキセルの4回目の投与後に、（部分寛解、完全寛解率（ROI 2,000未満）を有すると最大35％のステップ4.1から得られた初期のROIから減少し、安定した疾患（初期ROIから最大50％の増加をマウスを分類）、または観察された蛍光信号に基づいて処理（初期ROIより50％以上増加）と進行。
4. 完全寛解でのマウスの場合は、3日ごとに撮像することで再発を監視します。再発が（ROI =ステップ4.1でROIを初期に）が観察されると4.1で説明したように、パクリタキセルの第二ラウンドを再開。
5. 部分的な疾患、疾患の安定、または治療を進めているものを用いたマウスでは、再開始の3日4回^目の投与後のパクリタキセルの第二ラウンドパクリタキセルの。同様に、画像これらの3日ごとに。

標準2次元測位を用いた治療5.監視応答

1. 2 L / minの流量で医療空気との混合物、2％イソフルランを使用して画像化するマウスを麻酔。
2. イメージング室（ 図3）内の透明な動物トレイに個々のノーズコーンに麻酔したマウスの頭部を置きます。
3. 入力所定の蛍光の露光パラメータ（10秒露光、2×2ビニングで、fストップ2.8、FOV 120ミリメートル、例：550 nmでのem：600 nm）であり、X線（20秒露光、2×2ビニング2.8、FOV 120ミリメートル、35のkVp、0.4ミリメートルのAlフィルタ）Fストップ。
4. 順番に両方の画像をキャプチャするために公開をクリックしてください。
5. 関心分析の目視検査及び地域のブルカーMIソフトウェアで画像を開きます。

6.イメージオーバーレイと分析

boのための有効な比較を提供するために同様に経時的画像シーケンス処理の視覚的および定量分析番目のすべての前景画像と背景画像。

1. ソフトウェアで前景画像（ すなわち蛍光）と、背景画像の両方を開き、一番上の（ 図4A）で、[ウィンドウ]メニューからタイル機能を選択します。
2. 前景画像を処理すること。トップバー（ 図4A、赤い矢印）上の画像表示]タブを開いて、それぞれ260および5000に最小/最大値を設定した（ 図4A、青色の矢印）
   注：画像表示範囲が画像に取り込まれた蛍光シグナル強度に応じて、勉強する研究とは異なります。画像は、腫瘍塊を示し、まだ動物の自己蛍光から背景を表示しません最小値/最大値と対比されるべきである。
3. 左側のナビゲーションパネル（ 図4B、赤い矢印）から、次のオープン自動ROIのタブとメニューから新規のROIの設定を選択します（ 図4C、赤ARROW）。 630階調での閾値アルゴリズムを使用するように設定を調整し、のが記録されているすべての潜在的なROI（ 図4C）を確保するサイズマックスを制限解除します。
   注：しきい値の設定は、画像に取り込まれた蛍光シグナル強度に応じて、研究に研究と異なる場合があります。画像はまだ腫瘍塊からの信号を定量動物の自己蛍光からのバックグラウンドからの信号を測定しないように閾値処理。
4. 画像表示ウインドウ内からマスク機能を選択します。今に等しいか、または630階調の閾値を超える値を持つ画素に対応する領域のみが表示されます。
5. 定量的な結果は、上部のメニューバーを選択し、表示タブ（ 図4D、赤矢印）から[分析]タブを選択し表示する。
6. 表示メニューからシリアル番号、合計、平均、およびエリアのチェックボックスをオンにし、[OK]をクリックします。
7. 値は元できるように画像を保存するに沿って移植され、一度全ての蛍光画像が処理されます。
8. 次に、X線画像をハイライト表示して、再度、上部のメニューバーから画像表示を開きます。マウス骨格の最良の視覚的な表現を与えるために最小、最大、およびガンマの値を設定します。
   注：定量をX線画像上で実行されないので、時系列の各個別X線画像を処理することができる（ すなわち、最小、最大、およびガンマ値）は、データセットの最良探し表現を生成する。
9. 再びX線画像とオーバーレイのチェックボックスを選択して、メニュー（ 図4E）ドロップダウンメニューから対応する蛍光画像ファイル名を選択し強調した。
10. オーバーレイ出力を抽出するには、左側のナビゲーションメニュー（ 図4B、青色の矢印）から[注釈]タブを選択します。蛍光強度データを迅速イムから決定することができるので、追加のデータまたはテキストを追加し、最終的に強度スケールバーを追加するために、適切なタブを選択する時代。
11. 注釈は、ハイライト表示のためのすべての注釈ページ上のオブジェクトや上部の[編集]メニューから[コピー]を選択し、適切なファイルにオーバーレイされた画像データを貼り付ける（ 例えば WordやPowerPoint、および/ ​​またはPhotoshop）を完了すると。
12. 手順を繰り返し6.1-シーケンス内の蛍光X線画像のすべてのペアのための6.11。それらを閉じる前にすべてのイメージに安全に確認してください。
13. 最終的な定量化のために同時にすべての蛍光画像を開き、上部にある[ウィンドウ]メニューからタイルを選択します。
14. 次のデータを表示するには、すべてエクスポートオープンドキュメントを選択します。
    注：Excelプログラムが存在しない場合には、タブの選択を解除します。 MIは、さらなる分析のために適切なコンピュータに転送することができ、タブ区切りのテキスト（ すなわち .txt）ファイルを生成します。

Representative Results

非侵襲的なライブイメージングは​​、時間を通して同じマウスから腹腔内腫瘍の進行の監視を可能にする。記載されたプロトコルを使用して、mCherryを標識F2卵巣癌細胞の子宮内注射（ 図5）32日で5日目および癌腫可視腹腔内腫瘍を生成する。 図6は、マウスを屠殺した後に観察された癌腫を有する得られた画像の相関を示す。

MARSを用いた撮像画像がただ1つの面から取得された場合にそうでなければ失われる腹腔内腫瘍の検出を可能にする。 図7（上パネル）であっても顕著な腫瘍負荷の対照マウスにおいて、腫瘍サイズは、角度によって過小評価され得ることを示す画像はから採取した。動物が完全な応答のいずれかに分類された場合、腫瘍の塊が逃したか過小評価されていないことを確認する機能は、 ^第 1ラウンドの化学療法の終了時にさらに重要です小胞体、部分的応答者又は非応答者（ 図7中央パネル）。同様に、維持療法の間に、適切に無進行間隔（ 図7中央のパネル）を定義し、再発までの日数を指定するために、非常に小さな再発性腫瘍を検出するために最も重要である。

腫瘍負荷の定量的評価は、動物の回転により最適化されています。深励起および発光光が通過移動する最小化する角度に対する動物の回転は、腫瘍細胞の量、したがって腫瘍量の指標である蛍光の光子の最も正確なキャプチャが可能になる。したがって、定量は回転シーケンス内の位置に応じて、動物における特定の腫瘍のために最適化されています。

回転データセットの画像を提示するには、映像設備を可能にしながら、効果的にすべての腫瘍塊を表示する最小/最大画像コントラスト範囲を画像に割り当てることが重要である個々の腫瘍塊のアル描写。この研究のために、理想的なコントラストの範囲が50カウントの最小値1200カウントの最大値であることが見出された。これらの値は、他の研究のための指針として見ることができるが、最適なコントラストの範囲は、腫瘍負荷レベルに応じて検討する研究とは異なり、細胞内の蛍光ペプチド発現レベルは、イメージング·システムの構成、および設定をキャプチャする。

図1：F2卵巣癌細胞を安定mCherryを蛍光を発現する。 （A）位相像。 （B）蛍光画像。 （C）細胞の100％は、蛍光レポーターを発現するAとB注オーバーレイ。

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図2：卵巣癌細胞の子宮内注射。 （A）麻酔を継続的にノーズコーンを介して投与される。肌が見つけて子宮角をクランプする切開し（BE）; （F）は、癌細胞は、子宮の内腔にゆっくりと注入される。

図3：温度制御と密接な回路が撮像チャンバー内の透明な動物トレイを換気さと、（A）2次元イメージング。 （B、C）トレイは麻酔を配信するために、ノーズコーンを装着されており、5匹まで保持できる。

<強い>図4：解析ソフトウェアから採取した代表的な窓パネルは、データ分析を支援する。説明のためのテキストを参照してください。

図5：mCherryを蛍光の検出は、長手方向の撮像シーケンスにおいてX線と共局在。腹腔内腫瘍を有する3つのマウスは、腹腔腫瘍の進行を評価するために、時間を通じて続いている。腫瘍の進行は変更になる場合がありますので注意してください。図は、異なる腫瘍進行の速度、したがって、時間を通じて腫瘍負荷を変化させた3匹のマウスの代表画像です。

図6：腹腔内腫瘍負荷（上のパネル）および蛍光/ X線オーバーレイIMAとの相関GE（下のパネル）。約32日後には、2D-撮像が行われ、マウスが取得した画像と実際の腫瘍負荷を相関させるために犠牲にされ、F2-mCherryを卵巣癌細胞の注射後。赤い矢印は、腫瘍量を指す。

図7：マルチアングルイメージングと腫瘍の検出制御（上のパネル）、パクリタキセルで処置した（中央パネル）、および再発マウス（下のパネル）を回転許容データセット。図は、それがMARSシステムを使用して回転されるように、パネルごとに単一のマウスの画像を示す。でも有意な腫瘍負荷の対照マウスにおいて、腫瘍の大きさを画像から撮影された角度に応じて、過小評価されることに注意してください。

Discussion

我々は、患者において観察された臨床プロファイルを模倣腹腔ヒト卵巣癌の動物モデルを確立するためのプロトコルを記述している。さらに、我々は、2D画像の感度限界に対処する動物回転装置の使用を記載している。まとめると、これらの技術は、化学療法抵抗性の再発卵巣癌を標的とすることができる新規化合物を発見するためのプラットフォームとしての役割を果たすことができる。さらに、このようなモデルは、癌の再発および進行の生物学を理解するために使用することができる。

、その後腹膜の場所に、初期段階のIP卵巣癌異種移植片は、物理的にマウスを調べることによって検出することはほとんど不可能である。多くの場合、疾患は触診することができたら、腫瘍負荷は既に顕著であるので、治療効果の評価を制限する。蛍光標識された細胞の使用は、私たちはリアルタイムでip腫瘍の確立を評価することができ、その結果、トンを開始する最適な時間を特定するreatment。同様に、蛍光標識された異種移植片は、治療反応のモニタリングを可能にする。それは指摘アウトする必要がありますしかし、そのIPが深い1cm未満に関わらずレポーターシステムの典型的には検出されない腫瘍が含まれる。

ヒト卵巣がん幹細胞^14,15,17,22の使用は、患者において観察された臨床プロファイルを模倣する異種移植片を生成する。原疾患としては、モデルは、パクリタキセルに応答するが、治療の中止は、最終的には化学療法抵抗性再発性疾患につながる。プロトコルセクションに指定された密度で子宮角を通して細胞を導入することは、通常数腹膜インプラントで10日以内に卵巣腫瘍になり、したがって、模倣早期疾患。蛍光標識された細胞の使用は、私たちはリアルタイムでip腫瘍の確立を評価することができ、結果的に治療を開始するための最適な時間を特定する。同様に、蛍光標識された異種移植片は、監視oをを可能に治療に対するfの応答。癌細胞株の他のタイプの卵巣、またはそうでなければ使用している場合は、このプロファイルが観察されない可能性がある。 SKOV3は、例えば使用される場合、初期腹腔内腫瘍はすでに²³耐性であることが報告されている。それにもかかわらず、例えば、蛍光、腹腔内、疾患などのレポーターで標識された場合には、リアルタイムで追跡することができる。

他の蛍光レポーターが使用される場合、コントロール（非腫瘍）動物と初期画像化を行うことが重要である。これは、撮影プロトコルの最適比をシグナリングするための最良のバックグラウンドを達成することを可能にする。 GFP取得設定を使用して画像化されたときに我々の経験では、ヌードマウスは、典型的には、高いバックグラウンドを持っている。

これは、子宮内注入された細胞は、子宮の腫瘍の確立を回避するために、単一の懸濁液中にあることが重要である。また、癌細胞の生着を​​促進する子宮上皮層を傷つけないことも重要である子宮中のSは、このように子宮内腫瘍の代わりに、腹腔疾患を生産。また、データ解析時には、これは、画像の強度が直線的であることを保証し、画像間の比較を可能にする1にガンマ値を設定することが重要である。

MARS画像の取得中には、折りたたみ可能なノーズコーンのチューブ入り端はノーズコーン凹部にあることを確認することが重要です。ノーズコーンは、マウスの窓口として機能するので、正確に較正された角度を得るために必要とされる。長いイメージングプロトコル（ つまり、1時間以上）の場合は、脱水を防ぐために滅菌生理食塩水を皮下に100μlを注入。動物の体温は約37℃でシステムを通って流れる温風を使用して維持されるべきである。 MARSシステムの制限は、1つの動物は動物当たり約1時間の合計実行時間を一度に撮像することができることである。

結論として、我々は、ESTを記述する密接に卵巣癌、プライマリおよび再発性疾患を模倣する動物モデルのablishment。このモデルは、新規の診断または治療法の有効性を評価するために用いることができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI 1640 media	GIBCO, by Life Technologies	23400-021
fetal bovine serum	Gemini Bioproducts	100-106
T75 cell culture flasks	Corning	430641
PBS	Life Technologies	10010-023
Trypsin	GIBCO, by Life Technologies	25300-054
Isoflurane	Butler Schein	NDC 11695-6776-1
Alcohol pads	Fischer Scientific	06-669-62
1 ml syringe	Becton Dickinson	309602
25 gauge needle	Becton Dickinson	305122
synthetic absorbable suture	Covidien	SL-636
tissue adhesive	Vetbond	1469SB
surgical scissors	VWR	82027-584
surgical forceps	VWR	82027-386
hemostat	VWR	82027-422
Paclitaxel	Hospira, Inc.	NDC 61703-345-50
Ibuprofen	Walgreens		Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml)
Puralube Vet ointment	Pharmaderm
In vivo MS FX PRO	Bruker Corporation
MI software	Bruker Corporation
athymic nude mice	Harlan