We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Epitelial eggstokkreft er den mest dødelige gynekologisk kreft i USA. Selv om pasienter i utgangspunktet svare til dagens standardbehandling som består av kirurgisk debulking og kombinasjonskjemoterapi som består av platina og taxan forbindelser, nesten 90% av pasientene går igjen i løpet av få år. I disse pasientene utviklingen av sykdommen kjemoresistent begrenser effekten av tiden tilgjengelige kjemoterapeutiske midler, og derfor bidrar til høy dødelighet. Å oppdage nye behandlingsmuligheter som kan målrette tilbakevendende sykdom, er egnede dyremodeller som tett etterligner den kliniske profilen til pasienter med residiverende eggstokkreft nødvendig. Utfordringen i å overvåke intra-peritoneal (ip) sykdommen begrenser bruken av ip modeller og dermed de fleste xenografts er etablert subkutant. Vi har utviklet en følsom optisk imaging plattform som gjør det mulig å oppdage og anatomiske plasseringen av ip tumormasse. Plattformen inkluderer use av optiske reportere som strekker seg fra synlig lys til nær infrarødt spekter, som i kombinasjon med 2-dimensjonal røntgenstråle-co-registrering kan gi anatomisk lokalisering av molekyl signaler. Deteksjon blir betydelig forbedret ved bruk av en rotasjonssystem som driver dyret til flere vinkelposisjoner til 360 graders avbildning, slik at identifisering av tumorer som ikke er synlig i enkeltretning. Denne plattformen gir en unik modell til en ikke invasiv monitor tumorvekst og evaluere effekten av nye terapier for forebygging eller behandling av tilbakevendende kreft i eggstokkene.
Dyremodeller er uunnværlige verktøy i life science forskning. I kreft spesielt, data ervervet fra dyrestudier gi nødvendig informasjon som kreves for å starte testing av nye diagnostiske eller terapeutiske bruksområder hos mennesker 1-3. Dyremodeller for solide kreftformer er klassisk etablert subkutant som det gir en enkel måte å måle tumorbelastning og evaluere behandlingseffekten uten å måtte ofre dyrene. Faktisk, intra-peritoneal (ip) modeller krever at dyr ofres for å oppdage og måle eventuelle endringer i tumorvekst. Imidlertid, for ip cancertyper slik eggstokkreft, ortotropiske modeller har den fordelen av å studere sykdommen i sin riktige miljø 4-6. For en slik modell for å være av anvendelse ved evaluering av antitumoraktivitet, ikke-invasive avbildningsmetoder trenger å bli utviklet som tillater kvantifisering av tumorbyrde ip i levende mus.
En stor utfordring iBruk av IP dyremodeller er vanskeligheten med nøyaktig kvantifisering av tumorbelastning ved fysisk undersøkelse. Nøyaktig kvantifisering av ip svulster vanligvis krever mus for å bli ofret for disseksjon. Denne fremgangsmåten krever bruk av høye antall dyr, som ville bli ofret ved forskjellige tidspunkter. I tillegg til kostnaden, introduserer den høye data variasjon på grunn av iboende variasjoner innenfor hvert dyr. Ikke-invasive in vivo optisk avbildning gir en mer passende måte å overvåke ip tumorbyrde i levende mus.
Flere ikke-invasive avbildningsmetoder er for tiden brukes i pre-klinisk forskning for overvåking av tumorvekst og terapeutiske svar. Disse omfatter computertomografi (CT), ultralyd (US), magnetisk resonans imaging (MRI), positronemisjonstomografi (PET), og optisk avbildning som fluorescens og bioluminescens 7-12. CT er en overføring avbildingsprosessen kombinere X-ray og computeh teknologi. Den produserer et tverrsnitt bilde av detekterte stråler av høy-energi-foton, som går gjennom kroppen med forskjellig hastighet. USA er en type refleksjon image, som sender høyfrekvente lyder til kroppen skaper lydbølger som reflekteres med forskjellig hastighet avhengig vevstetthet og gjenkjent av datamaskinen til å produsere et visuelt bilde. MR og PET er utslipps avbildningsmodaliteter som bruker magnetisk energi og kjernepartikler, henholdsvis for å frembringe bildet. MRI skaper et sterkt magnetisk felt som induserer celler til å produsere sine egne radiofrekvenser, som brukes til å skape et bilde mens PET krever en følsom kamera til å detektere radioaktiviteten av det administreres merket 2-fluorodeoxy-D-glukose 7,9,11. Til slutt blir optisk avbildning basert på deteksjonen av utslipp av lys bioluminescerende eller fluorescerende reportere eller sonder 9,12.
I denne rapporten beskriver vi bruk av fluorescens, som tilbyrnoen fordeler i forhold til de andre typer av bildediagnostikk. Med fluorescens-avbildning kan cellene fremstilles ved gensløyd for å uttrykke proteiner fluorescerende konstant uten å kreve tilsetning av et substrat eller en ligerings-baserte prober, som er nødvendige for bioluminescens og magnetisk resonansavbildning, respektivt. Fluorescens reportere uttrykker også typisk en lysere signal således tillater bruk av en mindre sensitiv deteksjonsmetode 8,12. I tillegg, med fluorescens-avbildning, er det mulig å detektere tumorer som er mindre enn 1 cm, som ikke er oppnåelig med CT 7-9. Til slutt, i motsetning til bioluminescens, betyr fluorescens-signalet krever ikke et aerobt miljø, og dermed signalet ikke er begrenset i hypoksiske omgivelser, som vanligvis forekommer i de kjerner av 13 store tumorer.
Imidlertid, som en hvilken som helst annen teknologi, fluorescerende-basert bildedannende fremgangsmåter har sine ulemper. En av dem er manglende evne til machine generert lavenergi fotoner til å trenge i tilstrekkelig dybde. For således å minimalisere mengden av diffust vev fotoner dyrene skal avbildes i forskjellige vinkler. Vi beskriver en protokoll for å etablere en ip eggstokkreft i nakne mus og en tilnærming for ip svulst overvåking som gir hele dyr avbildning gjennom rotasjon. Rotatoren vinkler musen til bestemte stillinger og repeterbare avtagende vevet forstyrrelser som ofte forekommer mellom lyskilden og detektoren. Dette optimaliserer visualisering av mindre svulster som ellers kan gå glipp av.
Vi beskriver en protokoll for å etablere en ip menneskelig eggstokkreft dyremodell som etterligner den kliniske profilen observert hos pasienter. I tillegg, beskriver vi bruken av et dyr rotasjonsanordning som løser følsomheten begrensning av 2D-avbildning. Til sammen kan disse teknikkene fungere som plattformer for å oppdage nye forbindelser som kan målrette kjemoresistent vendende eggstokkreft. I tillegg kan en slik modell brukes til å forstå den biologiske tilbakefall av kreft og progresjon.
På grunn av sin retroperitoneal beliggenhet, tidlig stadium ip eggstokkreft xenografts er nesten umulig å oppdage ved fysisk å undersøke musen. I de fleste tilfeller, når sykdommen kan palperes, er tumorbyrde allerede betydelig, og derfor begrenser evaluering av behandlingseffekten. Bruken av fluorescerende merkede celler gjør det mulig for oss å bedømme etablering av tumor ip i sann tid, og følgelig å identifisere det optimale tidspunkt for å begynne treatment. På lignende måte, fluorescensmerkede xenotransplantater tillate overvåking av behandlingsrespons. Det skal påpekes imidlertid at ut-ip tumorer dypere enn 1 cm er vanligvis ikke påvisbar uavhengig av reportersystem.
Bruken av menneskelige eggstokkreft stamceller 14,15,17,22 genererer xenografts som etterligner den kliniske profilen observert hos pasienter. Som en primær sykdom, er modellen lydhør overfor Paclitaxel men avsluttet behandling til slutt fører til kjemoresistent tilbakevendende sykdom. Vi presenterer cellene gjennom livmor horn på tettheten angitt i protokollen delen resulterer vanligvis i ovarietumorer innen 10 dager med noen få peritoneal implantater, og derfor etterligner tidlig stadium sykdom. Bruken av fluorescerende merkede celler tillater oss å vurdere etablering av tumor ip i sanntid og følgelig identifiserer den optimale tid for å begynne behandlingen. På lignende måte, fluorescensmerkede xenotransplantater tillate overvåkning of respons på behandling. Hvis andre typer kreft-cellelinjer blir anvendt, ovarial eller på annen måte, er det mulig at denne profil ikke kan observeres. Når SKOV3 brukes for eksempel, har det blitt rapportert at de innledende ip tumorer allerede er motstandsdyktig 23. Likevel, hvis merket med en rapportør slik som fluorescens, ip, sykdommen kan bli fulgt i sanntid.
Dersom annet fluorescerende reporter anvendes, er det viktig å utføre innledende avbildning med en kontroll (ingen tumor) dyr. Dette vil tillate optimalisering av bilde protokollen for å oppnå best mulig bakgrunn for å signalisere forholdet. I vår erfaring, nakne mus vanligvis har høy bakgrunn når avbildes ved hjelp av GFP oppkjøps innstillinger.
Det er viktig at cellene injisert intra-uterin er i enkelt suspensjon for å unngå etablering av tumorer i livmor. Det er også viktig å unngå riper i livmor epitellaget, noe som også letter innpoding av kreftcellens i livmoren og dermed produsere en intra-uterin tumor i stedet for en ip sykdom. I tillegg, under analyse av data, er det viktig å angi at gamma-verdien til 1. Dette sikrer at intensiteten av bildene er lineær og tillater sammenligning mellom bildene.
Under oppkjøpet av Mars-bilder, er det viktig å sikre at tubed slutten av den sammen nosecone er i nosecone fordypningen. Den nosecone fungerer som et kontaktpunkt for mus og er derfor nødvendig for å få nøyaktig kalibrert vinkler. For lengre bildebehandling protokoller (dvs. lenger enn 1 time), injisere 100 mL sterilt saltvann subkutant for å hindre dehydrering. Animalsk kroppstemperatur skal opprettholdes ved hjelp av varm luft strømmet gjennom systemet ved omtrent 37 ° C. En begrensning av den MARS system er at kun ett dyr kan avbildes på en gang med en total kjøretid på ca. 1 time pr dyr.
Avslutningsvis beskriver vi establishment av en dyremodell som etterligner eggstokkreft, både primær og tilbakevendende sykdom. Denne modellen kan brukes til å evaluere effekten av nye diagnostiske eller terapeutiske modaliteter.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av NIH tilskudd RO1CA118678 og RO1CA127913, ved Sands Family Foundation, og Discovery å kurere Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |