Abstract
سرطان المبيض الظهاري هو الورم الخبيث الأكثر فتكا خاص بأمراض النساء في الولايات المتحدة. على الرغم من أن المرضى يستجيبون في البداية إلى المعيار الحالي لرعاية تتكون من debulking الجراحي والعلاج الكيميائي تتكون من مزيج من البلاتين والتاكسين المركبات، ما يقرب من 90٪ من المرضى تتكرر في غضون بضع سنوات. في هؤلاء المرضى تطور المرض chemoresistant يحد من فعالية العلاج الكيميائي المتوفرة حاليا وبالتالي يساهم في ارتفاع معدل الوفيات. لاكتشاف خيارات العلاج الجديدة التي يمكن أن تستهدف الأمراض المتكررة، ويطلب النماذج الحيوانية المناسبة التي تحاكي بشكل وثيق على الملف الطبي للمرضى الذين يعانون من سرطان المبيض المتكررة. التحدي في مراقبة (IP) داخل الصفاق المرض يحد من استخدام نماذج الملكية الفكرية وتحت الجلد ومن ثم يتم وضع معظم xenografts. قمنا بتطوير منصة التصوير الضوئية الحساسة التي تسمح للكشف والمكان التشريحي للكتلة الورم الملكية الفكرية. وتشمل منصة يوذاتها من الصحفيين الضوئية التي تمتد من حدود الضوء المرئي لتقترب من الأشعة تحت الحمراء، والتي في تركيبة مع 2-الأبعاد الأشعة السينية المشارك التسجيل يمكن أن توفر المكان التشريحي للإشارات الجزيئية. وتحسنت بشكل ملحوظ الكشف عن طريق استخدام نظام التناوب الذي يدفع الحيوان إلى مواقف متعددة الزوايا لتصوير 360 درجة، مما يتيح تحديد الأورام التي تكون غير مرئية في اتجاه واحد. توفر هذه المنصة نموذجا فريدا لغير جراحية نمو الورم رصد وتقييم فعالية علاجات جديدة للوقاية أو العلاج من سرطان المبيض المتكررة.
Introduction
النماذج الحيوانية هي أدوات لا غنى عنها في بحوث علوم الحياة. في السرطان خاصة، وبيانات تم الحصول عليها من الدراسات على الحيوانات وتوفر المعلومات اللازمة للشروع في اختبار التطبيقات التشخيصية أو العلاجية الجديدة في البشر 1-3. يتم وضع نماذج حيوانية لسرطانات الصلبة كلاسيكي تحت الجلد، حيث أنه يوفر وسيلة سهلة لقياس عبء الورم وتقييم فعالية العلاج دون الحاجة للتضحية الحيوانات. في الواقع، تتطلب داخل الصفاق (IP) نماذج الحيوانات التي يمكن التضحية لكشف وقياس أي تغيرات في نمو الورم. ومع ذلك، لسرطانات الملكية الفكرية مثل سرطان المبيض، ونماذج المتعامدة التغاير توفر ميزة دراسة المرض في البيئة المناسبة لها 4-6. لمثل هذا النموذج لتكون ذات فائدة في تقييم النشاط المضادة للورم، بحاجة الى طرق التصوير غير الغازية لتكون المتقدمة التي تسمح الكمي لعبء IP الورم في الفئران الحية.
ويتمثل التحدي الرئيسي فياستخدام النماذج الحيوانية IP هو صعوبة في قياس بدقة عبء الورم عن طريق الفحص البدني. الكمي الدقيق للأورام الملكية الفكرية تتطلب عادة الفئران لا بد من التضحية للتشريح. يتطلب هذا النهج استخدام عدد كبير من الحيوانات، والتي سيتم التضحية في نقاط زمنية مختلفة. بالإضافة إلى التكلفة، فإنه يدخل تقلب بيانات عالية بسبب الاختلافات الكامنة داخل كل حيوان. غير الغازية التصوير الضوئي في الجسم الحي يوفر نهجا أكثر ملاءمة لمراقبة عبء الورم الملكية الفكرية في الفئران الحية.
وتستخدم عدة طرق التصوير غير الغازية حاليا في الأبحاث ما قبل السريرية لرصد نمو الورم والاستجابة العلاجية. وتشمل هذه المقطعي المحوسب (CT) والموجات فوق الصوتية (US)، التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير الضوئي مثل مضان وتلألؤ بيولوجي 7-12. CT هو عملية التصوير نقل الجمع بين الأشعة السينية وcomputتكنولوجيا إيه. وتنتج المقطع العرضي صورة أشعة الكشف عن فوتون ذات طاقة عالية، والذي يمر عبر الجسم مع سرعة مختلفة. الولايات المتحدة هو نوع من انعكاس الصورة، والتي ترسل الأصوات عالية التردد لخلق جسم الموجات الصوتية التي تنعكس مع سرعة مختلفة اعتمادا على كثافة الأنسجة ومعترف بها بواسطة الكمبيوتر لإنتاج صورة بصرية. MRI و PET هي طرائق التصوير الانبعاثات التي تستخدم الطاقة المغناطيسية والجسيمات النووية، على التوالي لإنتاج الصورة. التصوير بالرنين المغناطيسي يخلق المجال المغناطيسي القوي الذي يدفع الخلايا لإنتاج ترددات الراديو الخاصة بهم، والتي تستخدم لخلق صورة بينما يتطلب PET كاميرا حساسة للكشف عن النشاط الإشعاعي لتدار المسمى 7،9،11 2-fluorodeoxy-D-الجلوكوز. أخيرا، ويستند التصوير الضوئي على الكشف عن الضوء انبعاث للصحفيين أو تحقيقات 9،12 إضاءة الحيوية أو الفلورسنت.
في هذا التقرير، وصفنا استخدام مضان، والتي تقدمبعض المزايا على أنواع أخرى من طرائق التصوير. مع التصوير مضان، يمكن للخلايا أن يكون وراثيا في التعبير عن البروتينات الفلورية باستمرار دون الحاجة إلى إضافة طبقة سفلية أو تحقيقات القائم على الربط، والتي هي المطلوبة لتلألؤ بيولوجي والتصوير بالرنين المغناطيسي، على التوالي. للصحفيين مضان أيضا عادة التعبير عن إشارة أكثر إشراقا مما يتيح استخدام طريقة الكشف أقل حساسية 8،12. بالإضافة إلى ذلك، مع التصوير مضان، فمن الممكن للكشف عن أورام أصغر من 1 سم، وهو ما لا يمكن تحقيقه مع CT 7-9. أخيرا، وعلى النقيض من تلألؤ بيولوجي، إشارة مضان لا يتطلب بيئة الهوائية، وبالتالي الإشارة لا يقتصر في بيئات ميتة، والتي عادة ما تحدث في النوى من الأورام الكبيرة 13.
ومع ذلك، مثل أي تكنولوجيا أخرى، على أساس أساليب التصوير فلوري بوجود سلبياته. واحد منها هو عدم قدرة ماشيالفوتونات المتولدة شمال شرق الطاقة منخفضة لتخترق إلى عمق كاف. وبالتالي، لتقليل كمية الأنسجة تنتشر الفوتونات يجب أن تصوير الحيوانات في زوايا مختلفة. وصفنا بروتوكول لإنشاء سرطان المبيض في الفئران عارية الملكية الفكرية والملكية الفكرية نهجا لمراقبة الورم الذي يوفر التصوير الحيوان كله من خلال التناوب. ومحور دوار زوايا الماوس لمواقف محددة وقابلة للتكرار تقليل تدخل الأنسجة التي غالبا ما يحدث بين مصدر الضوء وكاشف. هذا يحسن التصور الأورام الصغيرة التي قد خلاف ذلك ينبغي تفويتها.
Protocol
موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي جامعة ييل كل العمل في الجسم الحي وصفها. تم إجراء جمع العينات بموافقة المريض والموافقة عليها من قبل لجنة التحقيقات الإنسان من جامعة ييل كلية الطب.
1. إعداد الإنسان خلايا سرطان المبيض
- قبل إعداد الخلايا تأكد من أن جميع المواد المطلوبة للحقن داخل الرحم هو موضح أدناه جاهزة ويمكن الوصول إليها بسهولة. حقن تعليق خلية حالما يكون جاهزا.
- تنمو الخلايا السرطانية الفلورسنت وصفت في الثقافة. نحن استخدام الجيل F2 من CD44 + البشري / MyD88 + خلايا سرطان المبيض الظهاري، والتي أثبتنا سابقا لإيواء خصائص stemness مثل tumorigenicity، ومقاومة كيميائية ذات قدرة عالية لإصلاح الورم 14-19. وقد ولدت هذه الخلايا للتعبير ثابت mCherry مضان (F2-mCherry، الشكل 1) عن طريق إنتاج الفيروسة البطيئة من polyethylenimine(PEI) بروتوكول 20،21.
- في يوم من الحقن، وحصاد الخلايا عن طريق trypsinization ويغسل مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
- تحديد عدد الخلايا وتعليق الخلايا في 3 × 10 6 خلايا / 50 ميكرولتر في وسائط النمو المناسب. لخلايا سرطان المبيض نستخدم RPMI 160 مع 10٪ FBS. إبقاء الخلايا في الحاضنة حتى جاهزة للحقن ولكن لا تبقي لفترة أطول من 15 دقيقة. هذا يكفي لحقن الفأر واحدة.
2. الحقن داخل الرحم من الخلايا البشرية سرطان المبيض في الفئران عارية Athymic
لاحظ أن الإجراء التالي يتطلب مساعدة من شخص ثان. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذا هو جراحة بقاء، واستخدام الأدوات الجراحية المعقمة. هذا الإجراء الجراحة البقاء يجب أن تأخذ حوالي 10 إلى 15 دقيقة.
- تخدير الماوس باستخدام 2٪ الأيزوفلورين. وعادة ما تستخدم من العمر 8 أسابيع 7- أن الفئران عارية athymic.
- تحقق من أن الحيوان هو الإنشائيةanesthesized اعل عن طريق معسر لوحة القدم باستخدام الأصابع أو الملقط. وينبغي أن يكون هذا الحيوان تماما غير المراعية للألم قبل بدء الجراحة.
- ضع الماوس تخدير الجانب البطني حتى على شاش معقم مع رئيس بعيدا عن المحقق.
- تطبيق مرهم على العينين مع قضيب من القطن تلميح لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- إدراج مباشرة في الرأس في نظام مخروط الأنف متصلة المرذاذ الأيزوفلورين (الشكل 2A). هذا يسلم التخدير طوال العملية الجراحية.
- تطهير اليسار (أو اليمين) جانب من البطن باستخدام منصات الكحول (الشكل 2B)، يليه اليود ثم وضع ثنى الجراحية المعقمة على موقع الجراحية.
- باستخدام مقص وملقط الجراحة المعقمة جعل شق الجلد 1-2 سم في الربع السفلي الأيسر من الفأرة (الشكل 2C).
- رفع العضلات وإجراء شق من أجل الوصول إلى الصفاق. <لى> تشريح العضلات المائلة لفضح تجويف البطن.
- تحديد موقع وتحديد قرن الرحم الأيسر (الشكل 2D).
- باستخدام مرقئ معقم، المشبك كلا الجانبين الأمامي والخلفي من قرن (الشكل 2E). وضع الشبك الأمامي الحق دون قناة فالوب والمشبك الخلفي الحق فوق عنق الرحم.
- أطلب من الشخص الثاني حقن تعليق خلية. وضع إبرة تحتوي على خلايا، في زاوية 45 درجة عموديا على قرن (الشكل 2F). جدا حقن ببطء 50 ميكرولتر من تعليق خلية في تجويف قرن الرحم.
- إزالة الإبرة والافراج عن المشبك الأمامي.
- الافراج عن المشبك الخلفي واستبدال قرن الرحم في تجويف البطن.
- إغلاق الصفاق باستخدام خياطة امتصاص الاصطناعية وإغلاق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة.
- إزالة الماوس من مخروط الأنف ووضعه مرة أخرى في قفص. إذا لزم الأمر، تغيير الفراش لضمان الحريهن القفص بعد الجراحة. تأكد من أن جميع الحيوانات مستيقظة ونشطة قبل ان يغادر دون مراقبة.
- توفير ايبوبروفين في 0.11 ملغ / مل من الماء الصالح للشرب لأول عملية جراحية بعد 48 ساعة. بعد ذلك، مع استبدال مياه الشرب العادية.
- ملاحظة: أنه إذا تستخدم الفئران عارية athymic ويتم إغلاق الجلد باستخدام لاصق الأنسجة بدلا من الغرز، فإنه ليس من الضروري أن تفصل بين الفئران بعد الجراحة. الفئران SCID أكثر عدوانية وربما يجب أن تكون مفصولة.
- مراقبة عن كثب من موقع شق لعدوى محتملة بسبب جرح مفتوح.
3. الكشف المبكر للسرطان المبيض المرحلة البينية البريتوني بواسطة لايف في فيفو التصوير
تحديد وجود المرض الملكية الفكرية داخل البريتوني من خلال العيش في التصوير الحي. ويستخدم النظام المتعدد الوسائط الحيوان دوران (MARS) في هذا البروتوكول.
- الوصول إلى التقاط برامج MARS من داخل البرنامج MI. وتقدم هذه الوحدةالسيطرة منسقة من MARS التقاط الإعدادات في حين الاستفادة من التقاط وتحليل قدرات نظام التصوير و. تحسين إعدادات التقاط الفردية لكل طريقة استخدام التصوير عرض واحد مسبق لتطوير بروتوكول التناوب في الخطوة 3.4.
- سلفا إدخال القيم الالتقاط. لالتقاط مضان، استخدم 10 التعرض ثانية، 2 × 2 binning، و توقف 2.8، فوف 120 ملم، مثلا: 550 نانومتر، م: 600 نانومتر وضع التقاط التصفية. لالتقاط الأشعة السينية، واستخدام التعرض 10 ثانية، 2 × 2 binning، و توقف 2.8، فوف 120 ملم، 35 KVP، 0.4 مم آل إعداد القبض على مرشح.
- حفظ المعلمات في الخطوة 3.2 كملفات جلسة فردية.
- إنشاء بروتوكول تسلسل دوران باختيار إنشاء / تحرير زر البروتوكولات من نافذة اكتساب واجهة النظام.
- حدد الملف جلسة مضان المحفوظة مسبقا، وباستثناء ما خطوة واحدة. بعد ذلك، حدد الأشعة السينية ملف جلسة المقابلة، وباستثناء ما الخطوة الثانية.
- مع خطوة واحدة محددة، استخدام مجموعة دورانسلسلة من التقاط الصور القائمة المنبثقة قبل لضبط المطلوب بدءا زاوية، مجموعة، وزيادة لضمان لتصور سلسة من الميزات. وتشمل قيم محددة بدءا من زاوية -180 درجة، مجموعة واسعة من 375 درجة، وزيادة قدرها 15 درجة.
- انقاذ بروتوكول وانقر على زر Done لتهيئة MARS ورسم خريطة للمواقع السائر المحركات المقابلة لكل من الزيادات زاوية.
- أداء المعايرة النهائية كما هو موضح أدناه لمحاذاة بطني، ظهري والآراء الجانبية للحيوان معين المتمركزة في دعم الحيوان مع درجة معينة من الدوران لاستخدامها من قبل بروتوكول البرمجيات.
- تخدير الماوس باستخدام مزيج من الهواء الطبي و 2٪ الأيزوفلورين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة.
- بدء التنسيق عن طريق اختيار زر معاينة من داخل القائمة اكتساب لإظهار علامة التبويب الدوار. استخدام طريقة انعكاس الضوء بدلا من multiwavelength أو X-RAطرائق Y لتعجيل العملية.
- حدد الخيار ماوس تحميل والمضي قدما من خلال سلسلة من القوائم لتحديد المواقع.
- تأكد من أن نهاية أنبوبية من الرؤوس لطي هي في عطلة الرؤوس ووضع الماوس في الاتجاه عرضة مع رئيسها في الرؤوس.
- بدء المعايرة في موقف 0 درجة مع الجانب البطني للحيوان أسفل. استخدام المقابض اثنين على نظام التناوب لوضع الحيوان بحيث يظهر تركزت في نافذة المعاينة.
- كرر العملية كما هو مطلوب ل-180، - 90، +90، و+180 درجة المواقف وانقر فوق تم.
- تنفيذ بروتوكول المحفوظة مسبقا من خلال النقر على زر تنفيذ البروتوكول من نافذة اكتساب الرئيسي. أثناء تنفيذ البروتوكول، ومراقبة الوضع نافذة توفير تحديثات في الوقت الحقيقي لالتقاط الحالي، مدة التعرض، وخطوة بروتوكول الشاملة.
- تجميع الصور الفردية إلى صيغة الفيلم باستخدامبرنامج التناوب. استخدام عناصر التحكم في العرض لضبط السطوع / التباين، والشفافية، وتعيين لون العرض للإشارة مضان.
- تصدير تسلسل نهائي من الصور في تنسيق الملف *. افي لعرضه.
4. إدارة 1 و 2 جولة الثانية العلاج الكيميائي
- بعد اكتشاف ورم الملكية الفكرية MARS، وتحديد منطقة الورم الأولي من عبء الفائدة (ROI) باستخدام معيار تحديد المواقع ثنائي الأبعاد. يتم إجراء هذا في علبة شفافة الحيوان تركيبها في نظام التصوير كما هو موضح أدناه في القسم 5. مرة واحدة ويتم تحديد العائد على الاستثمار الأولي، تدير 4 جرعة من 12 ملغ / كغ الملكية الفكرية باكليتاكسيل كل ثلاثة أيام. يتم الحصول على باكليتاكسيل من شركة هوسبيرا في صياغة الجاهزة للذهاب مع cremaphor كما السيارة. أثبتنا سابقا أن هذا النظام العلاجي والنشاط المضادة للورم كبير ضد نموذج طعم أجنبي مقابل السيطرة على السيارة ويدفع القضاء التام على اكتشاف رumor عبء 20. ولكن نظرا لطبيعة المرض والأورام الملكية الفكرية تتكرر بعد أيام قليلة من انتهاء العلاج 20.
- مراقبة الاستجابة للعلاج عن طريق تصوير كل 3 أيام لتحديد المواقع باستخدام معيار ثنائي الأبعاد.
- بعد الجرعة الرابعة من باكليتاكسيل، تصنيف الفئران وجود استجابة كاملة (ROI أقل من 2000)، استجابة جزئية (انخفاض تصل إلى 35٪ من العائد على الاستثمار الأولي التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.1، مرض مستقر (تصل إلى 50٪ زيادة عن العائد على الاستثمار الأولي )، أو التقدم مع العلاج (زيادة أكثر من 50٪ من العائد على الاستثمار الأولي) بناء على إشارة الفلورسنت ملاحظتها.
- بالنسبة للفئران مع استجابة كاملة، ومراقبة تكرار التصوير من قبل كل 3 أيام. مرة واحدة لوحظ تكرار (ROI = العائد على الاستثمار المبدئي في الخطوة 4.1)، وإعادة بدء-الجولة الثانية من باكليتاكسيل كما هو موضح في 4.1.
- في الفئران مع مرض جزئي، مرض مستقر، أو تلك التي تقدم مع العلاج، وإعادة بدء الجولة الثانية من باكليتاكسيل بعد 3 أيام جرعة ال 4من باكليتاكسيل. وبالمثل، هذه صورة كل ثلاثة أيام.
5. رصد الاستجابة للعلاج عن طريق تحديد المواقع ستاندرد ثنائي الأبعاد
- تخدير الفئران ليتم تصويرها باستخدام مزيج من الهواء الطبي و 2٪ الأيزوفلورين بمعدل تدفق 2 لتر / دقيقة.
- وضع رئيس تخدير الفئران في nosecones فرد في علبة شفافة الحيوان داخل غرفة التصوير (الشكل 3).
- إدخال المعلمات التعرض سلفا لمضان (10 التعرض ثانية، 2 × 2 binning، و توقف 2.8، فوف 120 ملم، مثلا: 550 نانومتر، م: 600 نانومتر) والأشعة السينية (التعرض و 20 ثانية، 2 × 2 binning، و توقف 2.8، فوف 120 ملم، 35 KVP، 0.4 مم آل مرشح).
- انقر فضح لالتقاط الصور في كل من التسلسل.
- فتح الصور في برنامج بروكر MI عن الفحص البصري والمنطقة من تحليل الفائدة.
6. صورة تراكب وتحليل
لتوفير المقارنة صالحة للبوالتاسع التحليل البصري والكمي لعملية تسلسل الصور دوام جميع الصور الأمامية والخلفية بالمثل.
- فتح كل من الصورة الأمامية (أي مضان) والتصوير خلفية في البرنامج وتحديد وظيفة البلاط من القائمة إطار في الأعلى (الشكل 4A).
- لمعالجة الصورة الأمامية. فتح علامة التبويب عرض الصور في أعلى شريط (الشكل 4A، السهم الأحمر) وتعيين الحد الأدنى / الحد الأقصى لقيم 260 و 5000، على التوالي (الشكل 4A، السهم الأزرق)
ملاحظة: مجموعة صورة العرض يختلف من دراسة إلى أخرى تبعا لشدة إشارة مضان المأسورة في الصور. وينبغي مقارنة الصور مع مين / ماكس التي سوف تظهر الجماهير الورم، ولكن لا تظهر الخلفية من تألق ذاتي للحيوان. - بجوار مفتوحة السيارات رويس تبويب من لوحة التنقل على اليسار (الشكل 4B، السهم الأحمر) وحدد مجموعة جديدة من العائد على الاستثمار القائمة (الشكل 4C والأحمر وRROW). ضبط إعدادات لاستخدام خوارزمية عتبة 630 في مستويات ودرجات الرمادي وإلغاء تقييد حجم ماكس لضمان جميع ROI المحتملة يتم تسجيلها في (الشكل 4C).
ملاحظة: قد تختلف إعدادات عتبة من دراسة إلى أخرى تبعا لشدة إشارة مضان المأسورة في الصور. thresholded الصور ل quantitate إشارة من الجماهير الورم ولكن ليس قياس إشارة من تألق ذاتي الخلفية من الحيوان. - صورة من داخل نافذة العرض تحديد وظيفة قناع. الآن سيتم عرض فقط المنطقة المقابلة لبكسل التي تحتوي على قيم تساوي أو تزيد على قيمة العتبة من 630 مستويات الرمادي.
- لعرض النتائج الكمية حدد علامة التبويب تحليل من شريط القوائم العلوي وحدد علامة التبويب عرض (الشكل 4D، السهام الحمراء).
- من قائمة العرض حدد الرقم التسلسلي، خانات الاختيار سوم، متوسط، والمساحة ثم انقر فوق موافق.
- حفظ الصورة حتى القيم يمكن أن يكون السابقيناستدار على طول مرة واحدة تتم معالجة كافة الصور مضان.
- المقبل، وتسليط الضوء على صورة الأشعة السينية، ومرة أخرى فتح شاشة عرض الصور من شريط القوائم العلوي. تعيين قيم دقيقة، كحد أقصى وغاما لإعطاء أفضل تمثيل مرئي من الهيكل العظمي الماوس.
ملاحظة: بما يتم تنفيذ أي الكميات على صور الأشعة السينية كل صورة الأشعة السينية الفردية من التسلسل الزمني يمكن معالجة (أي دقيقة، كحد أقصى والقيم جاما) لإنتاج أفضل تمثيل تبحث من أن مجموعة البيانات. - مرة أخرى مع صورة الأشعة السينية أبرز تحديد خانة الاختيار تراكب واختيار المقابلة صورة مضان اسم الملف من القائمة المنسدلة (الشكل 4E) إلى أسفل.
- لاستخراج الناتج يغطى، حدد علامة التبويب الشروح من القائمة الإنتقال (الشكل 4B، السهم الأزرق) على اليسار. تحديد علامات التبويب المناسبة لإضافة أي بيانات أو نص إضافية وأخيرا إضافة شريط مقياس شدة ذلك البيانات كثافة مضان يمكن تحديدها بسرعة من ايمالعمر.
- حالما يتم الانتهاء من الشروح تسليط الضوء على كافة الكائنات على الصفحة الشروح وحدد نسخ من القائمة تحرير في أعلى ولصق البيانات في صورة يغطى الملف المناسب (مثل Word و PowerPoint و / أو فوتوشوب) للعرض.
- كرر الخطوات من 6.1- 6.11 لجميع أزواج من مضان والأشعة السينية والصور في تسلسل. تأكد من سلامة كل الصور قبل إغلاقها.
- عن الكميات النهائية فتح جميع الصور مضان في نفس الوقت وتحديد تجانب من القائمة إطار طول الجزء العلوي.
- بجانب تحديد المستندات تصدير جميع المفتوحة لعرض البيانات.
ملاحظة: في غياب برنامج إكسل، قم بإلغاء تحديد علامة التبويب. سوف MI توليد التبويب نص محدد (أي. TXT) ملف التي يمكن نقلها إلى الكمبيوتر المناسب لمزيد من التحليل.
Representative Results
التصوير الحي غير الغازية يسمح برصد التقدم الملكية الفكرية الورم من نفس الفئران عبر الزمن. الحقن داخل الرحم من الخلايا السرطانية mCherry المسمى-F2 المبيض باستخدام بروتوكول صفها يولد الأورام الملكية الفكرية مرئية في يوم 5 و سرطاني في يوم 32 (الشكل 5). الشكل 6 يوضح العلاقة من الصور التي تم الحصول عليها مع سرطاني وحظ بعد التضحية الفئران .
التصوير باستخدام MARS يسمح للكشف عن الأورام الملكية الفكرية التي من شأنها أن خلاف ذلك ينبغي تفويتها إذا تم الحصول على صورة من طائرة واحدة واحدة فقط. الشكل 7 (اللوحة العلوية) يبين أنه حتى في السيطرة على الفئران مع عبء الورم كبيرا، يمكن التقليل من حجم الورم اعتمادا على زاوية تم التقاط هذه الصورة من. القدرة على ضمان أن كتلة الورم لا غاب أو الاستهانة، بل هو أكثر أهمية في ختام الجولة 1 ش العلاج الكيميائي عندما يتم تصنيف الحيوانات إما الاستجابة الكاملإيه، والرد الجزئي، أو عدم الرد (الشكل 7 وحة المتوسطة). وبالمثل، أثناء العلاج الصيانة هو من أهمية قصوى للكشف عن الأورام المتكررة صغيرة جدا لتسمية أيام بشكل صحيح للنكس، الذي يحدد خالية من التقدم الفاصلة (الشكل 7 وحة المتوسطة).
هو الأمثل تقييم كمي لعبء الورم من خلال تناوب الحيوانية. دوران الحيوان إلى الزوايا التي من شأنها أن تقلل من عمق الإثارة وانبعاث الضوء ينتقل عن طريق ستسمح لالتقاط أدق من الفوتونات من مضان، مما يدل على كمية من الخلايا السرطانية، وبالتالي عبء الورم. وبالتالي، تم تحسين الكميات للأورام محددة في الحيوان تبعا لموقعها في تسلسل التناوب.
في عرض صور من مجموعات البيانات التناوب، فمن المهم لتعيين الصور لمين / ماكس صورة مجموعة المقابل الذي سيعرض على نحو فعال جميع الجماهير الورم، في حين يسمح لVISU آل ترسيم الجماهير ورم الفردية. لهذه الدراسة، تم العثور على مجموعة النقيض المثالي أن يكون ما لا يقل عن 50 تهمة وبحد اقصى 1200 التهم الموجهة إليه. ويمكن ملاحظة هذه القيم كمبدأ توجيهي لدراسات أخرى، ومع ذلك، سوف يتراوح المقابل المثلى تختلف من دراسة إلى أخرى اعتمادا على مستوى عبء الورم، فلوري مستويات الببتيد التعبير في الخلايا، والتصوير تكوين النظام، وإعدادات الالتقاط.
الشكل 1: خلايا سرطان المبيض F2 التعبير عن ثابت mCherry مضان. (A) صورة المرحلة. (ب) صورة مضان. (C) تراكب A و B. ملاحظة أن 100٪ من خلايا تعبر مراسل مضان.
s.jpg و"العرض =" 600 "/>
الشكل 2: الحقن داخل الرحم من خلايا سرطان المبيض. ويدير (A) التخدير بشكل مستمر عبر مخروط الأنف. (BE) هو قطعي الجلد لتحديد وتضييق قرن الرحم. يتم حقن (F) الخلايا السرطانية ببطء داخل تجويف الرحم.
الرقم 3: (A) 2D التصوير مع درجة الحرارة للرقابة وثيقة الدائرة التهوية علبة شفافة الحيوان داخل غرفة التصوير. تم تجهيز (B، C) صينية مع المخاريط الأنف لتقديم التخدير ويمكن أن تعقد ما يصل إلى خمسة الفئران.
<قوية> الشكل 4: ممثل وحات نافذة مأخوذة من برامج التحليل للمساعدة في تحليل البيانات. يرجى الاطلاع على النص لتفسير.
الرقم 5: الكشف عن mCherry مضان شارك المترجمة مع الأشعة السينية في تسلسل التصوير الطولي. وجاء ثلاثة الفئران مع ورم الملكية الفكرية من خلال الوقت لتقييم تطور الورم الملكية الفكرية. نلاحظ أن تطور الورم قد تختلف. الرقم هو صورة تمثيلية من 3 الفئران مع معدلات مختلفة من تطور الورم، وبالتالي تفاوت العبء الورم عبر الزمن.
الرقم 6: العلاقة بين الملكية الفكرية عبء الورم (اللوحة العلوية) وتراكب مضان / الأشعة السينية IMAجنرال الكتريك (اللوحة السفلية). حوالي 32 يوما حقن آخر من F2-mCherry خلايا سرطان المبيض، يتم تنفيذ 2D التصوير والتضحية الفئران لربط عبء الورم الفعلي مع الصورة المكتسبة. السهام الحمراء تشير إلى عبء الورم.
الرقم 7: دوران مجموعات البيانات مما يتيح التصوير متعددة الزوايا والكشف عن الأورام في التحكم (اللوحة العلوية)، باكليتاكسيل تعامل (لوحة وسطى)، والفئران المتكرر (اللوحة السفلية). الشكل يوضح صورة ماوس واحدة في لوحة كما تم تدويرها باستخدام نظام MARS. لاحظ أنه حتى في السيطرة على الفئران مع عبء الورم كبيرا، يمكن التقليل من حجم الورم اعتمادا على زاوية لقد التقطت الصورة من.
Discussion
وصفنا بروتوكول لإنشاء نموذج حيواني سرطان المبيض البشري IP الذي يحاكي التعريف السريري لوحظ في المرضى. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف استخدام جهاز دوران الحيوان الذي يتناول الحد من حساسية 2D التصوير. أخذت معا، يمكن لهذه التقنيات بمثابة منصات لاكتشاف مركبات جديدة يمكن أن تستهدف سرطان المبيض المتكررة chemoresistant. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النموذج يمكن استخدامه لفهم البيولوجيا من تكرار السرطان والتقدم.
نظرا لموقعه خلف الصفاق، في مرحلة مبكرة الملكية الفكرية xenografts سرطان المبيض تكاد تكون مستحيلة للكشف عن طريق فحص جسديا الماوس. في معظم الحالات، مرة واحدة ويمكن تحسس هذا المرض، وعبء الورم كبيرا بالفعل، وبالتالي يحد من تقييم فعالية العلاج. استخدام الخلايا fluorescently المسمى يسمح لنا بتقييم إنشاء IP الورم في الوقت الحقيقي، وبالتالي تحديد الوقت الأمثل لبدء رreatment. بطريقة مماثلة، xenografts الفلورسنت المسمى تتيح رصد الاستجابة للعلاج. وتجدر الإشارة، إلى أنه ومع ذلك الأورام التي IP أعمق من 1 سم وعادة ما تكون لا يمكن اكتشافها بغض النظر عن نظام المراسل.
استخدام خلايا سرطان المبيض الجذعية البشرية 14،15،17،22 يولد xenografts التي تحاكي التعريف السريري لوحظ في المرضى. كمرض الابتدائية، والنموذج هو استجابة لباكليتاكسيل لكن وقف العلاج يؤدي في النهاية إلى المرض المتكرر chemoresistant. إدخال الخلايا من خلال أبواق الرحم في الكثافة المحددة في القسم بروتوكول عادة ما يؤدي إلى أورام المبيض في غضون 10 أيام مع عدد قليل من يزرع البريتوني، وبالتالي يقلد المرض في مرحلة مبكرة. استخدام الخلايا fluorescently المسمى يسمح لنا بتقييم إنشاء IP الورم في الوقت الحقيقي، وبالتالي تحديد الوقت الأمثل لبدء العلاج. بطريقة مماثلة، xenografts الفلورسنت المسمى تسمح برصد سو استجابة للعلاج. في حالة استخدام أنواع أخرى من خطوط الخلايا السرطانية، المبيض أو غير ذلك، فمن الممكن أن هذا الملف قد لا يمكن ملاحظتها. عند استخدام SKOV3 على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن أن الأورام الأولية الملكية الفكرية هي مقاومة 23 بالفعل. ومع ذلك، إذا وصفت مع مراسل مثل مضان، والملكية الفكرية، المرض يمكن أن تتبع في الوقت الحقيقي.
إذا تم استخدام الآخرين مراسل الفلورسنت، فمن المهم إجراء التصوير الأولي مع جهاز تحكم (أي ورم) الحيوان. هذا سيسمح تعظيم الاستفادة من بروتوكول التصوير لتحقيق أفضل خلفية للإشارة إلى النسبة. في تجربتنا، والفئران عارية وعادة ما يكون خلفية عالية عند تصويرها باستخدام الإعدادات اكتساب GFP.
من المهم أن حقن الخلايا داخل الرحم ويتم في تعليق واحد لتجنب إنشاء أورام في الرحم. من المهم أيضا لتجنب خدش الطبقة الظهارية الرحم، مما يسهل أيضا engraftment من الخلايا السرطانيةS في الرحم مما ينتج ورم داخل الرحم بدلا من المرض الملكية الفكرية. بالإضافة إلى ذلك، خلال تحليل البيانات، من المهم تعيين قيمة جاما إلى 1. هذا يضمن أن كثافة الصور بشكل طولي وتتيح المقارنة بين الصور.
خلال اقتناء الصور MARS، فمن المهم التأكد من أن نهاية أنبوبية من الرؤوس لطي هي في عطلة الرؤوس. يخدم الرؤوس كنقطة اتصال للماوس، وبالتالي هناك حاجة للحصول على زوايا محسوبة بدقة. لبروتوكولات التصوير أطول (أي أطول من 1 ساعة)، وضخ 100 ميكرولتر من محلول ملحي معقم تحت الجلد للمساعدة على منع الجفاف. ينبغي الحفاظ على درجة حرارة الجسم الحيواني باستخدام الهواء الدافئ تدفقت من خلال نظام في حوالي 37 درجة مئوية. وجود قيود على نظام MARS هو أن حيوان واحد فقط ولا يمكن تصوير في وقت واحد مع وقت التشغيل الكلي لحوالي 1 ساعة لكل حيوان.
في الختام، نحن تصف مؤسسةablishment من نموذج حيواني الذي يحاكي بشكل وثيق بسرطان المبيض، وكلاهما المرض الأولية والمتكررة. هذا النموذج يمكن استخدامها لتقييم فعالية طرائق تشخيصية أو علاجية جديدة.
Disclosures
رسوم النشر لهذا المقال رعيت جزئيا من قبل شركة بروكر.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح RO1CA118678 وRO1CA127913، من قبل مؤسسة عائلة رمال، واكتشاف علاج للبرنامج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
| fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
| T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
| Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
| 1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
| 25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
| synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
| tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
| surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
| surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
| hemostat | VWR | 82027-422 | |
| Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
| Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5 ml) | |
| Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
| In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
| MI software | Bruker Corporation | ||
| athymic nude mice | Harlan |
References
- Cho, K. R. Ovarian cancer update: lessons from morphology, molecules, and mice. Archives of pathology & laboratory medicine. 133, 1775-1781 (2009).
- Jong, M., Maina, T. Of mice and humans: are they the same?--Implications in cancer translational research. Journal of nuclear medicine : official publication, Society of Nuclear Medicine. 51, 501-504 (2010).
- Langdon, S. P. Animal modeling of cancer pathology and studying tumor response to therapy. Current drug targets. 13, 1535-1547 (2012).
- Mullany, L. K., Richards, J. S. Minireview: animal models and mechanisms of ovarian cancer development. Endocrinology. 153, 1585-1592 (2012).
- Ricci, F., Broggini, M., Damia, G. Revisiting ovarian cancer preclinical models: implications for a better management of the disease. Cancer treatment reviews. 39, 561-568 (2013).
- Pizzonia, J., et al. Multimodality animal rotation imaging system (Mars) for in vivo detection of intraperitoneal tumors. Am J Reprod Immunol. 67, 84-90 (2012).
- House, C. D., Hernandez, L., Annunziata, C. M. Recent Technological Advances in Using Mouse Models to Study Ovarian Cancer. Frontiers in oncology. 4, 26 (2014).
- Rao, J., Dragulescu-Andrasi, A., Yao, H. Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current opinion in biotechnology. 18, 17-25 (2007).
- Manegold-Brauer, G., Bellin, A. K., Tercanli, S., Lapaire, O., Heinzelmann-Schwarz, V. The special role of ultrasound for screening, staging and surveillance of malignant ovarian tumors: distinction from other methods of diagnostic imaging. Archives of gynecology and obstetrics. 289, 491-498 (2014).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive bioluminescence imaging in small animals. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 49, 103-115 (2008).
- Rockall, A. G., et al. Repeatability of Quantitative FDG-PET/CT and Contrast-Enhanced CT in Recurrent Ovarian Carcinoma: Test-Retest Measurements for Tumor FDG Uptake, Diameter, and Volume. Clin Cancer Res. 20, 2751-2760 (2014).
- Hickson, J. In vivo optical imaging: preclinical applications and considerations. Urologic oncology. 27, 295-297 (2009).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annual review of biomedical engineering. 4, 235-260 (2002).
- Alvero, A. B., et al. Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance. Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).
- Alvero, A. B., et al. Stem-like ovarian cancer cells can serve as tumor vascular progenitors. Stem Cells. 27, 2405-2413 (2009).
- Alvero, A. B., et al. NV-128, a novel isoflavone derivative, induces caspase-independent cell death through the Akt/mammalian target of rapamycin pathway. Cancer. , (2009).
- Chefetz, I., et al. TLR2 enhances ovarian cancer stem cell self-renewal and promotes tumor repair and recurrence. Cell Cycle. 12, 511-521 (2013).
- Liu, M., et al. High frequency of putative ovarian cancer stem cells with CD44/CK19 coexpression is associated with decreased progression-free intervals in patients with recurrent epithelial ovarian cancer. Reprod Sci. 20, 605-615 (2013).
- Steffensen, K. D., et al. Prevalence of epithelial ovarian cancer stem cells correlates with recurrence in early-stage ovarian cancer. J Oncol. 2011, 620523 (2011).
- Craveiro, V., Yang-Hartwich, Y., Holmberg, J., Sumi, N., Pizzonia, J., Griffin, B., Gill, S., Silasi, D., Azodi, M., Rutherford, T., Alvero, A. B., Mor, G. Phenotypic Modifications in Ovarian Cancer Stem Cells Following Paclitaxel Treatment. Cancer Medicine. , (2013).
- Kuroda, H., Marino, M. P., Kutner, R. H., Reiser, J., et al. Production of lentiviral vectors in protein-free media. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino..[etal.]. 26, (2011).
- Yin, G., et al. Constitutive proteasomal degradation of TWIST-1 in epithelial-ovarian cancer stem cells impacts differentiation and metastatic potential. Oncogene. 32, 39-49 (2013).
- Vassileva, V., Allen, C. J., Piquette-Miller, M. Effects of sustained and intermittent paclitaxel therapy on tumor repopulation in ovarian cancer. Mol Cancer Ther. 7, 630-637 (2008).
