We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.
Äggstockscancer är den mest dödliga gynekologisk malignitet i USA. Även patienter som initialt svarar på dagens standardbehandling bestående av kirurgisk debulking och kombinationskemoterapi som består av platina och taxanföreningar, nästan 90% av patienterna återkommer inom några år. Hos dessa patienter utvecklingen av kemoterapiresistent sjukdom begränsar effekten över annonser för kemoterapeutiska medel och bidrar till den höga dödligheten alltså. Att upptäcka nya terapialternativ som kan rikta återkommande sjukdom, är lämpliga djurmodeller som nära efterliknar den kliniska profilen hos patienter med återkommande äggstockscancer krävs. Utmaningen i att övervaka intraperitonealt (ip) sjukdomen begränsar användningen av ip-modeller och därmed de flesta xenografter är etablerade subkutant. Vi har utvecklat en känslig optisk avbildning plattform som tillåter detektering och anatomiska lokaliseringen av ip tumörmassa. Plattformen inkluderar usig av optiska reportrar som sträcker sig från det synliga ljusområdet till nära infrarött, som i kombination med 2-dimensionell röntgen co-registrering kan ge anatomisk lokalisering av molekylära signaler. Detektering förbättras signifikant genom användning av ett rotationssystem som driver djuret till flera vinkellägen för 360 graders avbildning, vilket möjliggör identifiering av tumörer som inte är synliga i enda orientering. Denna plattform ger en unik modell för att icke-invasivt monitor tumörtillväxt och utvärdera effekten av nya terapier för förebyggande eller behandling av återkommande äggstockscancer.
Djurmodeller är oumbärliga verktyg för biovetenskaplig forskning. I cancer i synnerhet, data som erhållits från djurstudier ge nödvändig information som krävs för att inleda testningen av nya diagnostiska eller terapeutiska tillämpningar hos människor 1-3. Djurmodeller för solida cancrar är klassiskt etablerade subkutant, eftersom det är ett enkelt sätt att mäta tumörbördan och utvärdera behandlingseffekt utan att behöva offra djuren. Indeed, intra-peritoneala (ip) modeller kräver att djur offras för att detektera och mäta eventuella förändringar i tumörtillväxt. Men för ip cancerformer äggstockscancer, ortotropiska modeller erbjuder fördelen att studera sjukdomen i sin rätta miljö 4-6. För att en sådan modell för att vara användbar vid utvärdering av antitumöraktivitet, icke-invasiva avbildningsmetoder behöver utvecklas som tillåter kvantifiering av ip tumörbörda i levande möss.
En stor utmaning ianvändning av ip djurmodeller är svårigheten att exakt kvantifiera tumörbörda genom fysisk undersökning. Exakt kvantifiering av ip tumörer kräver vanligtvis mössen som ska offras för dissekering. Detta tillvägagångssätt kräver användning av stora antal djur, som skulle offras vid olika tidpunkter. Utöver kostnaden införs hög data variabilitet till följd av inneboende variationer inom varje djur. Icke-invasiv in vivo optisk avbildning ger en mer passande metod för att övervaka ip tumörbördan i levande möss.
Flera icke-invasiva avbildningsmetoder används för närvarande i preklinisk forskning för övervakning av tumörtillväxt och terapisvar. Dessa innefattar datortomografi (CT), ultraljud (US), magnetresonansavbildning (MRI), positronemissionstomografi (PET), och optisk avbildning såsom fluorescens och bioluminescens 7-12. CT är en transmissionsavbildningsprocess kombinerar röntgen och computER-teknik. Den producerar ett tvärsnitt bild av detekterade strålar med hög energi fotonen, som passerar genom kroppen med olika hastighet. USA är en typ av reflektionsbild, som skickar högfrekventa ljud till kroppens skapa ljudvågor som reflekteras med olika hastighet beroende på vävnadsdensitet och känns igen av datorn för att producera en visuell bild. MRI och PET är avbildningsutsläpps modaliteter som använder magnetisk energi och kärnpartiklar, respektive för att producera en bild. MRI skapar ett starkt magnetfält som inducerar celler att producera egna radiofrekvenser som används för att skapa en bild, medan PET kräver en känslig kamera för att upptäcka radioaktivitet administreras märkt 2-fluorodeoxy-D-glukos 7,9,11. Slutligen är optisk avbildning baserad på detektering av det emitterade ljuset av bioluminiscerande eller fluorescerande reportrar eller prober 9,12.
I denna rapport beskriver vi användandet av fluorescens, som erbjudernågra fördelar jämfört med de andra typerna av avbildningsmetoder. Med fluorescens avbildning kan celler manipuleras genetiskt för att uttrycka fluorescerande proteiner kontinuerligt utan att erfordra tillsats av ett substrat eller ligerings-baserad prober, vilka är erforderliga för bioluminescens och magnetisk resonanstomografi, respektive. Fluorescens reportrar också typiskt uttryck för en ljusare signal vilket gör det möjligt att använda en mindre känslig detektionsmetod 8,12. Dessutom är det med fluorescens avbildning möjligt att detektera tumörer som är mindre än 1 cm, vilket inte kan uppnås med CT 7-9. Slutligen, i motsats till bioluminiscens, fluorescenssignal kräver inte en aerob miljö och som därför signalen inte är begränsad i hypoxiska miljöer, som vanligtvis förekommer i kärnorna i stora tumörer 13.
Men som all annan teknik, lysrörsbaserade avbildningsmetoder har sina nackdelar. Varav en är oförmåga machine genererade låg energi fotoner för att tränga in till ett tillräckligt djup. Således, för att minimera mängden diffunderade vävnads fotoner djuren ska avbildas i olika vinklar. Vi beskriver ett protokoll för att upprätta en ip äggstockscancer i nakna möss och ett tillvägagångssätt för ip tumörövervakning som ger hela djuret avbildning genom rotation. Rotator vinklar musen till specifika och repeterbara positioner minskande vävnaden störningar som ofta uppstår mellan ljuskällan och detektorn. Detta optimerar visualisering av mindre tumörer som annars kan missas.
Vi beskriver ett protokoll för att upprätta en ip human äggstockscancer djurmodell som efterliknar den kliniska profilen hos patienter. Dessutom beskriver vi användningen av en djurrotationsanordning som adresserar känsligheten begränsning av 2D-avbildning. Sammantaget kan dessa tekniker användas som plattformar för att upptäcka nya föreningar som kan rikta kemoresistenta recidiverande äggstockscancer. Dessutom kan en sådan modell kan användas för att förstå biologi cancerrecurrence och progression.
På grund av dess retroperitoneal läge, tidigt stadium ip äggstockscancer xenografter är nästan omöjligt att upptäcka genom att fysiskt undersöka musen. I de flesta fall, så snart sjukdomen kan palperas, är tumörbördan redan betydande och begränsar utvärdering av behandlingseffektivitet därför. Användningen av fluorescensmärkta celler tillåter oss att bedöma om ip tumör i realtid och därmed identifiera den optimala tiden för att börja treatment. På ett liknande sätt, fluorescensmärkta xenografter möjliggöra övervakning av behandlingssvar. Det bör påpekas-påpekar emellertid att ip tumörer djupare än 1 cm är vanligen inte detekterbar oberoende av reportersystem.
Användningen av mänskliga äggstockscancerstamceller 14,15,17,22 genererar xenotransplantat som efterliknar den kliniska profilen hos patienter. Som en primär sjukdom, är modellen svarar på Paclitaxel men avslutad behandling leder så småningom till kemoresistenta återkommande sjukdom. Presentation av cellerna genom livmoderhornen på densiteten anges i det protokoll avsnittet oftast resulterar i äggstockstumörer inom 10 dagar med ett fåtal peritoneal implantat, och därför härmar tidigt stadium av sjukdomen. Användningen av fluorescensmärkta celler tillåter oss att bedöma om ip tumör i realtid och därmed identifiera den optimala tiden för att börja behandlingen. På ett liknande sätt, fluorescensmärkta xenografter möjligt att övervaka of svar på behandlingen. Om andra typer av cancercellinjer används, äggstocks- eller på annat sätt, är det möjligt att denna profil inte kan observeras. När SKOV3 används till exempel, har det rapporterats att de ursprungliga ip tumörer är redan resistenta 23. Icke desto mindre, om märkt med en reporter såsom fluorescens, ip, sjukdomar kan följas i realtid.
Om andra fluorescerande reporter användes, är det viktigt att utföra inledande avbildning med en kontroll (ingen tumör) djur. Detta kommer att möjliggöra optimering av bildprotokoll för att uppnå den bästa bakgrunden till signalförhållande. Vår erfarenhet är nakna möss har normalt hög bakgrund när avbildas med hjälp av GFP förvärvsinställningarna.
Det är viktigt att celler injicerade intrauterin finns i enstaka fjädring för att undvika att inrätta tumörer i livmodern. Det är också viktigt att undvika att repa livmoder epitelskiktet, vilket också underlättar inympning av cancercellens i livmodern således skapas en intrauterin tumör i stället för en ip sjukdom. Dessutom, under analys av data, är det viktigt att ställa in gammavärdet till 1. Detta säkerställer att intensiteten hos bilderna är linjär och möjliggör jämförelse mellan bilderna.
Under förvärvs av MARS-bilder är det viktigt att säkerställa att den tubed änden av den hopfällbara noskonen är i noskonen urtagningen. Noskonen fungerar som en kontaktpunkt för musen och krävs därför för att få exakt kalibrerade vinklar. För längre avbildningsprotokoll (dvs mer än 1 timme), injicera 100 ul steril saltlösning subkutant för att förhindra uttorkning. Djurkroppstemperaturen bör upprätthållas med hjälp av varm luft strömmade genom systemet vid ca 37 ° C. En begränsning av Mars-systemet är att endast ett djur kan avbildas på en gång med en total körtid av omkring 1 timme per djur.
Sammanfattningsvis beskriver vi establishment av en djurmodell som nära efterliknar äggstockscancer, både primär och återkommande sjukdom. Denna modell kan användas för att utvärdera effekten av nya diagnostiska eller terapeutiska modaliteter.
The authors have nothing to disclose.
Denna studie stöddes av NIH bidrag RO1CA118678 och RO1CA127913, vid Sands Family Foundation, och Discovery för att bota Program.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RPMI 1640 media | GIBCO, by Life Technologies | 23400-021 | |
fetal bovine serum | Gemini Bioproducts | 100-106 | |
T75 cell culture flasks | Corning | 430641 | |
PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
Trypsin | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
Isoflurane | Butler Schein | NDC 11695-6776-1 | |
Alcohol pads | Fischer Scientific | 06-669-62 | |
1 ml syringe | Becton Dickinson | 309602 | |
25 gauge needle | Becton Dickinson | 305122 | |
synthetic absorbable suture | Covidien | SL-636 | |
tissue adhesive | Vetbond | 1469SB | |
surgical scissors | VWR | 82027-584 | |
surgical forceps | VWR | 82027-386 | |
hemostat | VWR | 82027-422 | |
Paclitaxel | Hospira, Inc. | NDC 61703-345-50 | |
Ibuprofen | Walgreens | Children's Ibuprofen 100 (100 mg/5ml) | |
Puralube Vet ointment | Pharmaderm | ||
In vivo MS FX PRO | Bruker Corporation | ||
MI software | Bruker Corporation | ||
athymic nude mice | Harlan |