Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان

Published: September 5, 2014 doi: 10.3791/51824
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2,3
1Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Geology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Microbiology, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

وقد تم تطبيق مجموعة متكاملة من تقنيات التصوير لتحديد مورفولوجيا سليلة وهيكل الأنسجة في الشعاب المرجانية بالبحر الكاريبي Montastraea الحلقي وم. faveolata. مضان، التسلسلي وجه كتلة، واثنين من الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر وقد حدد هيكل lobate، سليلة الجدران، وحامل الصباغ المقدرة وكثافة زوزانتلي والتوزيعات.

Abstract

وقد تم تطبيق مجموعة متكاملة من تقنيات التصوير لتحديد ثلاثي الأبعاد (3D) مورفولوجيا والهيكل الخلوي للأنسجة سليلة تضم الشعاب المرجانية بناء الشعاب المرجانية الكاريبي Montastraea الحلقي وم. faveolata. وتشمل هذه النهج المجهري مضان (FM)، وكتلة التسلسلي وجه التصوير (SBFI)، واثنين من الفوتون الليزر متحد البؤر المجهر (TPLSM). يوفر SBFI التصوير الأنسجة العميقة بعد باجتزاء المادي؛ أنها تبين بالتفصيل نسيج السطح الأنسجة والتصور 3D إلى أعماق الأنسجة أكثر من 2 ملم. FM التكميلي والعائد TPLSM الصور دقة عالية جدا عالية من الأنسجة بنية الخلية. وقد النتائج: (1) تحديد المبلغ عنه سابقا الأشكال التضاريسية الأنسجة lobate على الجدار الخارجي للالبوليبات المرجانية الفردية و(2) خلق الخرائط السطحية الأولى من توزيع كثافة 3D والأنسجة من chromatophores وendosymbionts دوامي السياط زوزانتلي تشبه الطحالب. البازلاء امتصاص الطيفيKS 500 نانومتر و 675 نانومتر، على التوالي، تشير إلى أن م. الحلقي وم. faveolata تحتوي على أنواع مماثلة من الكلوروفيل وchromatophores. ومع ذلك، M. الحلقي وم. faveolata تظهر اختلافات كبيرة في كثافة الأنسجة وتوزيع 3D من هذه المكونات الخلوية الأساسية. هذه الدراسة تركز على أساليب التصوير تشير إلى أن SBFI مفيد للغاية لتحليل عينات مم على نطاق كبير من الأنسجة المرجانية decalcified. FM مجانية وTPLSM خفية تكشف التغيرات الواسعة في التوزيع دون المليمتر الخلوي وكثافة في nondecalcified عينات الأنسجة المرجانية. هذه التقنية تتيح TPLSM: (1) مينيملي إعداد العينات، (2) متفوقة باجتزاء القدرة البصرية، و (3) الحد الأدنى من امتصاص الضوء وتشتت، في حين لا يزال يسمح التصوير الأنسجة العميقة.

Introduction

ظاهرة الاحتباس الحراري والتغير البيئي المصاحب تؤثر مباشرة على صحة وتوزيع الشعاب المرجانية البحرية الاستوائية 1-4. ويجري الاحتفال آثار متعددة، بما في ذلك تبييض المرجان وظهور الأمراض المعدية 5-6. ومع ذلك، فإن التنبؤ أكثر دقة للاستجابة المرجانية المستقبلية لهذه التهديدات البيئية تتطلب أن "الأساس" النسيجي أن تنشأ، والذي يحدد مورفولوجيا الأنسجة وتكوين خلايا وتوزيع الشعاب المرجانية "اصحاء". بدوره، "أثر" ويمكن بعد ذلك المرجان يمكن مقارنة كميا. وعلاوة على ذلك، ينبغي إنشاء خط الأساس لهذه الشعاب المرجانية يبدو صحية في إطار مجموعة من الظروف البيئية، حتى أن "استجابة صحية" كما يمكن قياسه عبر التدرجات البيئية. كخطوة أولى نحو إنشاء هذا الأساس، تم إجراء دراسة 3D عالية الدقة كيف يبدو المرجانية صحي الأنسجة سليلةالتشكل والتكوين الخلوي يستجيب إلى زيادات في عمق المياه (WD) وانخفاض المرفقة في ضوء الشمس الساقط. ويمكن بعد ذلك أن تستخدم النتائج للتوصل إلى فهم الآلية أشمل من التكيف المرجانية، وكذلك لاكتساب نظرة ثاقبة التطور-المرجانية المتكافل وتعزيز حصاد الضوء.

الشعاب المرجانية الحجرية (Scleractinia) هي الحيوانات اللافقارية البحرية الاستعمارية التي تلعب المضيفة لتجميع معقدة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى، يشار إليها مجتمعة ب holobiont المرجان 7-10. يسعى البحوث التي أجريت في هذه الدراسة إلى استخدام مجموعة من تقنيات التصوير المتطورة لتعقب التغييرات في وقت واحد مع تزايد عمق المياه في أصباغ الأنسجة وزوزانتلي التكافلية من الشعاب المرجانية المضيفة على ما يبدو صحية. هذا سوف إنشاء خلية الأنسجة المقارنة "خط الأساس" المطلوبة عبر التدرج الأعماق لالشعاب المرجانية يبدو صحية ويكون بمثابة مؤشرات التدفئة المرجانيةLTH 10. أصباغ المرجانية، ودعا chromatophores، تعمل على امتصاص، تعكس، مبعثر، ينكسر، حيد الضوء، أو التدخل خلاف مع الحادث الإشعاع الشمسي 11. وقد مكن العلاقة endosymbiotic-زوزانتلي حامل الصباغ في coevolution من المفيد استراتيجيا الأمثل حصاد الضوء واستراتيجيات النمو والهيكل العظمي، وكذلك اللدونة الغذائية (استراتيجيات التغذية التحول ذهابا وإيابا من ذاتية التغذي إلى اضطراب تغذوي) للحيوان المرجان 12.

الأمة جنوب البحر الكاريبي جزيرة كوراساو (سابقا جزء من جزر الأنتيل الهولندية) تقع حوالي 65 كم من شمال فنزويلا ضمن الغربي الشرقي تتجه أروبا، لا Blanquilla أرخبيل (الشكل 1A). الساحل الجنوبي 70 كم كوراساو يحتوي على الحديث المستمر والميوسين، العصر الحديث، العصر الجليدي-الهولوسين القديم التهديب الشعاب المرجانية المسالك 13،14. يعني SST السنوي في كوراساو تختلف حوالي 3 ° C لnually، بدءا من حد أدنى من 26 درجة مئوية في أواخر يناير كانون الثاني لمدة أقصاها 29 درجة مئوية في أوائل سبتمبر، مع متوسط ​​درجة الحرارة السنوي 27.5 ± 0.5 درجة مئوية (NOAA SST سجلات، 2000-2010). الشعاب المرجانية في بلايا كالكي (12 ° 22'31.63 "N، 69 ° 09'29.62" W)، والكذب بالقرب من الطرف الشمالي الغربي من جزر الأنتيل (الشكل 1A)، وقد تم اختيار لأخذ العينات لأنها كانت سابقا المدروس جيدا و واستحم النظام البيئي البحري في هذا الموقع في مياه البحر الطازجة 7،15-19 nonpolluted. اثنان وثيقة الصلة الأنواع المرجانية scleractinian، M. الحلقي وM faveolata، تم اختيار للتجريب والتحليل في هذه الدراسة لأن كل الأنواع: (1) معارض مختلفة بوضوح وغير المتداخلة توزيعات الأعماق على الجهاز الشعاب فيما يتعلق كسر الرف و يرتبط الرسوبية كربونات بيئات الترسيب (م. مجموعة الحلقي = 0-10 م WD، M. faveolataمجموعة = 10-20 م WD 20؛ أرقام 1B، 2A، 2B و). (2) هو إطار الشعاب المرجانية المشترك البناء في جميع أنحاء البحر الكاريبي 21؛ و (3) لديها مدروسة البيئية والفسيولوجية، والعلاقات التطورية 22.

أجري أخذ العينات الميدانية لهذه الدراسة باستخدام تقنيات الغوص القياسية في الخارج من بلايا كالكي في كوراساو. وأنشئ الضحلة إلى المياه العميقة قياس الأعماق المسح الشامل الذي ركض عبر الرف، خلال عطلة الرف، وإلى بيئات الشعاب الصدارة في المياه العميقة. على ما يبدو ثم تم تحديد رؤساء المرجانية صحي لأخذ العينات على طول هذه القطع الأعماق، بما في ذلك: (1) ثلاث فرد ~ 1 م رؤساء قطرها المرجانية من M. الحلقي، وكلها كانت في 5 متر عمق المياه (WD). و (2) ثلاثة الفرد ~ 1 م رؤساء قطرها المرجانية من M. faveolata، وكلها كانت في 12 م WD. وتم قياس التمثيل الضوئي الإشعاع النشط (PAR) كما 33-36٪ P AR في 5 م WD و18-22٪ PAR في 10 م WD. أجري أخذ العينات في يناير كانون الثاني عندما كانت طائرة أسرع من الصوت 26 درجة مئوية في أعماق المياه على حد سواء 5 م و 12 م. وأخذت عينات كل من هذه الرؤوس المرجانية ستة في ثلاث نسخ على مواقع المكانية أي ما يعادل (أي ما يقارب 45 ° N خط العرض على كل من ستة رؤساء المرجانية نصف كروية). وتألفت كل عينة الفردية ل2.5 سم القطر الشعاب الهيكل العظمي الأنسجة الخزعة الأساسية التي تم جمعها مع لكمة قوس تنظيفها. أخذت عينات الخزعات ثلاثة الأنسجة الهيكل العظمي المرجانية على الغوص قياسي بأيد القفاز من كل من رؤساء المرجانية (9 من م. حلقية المستعمرات في 5 م WD و 9 من faveolata م في 12 م WD). فور جمع في العمق، وضعت كل عينة خزعة الأساسية في العقيمة 50 مل أنبوب البولي بروبلين الطرد المركزي، المسمار أعلى مختومة، وعاد إلى السطح. ويصب في مياه البحر من كل أنبوب الطرد المركزي ثم تم مغمورة كل خزعة الأساسية وتخزينها ونقلها في بارافورمالدهيد 4٪.

"jove_content"> وقد سبق إجراء التصوير SBFI على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية، بما في ذلك كامل الدماغ والأنسجة البشرية كله القلب، أجنة فئران سليمة، وأجنة سمك الزرد، وأنواع متعددة من عينات الحيوانات مع عظام سليمة 23-30. معظم هذه الدراسات تستخدم البصرية / المجهر الضوئي مع أي مضان أو تقنيات الحقل مشرق. ومع ذلك، فقد أجريت دراسات في تكبير عالية جدا باستخدام المسح الإلكترون كتلة التسلسلي التصوير وجه في 31 الماضي. في هذه الدراسة، تم وضع بروتوكول لتعديل SBFI وتطبيقها على الشعب المرجانية لأول مرة. لأن M. الحلقي وم. البوليبات المرجانية faveolata هي 1-2 مم في السمك، فإن أيا من تقنيات الفحص المجهري الخفيفة الروتينية تكون قادرة على اختراق سماكة كامل من الأنسجة سليلة المرجانية. بالتالي، لدينا SBFI بروتوكول إعداد العينات التي صممت خصيصا لعينات المرجانية. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتصميم مخصص حامل stereomicroscopeالذي بمحركات التحرك في كلا الاتجاهين x و ذ. هذا الجهاز يأخذ الصور من الوجه كتلة من العينة بدلا من جمع الأقسام باستخدام مشراح منتظم أمام المجهر. قدمنا ​​أيضا تقنية أخرى غير الخطية البصرية ثنائي الفوتون المجهري لصورة نفس الشعاب المرجانية في جميع أنحاء سمك كامل من الأنسجة المرجانية. هذا يتغلب على القيود التي تفرضها SBFI من حيث زوال الكلس وإمكانية حدوث تغيرات في مورفولوجيا الأنسجة وحجم (تقلص) التي قد يسببها إعداد العينات (الجفاف) وبروتوكولات المعالجة. وعلاوة على ذلك، تم حل لمحات الانبعاثات من الشعاب المرجانية طيفيا لتحديد الانبعاثات ذروتها والاختلافات بين chromatophores وزوزانتلي الضوئي. تم تقييم هذه النتائج في سياق الطريقة المستخدمة والمزايا الفردية بشأن اكتساب الوقت، وقت التحليل، والقدرة على حل التفاصيل الهيكلية غرامة دون المساس شارعسلامة uctural من الأنسجة المرجانية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: الكواشف أن تكون مستعدة لالمسلسل بلوك التصوير وجه عينات المرجان

1. Preinfiltration الشمع

  1. تذوب 3.6 غرام من رقائق ستيرين في كوب زجاجي. تخلط جيدا على طبق ساخن (60-70 درجة مئوية).
  2. إضافة 400 ملغ من السودان الرابع (لتقليل الشمع مضان الخلفية). تخلط جيدا وانتظر حتى يتم التوصل إلى حل شفاف أحمر.
  3. إضافة البرافين المنصهر 96 مل الساخن (100٪) وتخلط جيدا.

1.2) تضمين الشمع

  1. تذوب 7.2 غرام من رقائق ستيرين في كوب زجاجي وتخلط جيدا على طبق ساخن (60-70 درجة مئوية).
  2. إضافة 0.8 غرام من السودان IV. تخلط جيدا وانتظر حتى يتم التوصل إلى حل شفاف أحمر.
  3. إضافة حبيبات البارافين (162 غرام) وتخلط حتى يذوب تماما البارافين.
  4. إضافة 30 غرام من حبيبات بيضاء Vybar وتذوب تماما في نفس الدورق. مرة واحدة ذابت، المزيج.
  5. فضفاضة إغلاق زجاجة مع غطاء. وضع زجاجة في 60 ° C الحمل الحراري اوفأون للحفاظ على المكونات في حالة سائلة. تنفيذ جميع عمليات التسلل في هذا الفرن.
  6. تقسيم إجمالي حجم 200 مل بالشمع الأحمر في لاثنين من قوارير زجاجية سعة 100 مل لكل منهما. استخدام قسامة واحدة للتسلل والآخر لتضمين النهائي.

1.3) تضمين كورال الأنسجة عن المسلسل بلوك التصوير الوجه

  1. غسل الشعاب المرجانية التي تم جمعها في الميدان (SI فيديو 1) وتخزينها (3-6 أشهر في 4-5 درجة مئوية في امتصاص العرق) في الفوسفات مخزنة المالحة (3X 5 دقائق) وعندما يزيل الكلس جاهزة للتصوير. يزيل الكلس الاورام الحميدة في حل ExCal لمدة 24 ساعة أو حتى مثل الاورام الحميدة هي خالية تماما من كربونات الكالسيوم 3. احتضان العديد من الشعاب المرجانية decalcified ككتلة واحدة في 25، 50، 75، و 100٪ سلسلة الإيثانول، تليها 1X الزيلين بديلا ليذوى العينات.
  2. وضع الاورام الحميدة معالجتها في مسخن الفرن 65 درجة مئوية تحتوي على 100٪ الزيلين بديلا. احتضان لمدة 30 دقيقة مرتين من قبل شانغينانوغرام إلى حل جديد. توجيه الاورام الحميدة في مثل هذه الطريقة أن الجزء العلوي من الاورام الحميدة ويواجه أسفل السطح العلوي مسطح قدر الإمكان.
  3. جعل الحلول من 2: 1، 1: 1، و 1: 2 الزيلين بديلا والشمع preinfiltration (الخطوة 1.1) في 50 مل أنابيب فالكون.
  4. احتضان الشعاب المرجانية مع هذه التركيزات المتزايدة ثلاثة من الشمع preinfiltration، تليها 3X في الحضانة 100٪ preinfiltration الشمع لمدة 30-60 دقيقة في كل مرة.
  5. ملاحظة: اعتمادا على سماكة من العينات، خطوات 1.3.1-1.3.5 يمكن زيادة مع فترات أطول من الوقت.
  6. نقل العينات إلى تضمين الشمع (راجع الخطوة 1.2.6) بعد الحضانة 3X في 100٪ preinfiltration الشمع.
  7. إزالة الشمع تضمين بعد 30 دقيقة. استبدال بالشمع تضمين الطازجة وتستمر الحضانة لمدة لا تقل عن 4 ساعة عند 65 درجة مئوية.

1.4) وتضمينها في الشمع الأحمر

  1. تصوير كتلة (علبة الفولاذ المقاوم للصدأ حيث يتم وضع الشمع الأبيض وعلى رأسها وساميوضع سبيل). هذا ضروري لأن جزءا لا يتجزأ من مرة واحدة في الشمع، وموقع العينة تصبح غير مرئية كما الشمع الأحمر التضمين هو معتم.
  2. وضع قطرات صغيرة من الشمع نقطة انصهار عالية في جميع أنحاء الفولاذ المقاوم للصدأ مسخن قالب جديد التضمين والسماح لتبرد. صب كمية صغيرة من شمع ذاب حديثا التضمين من الحاويات الثانية كما جاء في الخطوة 1.2.6.
  3. ضع سليلة المرجانية أسفل بسرعة على الشمع نقطة بيضاء، ثم وضع حامل عينة من البلاستيك على علبة الفولاذ المقاوم للصدأ وصب الشمع أكثر التضمين بحيث الشمع يأتي إلى سطح قالب من البلاستيك.
  4. اتخاذ الإعداد بأكمله من 65 درجة مئوية الفرن والسماح لتبرد على مقعد أو سطح بارد حتى الشمع يصلب تماما.
  5. قد يستغرق ما يصل إلى 6 ساعة يوم أو يومين. وضع كتلة المجفف في الثلاجة على 4 درجات مئوية، محمية من الضوء، للتخزين على المدى الطويل.

1.5) باجتزاء المسلسل في الإعداد بلوك الوجه

  1. TRايم كتلة وقطع 1 ميكرومتر المقاطع باستخدام مشراح. لا نجمع الأجزاء لأنها سوف تصبح مثل المسحوق. نتذكر، نحن فقط تصوير الوجه كتلة. تظهر عينة عندما يبدأ الشمع الأبيض لتختفي.
  2. التقاط الصور من الوجه كتلة السلس الذي يحتوي على العينة في كل مرة تتم إزالة القسم. تستمر حتى يختفي سليلة المرجانية كما في SI فيديو 2.
  3. سجل / التقاط الصور مع كاميرا أحادية اللون باستخدام فلتر FITC الفلورسنت لالتقاط لصناعة السيارات في مضان من chromatophores / سليلة المرجانية. الصورة 3-4 النوى decalcified من كل الأنواع.

2. التصوير المرجان تحت ثنائي الفوتون المجهر مضان

  1. إصلاح النوى سليلة المرجانية، تحتوي كل منها على حوالي 10-12 الزوائد عن شبر واحد في قطر، في بارافورمالدهيد 4٪ في موقع جمع (شاطئ البحر) في أقرب وقت يتم حصادها تحت الماء.
  2. الاحتفاظ بعينات عند 4 درجات مئوية حتى التصوير. توضع النوى غسلها في عشرالبريد نفس الحل رأسا على عقب في طبق زجاج الغطاء السفلي (0.17 مم).
  3. باستخدام الليزر اثنين الفوتون في 780 نانومتر الإثارة، صورة 3-4 الاورام الحميدة في اثنين من تكبير مختلفة (تقريب رقمي) باستخدام (NA 0.3) الهدف 10X. شكل سليلة المرجانية وارتفاع يتراوح بين العينات (عادة 1-2 ملم) وعمق التصوير يقتصر أيضا من خلال المسافة العمل الهدف من التصوير.
  4. استخدام وضع مسح البلاط لجمع ما يقرب من 25-100 (5 × 5 أو 10 × 10 البلاط) صورة في المستوى البؤري في س ص 50-100 والصور من خلال المحور z في فترة 10 أو 20 ميكرون، بلغ مجموعها حوالي 5،000-10،000 صور / سليلة المرجانية.
  5. صورة 3:57 مناطق سليلة لتمثيل الأنواع الأساسية والمرجان. ملاحظة: صورة اكتساب الوقت يتراوح بين 2-5 ساعة / منطقة سليلة.
  6. تخزين جميع الصور في تنسيق البيانات الخام في القرص الثابت للنظام كما LSM 5. تجسيد 3D في تحليل صورة 3D وتقديم البرامج.

3. 3D جعل حجم وVisualizatioن من SBFI وثنائي الفوتون الطيفي الإسفار البيانات

  1. اقتصاص البيانات 2D إلى تقليل حجم الملف من خلال التركيز على سليلة واحدة باستخدام أداة الاقتصاص مربع في البرنامج وتجميع كملف TIFF واحد (تقليل حجم الملف أيضا عن طريق حفظ الملف في شكل 8 بت) في البرنامج الاستحواذ.
  2. فتح ملفات تجميعها من البيانات SBFI (جمعها في الخطوة 1.5.1) أو مزينة بالبلاط متعددة ض أكوام من المقاطع البصرية اثنين من الفوتون (جمعها في الخطوة 2.1.4) في برنامج Imaris فق حدة تحت خوارزمية الحجم.
  3. المشروع SBFI البيانات المقدمة في 3D باستخدام الإسقاط الظل. خلق وضع isosurface حيث thresholded في voxels لخلق نمط سطح صلب (SI فيديو 3).
  4. تصور التوقعات 3D باستخدام خوارزمية الطائرة لقطة في XY، XZ، وطرق المتعامدة YZ للكشف عن هيكل 3D وشكل الشعب المرجانية.
  5. تحريك التوقعات باستخدام وحدة الرسوم المتحركة الإطار الرئيسية في البرنامج نفسه Imaris (SI السادسdeos 3-7).
  6. إنشاء ملفات الفيديو بنسبة 5٪ ضغط وتوليد لقطات الفيلم في شكل افي باستخدام الصوت (SI فيديو 4 و 6)، 3D وطرائق Isosurface (SI فيديو 5 و 7).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

العرف تصميم جهاز SBFI (صنعت خصيصا لهذه الدراسة، الشكل 3) إنتاج أول خرائط مفصلة 3D الرقمية الارتفاع (الديمقراطيين) من نسيج السطح الخارجي ومورفولوجية M. الحلقي وم. البوليبات المرجانية faveolature (الشكل 4 و SI فيديو 1-2). أسفرت هذه الصور من غير موصوف سابقا فصوص مكدسة من الأنسجة المرجانية بتكثف يشع الى الخارج من مركز كل (4B أرقام، 4D، و4E) سليلة. مكدسة هذه الفصوص على طول التلال المغطاة العلوي من الأنسجة الابتدائي والثانوي الحاجز العظمي، مع شعاعيا الأبعد وأدنى طبقات فصوص ارتفاع تجميع في نهاية المطاف والاندماج مع الأنسجة coenosarc بين الاورام الحميدة. و3D سليلة الشكل والفصوص المرتبطة تم الحفاظ عليها بشكل جيد على الرغم من عينة الأنسجة المرجانية بعد أن مرت عدة خطوات من تسلل درجات الحرارة العالية والتضمين. في additioن السودان صبغ ملثمين بنجاح الخلفية ومبهمة، مع أنها ساعدت اللون الأسود إلى تحقيق أقصى قدر من التباين من كل عينة وزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. أظهر 3D ومشاهدة الطائرة المتعامدة توزيع المكونات الفلورسنت على طول المحور Z (الشكل 4B). كانت هناك طائرات مع رقائق الشمع أنه في بعض الأحيان تحجب سليلة التفاصيل السطحية، التي أزيلت من أجل الوضوح عند إنشاء التوقعات. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو في الكشف عن التفاصيل الداخلية لأية عينة سميكة، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى اتخاذ أقسام متعددة ومواءمتها في وقت لاحق. علاوة على ذلك، يتم محاذاة الصور في هذه التقنية بالفعل عندما جمعت (الشكل 4A)، وتوفير قرار من الألف إلى الياء تصل إلى 1 ميكرون من حجم العينة تصل إلى 10 مم أو أكثر (اعتمادا على المسافة بالسيارة الإجمالية للحامل كتلة في مشراح ). فمن الممكن أن تميز مكونات السيارات الفلورسنت مختلفة (باستخدام مرشحات متعددة)، وكذلك الفردزوزانتلي في أعلى التكبير، شريطة مجال خفض نظر هو مقبول.

كشف باجتزاء بصري المجهر مضان ApoTome توزيع خلايا الأنسجة المرجانية (زوزانتلي وchromatophores) وهيكل الأنسجة السطحية في قرار دون المليمتر. وبالتالي، فإن 6-13 ميكرون قطر زوزانتلي يمكن التعرف عليه بسهولة وكميا فيما يتعلق عدد الخلايا في حجم الأنسجة (الشكل 5). اكتساب قناة الصورة المزدوجة باستخدام مضان الكلوروفيل (الخضراء) والمخاط المسمى مع WGB اليكسا 647 (يظهر باللون الأحمر)، عمل الأفضل لقياس مستوى المخاط وعدد زوزانتلي داخل موقع معين من سليلة (الرئيسية والثانوية ويمكن حساب الحاجز من سليلة بشكل مستقل).

بالإضافة إلى هذه الأساليب المجهر، وقد طبقنا أيضا TPLSM، وهي تقنية غير الخطية المستخدمة على نطاق واسع لعينات بيولوجية سميكة. أهم مزايا TPLSM على علىالبريد الليزر الفوتون موجة مستمرة هي: (1) تحدث الإثارة فقط عند نقطة التركيز لقوة كثافة الضوء الإثارة يصبح التربيعية وفرصة للجزيء لاستيعاب اثنين من الفوتونات متتالية لتثير إلكترون واحد من fluorophore محدودة إلى عمق الميدان من الهدف، مما يوفر confocality المتأصلة. و (2) ونتيجة لذلك لن يكون هناك خسارة من الفوتون الإثارة في حين اختراق أعمق في العينة، خلافا ليزر فوتون واحد. بالإضافة إلى ذلك، كما تمتص معظم عينات الأنسجة البيولوجية الضوء المرئي. منذ الإثارة ثنائي الفوتون طويلة بطبيعتها (الأشعة تحت الحمراء في القريب في 780 نانومتر)، وأيضا التقليل بشكل كبير من امتصاص. من ناحية أخرى، والهيكل العظمي المرجانية تتكون من كربونات الكالسيوم بالكاد يمتص أو ينثر الضوء ثنائي الفوتون. أخيرا، وبما أننا مهتمون في تحديد توزيع الكائنات فقط على سطح احيط الهيكل العظمي المرجانية، وجدنا التصوير أعمق باستخدام هذه الطريقة النسخةذ مناسبة للتصوير المرجانية.

حاولنا توصيف طيفية المتاحة في م. الحلقي (الأرقام 6-9). نحن هنا تبين أن تحت 780 نانومتر ثنائي الفوتون الإثارة، وحامل الصباغ لصناعة السيارات في مضان لديه الذروة حوالي 500 نانومتر، بينما يتركز مضان الكلوروفيل من زوزانتلي في حوالي 675 نانومتر (الشكل 6). بينما unmixing هذه البيانات الطيفية (أرقام 6-7) من الممكن أيضا مع خوارزمية unmixing في البرنامج (الشكل 8)، لأنه ليس هناك مسافة الطيفية واضحة بين العنصرين، والتصوير في وقت واحد باستخدام اثنين من أجهزة الكشف في شريطين الانبعاثات ثبت أن تكون معظم تقنيات توفير الوقت. هذا ينطبق بشكل خاص عندما يتم تجانب العينة وتصويرها على مدى كامل عمق 1-2 ملم من الأنسجة. هذا يلغي الحاجة إلى باجتزاء المادي، الأمر الذي يتطلب عدة آلاف من الصور في كل مكان وعينة وسليلة. يا التوزيع و لصناعة السيارات الفلورسنت chromatophores هي أيضا متميزة (الشكل 9) بين اثنين من الأنواع المرجانية التي تم اختبارها. في حالة واحدة، لاحظنا زيادة كبيرة في chromatophores في المياه الضحلة التي تعيش في الشعاب المرجانية م. حلقية بالمقارنة مع المياه العميقة م. faveolata (الشكل 9 و SI فيديو 3 و 4).

الشكل 1
الرقم 1. (A) خريطة كوراساو في بحر الكاريبي الجنوبي، والتي تبين موقع موقع الدراسة في بلايا كالكي على الساحل الشمالي الغربي المواجه للريح بعيدا من الجزيرة. (B) تخطيطي شريحة الجرف المرجانية انعقدت في بلايا كالكي في كوراساو، والتي تبين توزيعات عمق المياه م. الحلقي وم. faveolata. ديزيل / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. (A) في الوضع الطبيعي تحت الماء صورة الميداني في 12 م WD من M. faveolata في بلايا كالكي، كوراساو. (B) عن قرب توسيع الصورة في (A) تظهر الشعاب المرجانية الفردية م. faveolata في ظروف الإضاءة أثناء النهار (كل ورم هو حوالي 2 مم في القطر، وبعضها تراجع، الرمز بواسطة *). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

5in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم التسلسلي 3. كتلة وجه أجهزة التصوير. (A و B) ومصممة خصيصا حامل المجهر، يحمل المجهر Stereolumar في 180 ° تواجه مواجهة كتلة من العينة وضعها في مشراح. عندما تم إزالة كل قسم، تم التقاط الصورة كتلة وجه مع الهدف وتخزين البيانات رقميا 2D. وقد تم ذلك حتى اختفت العينة في الكتلة. يتم نقل المجهر في العاشر والتوجيه ذ باستخدام المسمار الرصاص الآلية وض، يتم إجراء تعديل للتركيز العينة. من المهم أن نلاحظ أنه عندما يتم مقطوع كل 1 ميكرومتر العينة، وتحركات كتلة 1 ميكرومتر إلى الأمام، لذلك إعادة تركيز نطاق ليس من الضروري. XYMOT، عرف بني مرحلة الآلية متعدية س ص. FLS، مصدر ضوء الإسفار. MT، مشراح. MIC، Stereomicroscope. CAM، Axiocam كاميرا أحادية اللون. BH، حامل بلوك. BF، وجه كتلةالعينة. FLL، بقعة ضوء الفلورسنت الإثارة على وجهه كتلة. OBJ، الهدف المجهر. HIP، لوحة واجهة الإنسان. وقد تم جمع صورة واحدة في البعد الأفقي × 1،388 بكسل 1،040 العمودية في وضع أحادية اللون في بكسل س ص القرار (واحد) من 1.25 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم التسلسلي 4. كتلة الوجه تصوير الشعاب المرجانية M. الحلقي وم. faveolata جمعها من بلايا كالكي، كوراساو. البيانات (A) عينة معرض مجموعة صور تظهر حوالي 800 من الصور 2D الفردية تم الحصول عليها من ورم في 1 ميكرون قرار في ض. (B) في عينة المرجانية آخر، ذهب باجتزاء ما يزيد على 2،000 ميكرومتر في ض. صورة تظهر الاورام الحميدة متعددة وتجميع جميع شرائح 2D في 3D إلى وحدة تخزين تحت إسقاط الظل باستخدام خوارزمية حجم التصور Imaris. الإسقاط (C) متعامد تظهر وجهة نظر XZ من العينة في (B)، يمكن للمرء أن يرى عمق بأكمله من العينة أكثر من 2 مم والسهام تشير الخطوط السوداء حيث أزيلت شرائح 2D بسبب نوعية رديئة. هذه الصورة هي من م. الحلقي. حجم 3D (D)، Isosurface تقديم (E) وتصور البيانات SBFI. (D) البوليبات المرجانية متعددة تبين التشكل ورم في المقطع الطولي على جانب وحجم 3D (إسقاط الظل) من ورم واحد في الوسط. باجتزاء والتصور في أي زاوية ممكنة في 3D (انظر الفيديو SI). E. منذ voxels هي غامض في 3D (D)، والسطح 3D Isosurface المقدمة يظهر كفاف من سطح سليلة المرجانية والسياقية الخاصةترتيب مع الاورام الحميدة المجاورة (انظر الفيديو SI). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. مضان المجهري من الشعاب المرجانية. (A) قسم الصليب من سليلة decalcified من م. faveolata زوزانتلي العارضة مع تألق ذاتي الكلوروفيل تحت الضوء الأزرق (كما هو موضح باللون الأخضر) والجيوب المخاطية المسمى مع راصة جنين القمح (كما هو موضح باللون الأحمر) وتصويرها تحت ضوء أحمر. غير المغطى الصورة تلقائيا في قناتين ومخيط ومحاذاة باستخدام برنامج الصك. (ب) توسيع مربع هو مبين في (A)، والتي تبين زوزانتلي الفردية (كل الدوائر الخضراء، يقاربالمطاف 6-8 ميكرون في القطر باللون الأخضر) وطبقة المخاط السطحية (الحمراء)، ودمج كل من القنوات. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6
الرقم 6. ثنائي الفوتون التوصيف الطيفي مضان من الشعاب المرجانية. عن طريق كاشف الطيفي من 710 نظام LSM، تم مسحها من إشارات مضان الطيف المرئي بأكمله (419-722 نانومتر) على عمق حوالي 190 ميكرومتر. تظهر صورة فاصل في عمق 5 ميكرون في محور س للض المكدس والمحور ص هو الطول الموجي 419-722 نانومتر المكتسبة في فترة 10 نانومتر (أي ما مجموعه حوالي 1،154 أظهرت الصور). يمكن للمرء أن نرى اثنين من المكونات الطيفية، واحدة تركزت في 500 نانومتر، والثانية في 650 نانومتر. وexci ليزر ثنائي الفوتونتم استخدام الكساء الطول الموجي من 780 نانومتر للحصول على ملامح الانبعاثات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. توصيف اثنين من عناصر الطيفية. (A) التوصيف الطيفي الخلفية (الأزرق)، وتألق ذاتي من chromatophores (الخضراء) ومضان الكلوروفيل (الحمراء) متحمس من قبل اثنين من الفوتون الإثارة الليزر الطول الموجي من 780 نانومتر الليزر. مشتقة أظهرت الأطياف في الجانب الأيمن من البيانات الطيفية متعدد الألوان مضافين والملونة الزائفة وفقا إلى الوضع الانبعاثات. (ب) صناديق الطيفية الفردية حيث يتم جمع الإشارات في فترة 10 نانومتر لاشتقاق الأطياف والصورة في (A). ملاحظة أن اثنين من عناصر متميزة، واحدة تركز في حوالي 500 نانومتر (حامل الصباغ تألق ذاتي) والآخر على 675 نانومتر (الكلوروفيل مضان). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
الرقم 8. نفس الصور في أرقام 7A و 7B، البيانات الطيفية غير المخلوط باستخدام البرمجيات والمقابلة لها قمم الانبعاثات / الأطياف. وفي كلتا M. الحلقي وم. faveolata، مكونات الطيف متشابهة جدا، وكذلك قمم الانبعاثات. الفرق كبير، ومع ذلك، ويرجع ذلك إلى الموقع من هذه المكونات الطيفية وفرة (انظر الشكل 9).ghres.jpg "الهدف =" _ على بياض "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 9
الرقم 9. ثنائي الفوتون مضان الصور 3D من الشعاب المرجانية من م. الحلقي (AD) و م. faveolata (EH). (A و E) تم تصويرها مع عدم وجود فصل الطيفي للمكونات باستخدام 780 نانومتر الإثارة ليزر ثنائي الفوتون، مع الإشارة البصرية التي تم جمعها 450-700 نانومتر. تم جمع (B و F) مع نفس الإثارة (780 نانومتر)، ولكن تم استخدام اثنين من أجهزة الكشف PMT في وقت واحد لجمع البيانات من عنصرين أي.، واحدة 500-550 نانومتر (الأخضر حامل الصباغ تألق ذاتي) والبعض 650- 720 نانومتر (أحمر مضان الكلوروفيل). (C و G) هي عمق مشفرة صور(B و F)، الأحمر هو سطحية واللون الأزرق هو أعمق المكونات في 2D. (D و H) عبارة عن صور YZ من قطع طريق (B و F) على التوالي، والتي تبين مضان قادم فقط من سطح المرجان وليس لديها هيكل عظمي أي مضان في 780 نانومتر الإثارة. لاحظ الفرق الكبير في المحتوى حامل الصباغ بين الشعاب المرجانية اثنين. وم. الموائل الحلقي (0-10 م WD) هو ضحالة من م. الموائل faveolata (10-20 م WD). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 10
الرقم 10. صلاحيات عشرة الهيكل المكاني الهرمي الدراسات سو النظم الإيكولوجية للشعاب المرجانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم S1
SI الشكل طلقات 1. الشاشة تظهر الخطوات (AI) تشارك في خلق حجم 3D وتقديم isosurface سواء من البيانات SBFI أو المجهري 2Photon باستخدام برنامج تحليل الصور (انظر الجدول المواد). (A) شرائح 2D من الخام البيانات في وضع شريحة يظهر طائرة واحدة؛ (B) حجم 3D من جميع شرائح 2D. (C) إنشاء المعالج isosurface مع المنطقة ذات الاهتمام (ROI) المختارة؛ (D) خوارزمية مع الطرح خلفية مختارة؛ (E) قيمة عتبة تطبيق لالتقاط بكسل الذي تمثيلار البيانات؛ (F) نقاط البذور وسط السطح؛ (G) يتم تطبيق مرشح على أساس حجم للقضاء على حجم أصغر من الحطام والضوضاء. (H) و3D نهائي صادر isosurface. (I) الرئيسي المعالج إطار الرسوم المتحركة لإنشاء الأفلام وأشرطة الفيديو في SI. وتظهر الصور النهائية الصادرة في كل من حجم وطرائق isosurface في فيديو SI 3-7. بروتوكول الخطوات 3.1.3-3.1.5 تغطي هذه الإجراءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد / المعدات شركة كتالوج / موديل التعليقات / الوصف
الهيكل العظمي الأنسجة المرجانية لا شيء لا شيء 2.5 سم Biopسي من الموائل الطبيعية
قوس لكمة جهاز الحفر شركة CS أوزبورن و رقم 149 لكورال جمع خزعة
بارافورمالدهيد علوم الإلكترون المجهري RT 15700 16٪ ما قبل المخففة-
Histoclear / Safeclear II علوم الإلكترون المجهري RT 64111-04 البديل غير سامة للالزيلين، والجفاف Deparafinization
الزيلين والإيثانول فيشر العلمية فيشر العلمية الجفاف
شمع البارافين ريتشارد ألين العلمي نوع H REF 8338 حل تسلل
Vybar صانع شمعة لا شيء المكون من الشمع الأحمر
ستيرين صانع شمعة لا شيء المكون من الشمع الأحمر
السودان IV فيشر الكيميائية S667-25 خلفية الشمع الأحمر، كامد
جرثومة القمح الملزن (WGA) تقنيات الحياة W32466 لوصفها كورال مخاط
إطالة الذهب تقنيات الحياة P36095 مكافحة تتلاشى وسائل الإعلام المتصاعدة
الفلورية الصحن الآلات الدقيقة العالم FD-35-100 للتصوير ثنائي الفوتون
XY للسيارات، سائق والمراقب المالي لين الهندسية 211-13-01R0، R325، R256-RO XY الحركة بالحركة
لوحة الساخنة كورنينج DC-220 ذوبان الشمع جميع
الفرن الحراري ياماتو DX-600 تسلل والتضمين
النسيج المعالج لايكا ASP 300
مشراح لايكا RM2055 السكاكين القابل للتصرف
ستيريو المجهر كارل زييس Stereolumar V 12 1.5X (30 ملم WD) الهدف
مضان المجهر مع ApoTome كارل زييس Axiovert M 200، ApoTome I النظام التصوير قسم رقيقة من سليلة: زوزانتلي
كاميرا Axiocam كارل زييس MRM كاميرا أحادية اللون 1388x1040 بكسل
Axiovision البرمجيات كارل زييس النسخة 4.8 برنامج الحصول على الصور
ثنائي الفوتون الليزر Spectraphysics Maitai EHP، ليزر نابض (70 خ) مع وحدة DeepSee
الليزر الضوئي المجهر كارل زييس LSM 710 مع كاشف الطيفي 34قناة الكشف PMT
زن البرمجيات كارل زييس عام 2010 أو أعلى لمدة الفوتون والحصول على الصور الطيفية
Imaris برمجيات Bitplane، شركة، الإصدار 7.0 أو أعلى 3D حجم التداول، مما يجعل ايزو السطح، والتصور

الجدول 1. المواد الأساسية والمعدات والمجاهر، والبرمجيات المستخدمة في هذه الدراسة.

SI فيديو 1. الموقع تحت الماء فيديو في الحقل تبين الموائل المرجانية في 12 م WD من م. faveolata في بلايا كالكي، كوراساو.

SI فيديو 2. الفردية 2D الصور التسلسلي وجه كتلة من 3D المقدمة هو مبين في الصورة فايجوري 4E.

SI فيديو 3. Isosurface 3D أصدرت كتلة التسلسلي صورة الوجه قدمت في الشكل 4E وSI الفيديو 1 تبين تضاريس سليلة المرجانية.

SI فيديو 4. حجم 3D المقدمة البيانات الخام ثنائي الفوتون صورة مجهرية من سليلة المرجانية م. faveolata. الإثارة 780 نانومتر، وانبعاث القبض على اثنين في وقت واحد بعرض لفرقة زوزانتلي (شبه تتلون بالاحمر، 600-700 نانومتر) وchromatophores (الزائفة الملونة الخضراء، 500-550 نانومتر).

SI الفيديو 5. حجم 3D في تقديم Isosurface البقع ثنائي الفوتون صورة مجهرية من سليلة المرجانية م.faveolata. الإثارة 780 نانومتر، وانبعاث القبض على اثنين في وقت واحد بعرض لفرقة زوزانتلي (شبه تتلون بالاحمر، 600-700 نانومتر) وchromatophores (الزائفة الملونة الخضراء، 500-550 نانومتر).

SI فيديو 6. حجم 3D المقدمة البيانات الخام ثنائي الفوتون صورة مجهرية من سليلة المرجانية م. الحلقي. الإثارة 780 نانومتر، وانبعاث القبض على اثنين في وقت واحد بعرض لفرقة زوزانتلي (شبه تتلون بالاحمر، 600-700 نانومتر) وchromatophores (الزائفة الملونة الخضراء، 500-550 نانومتر).

SI فيديو 7. حجم 3D-المقدمة Isosurface البقع ثنائي الفوتون صورة مجهرية من سليلة المرجانية م. الحلقي. الإثارة 780 نانومتر، وانبعاث القبض على اثنين في وقت واحد بعرض لفرقة زوزانتلي (PS-eudo تتلون بالاحمر، 600-700 نانومتر) وchromatophores (الزائفة اللون الأخضر، 500-550 نانومتر).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البحث الشعاب المرجانية هو جهد بحثي متعدد التخصصات للغاية، تنطوي على تحليل متزامنة الفيزيائية والكيميائية، والظواهر البيولوجية التي تعمل في البيئة البحرية. لذا أفضل اكتمال دراسة النظم الإيكولوجية للشعاب المرجانية المعقدة داخل "القوى العشرة" إطار السياقية (الشكل 10). يوضح الرسم أن هذا التجميع النظام البيئي المرجانية تغطي مجموعة واسعة من الأبعاد المكانية (10 -9 إلى 10 5 م). وعلاوة على ذلك، توضح هذه العملية التي geobiological يحلل في طول النطاق المتوسط ​​من 1 ملم-1 سم هي الجسر بحاجة إلى الجمع الميداني والتحاليل المعملية. هذه القوى من عشرة الإطار هو سياق التجارب وتحليل، والنمذجة، وتجميع الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية والمعلمات التي تتحكم في النظم الإيكولوجية للشعاب المرجانية جزر الأنتيل.

هذه الدراسة هي الأولى التي تطبق مجموعة متكاملة سو FM، SBFI والتقنيات CLSM لتعقب استجابة الشعب المرجانية يبدو صحية لزيادة عمق المياه. تم أدوات المجهر الضوئي المتوفرة لصورة الأنسجة كلها أو العينات البيولوجية سميكة محدودة بسبب مجموعة متنوعة من القيود التي تفرضها البصرية العينات أنفسهم، والتي تشمل الاستيعاب، ونثر، وغيرها من الظواهر. فقط ضمن العقد الماضي، كان يستخدم SBFI المجهر الإلكتروني في قرارات عالية جدا 31 وكذلك التصوير المجهري باستخدام الضوء واسعة المجال استنادا التصوير SBFI من عدة عينات بيولوجية. وقد شملت هذه التحليلات من كل شيء من أنسجة المخ إلى القلب كلها وحتى العينات التي تحتوي على العظام التي كانت الأرض، مصقول، وصفت، وتصويرها في نفس الوقت بعد إجراء كل قسم 23-29. مؤخرا، تم استخدام مضان المجهري متحد البؤر وللكشف عن ملامح، والشكل، وتوزيع البروتينات والصبغات في العينات البيولوجية 32-33. ومع ذلك، فإن هيكل 3D الفردية البوليبات المرجانية هكتارد لم يتم حلها سابقا. شرط مسبق لSBFI مع عينات المرجان هو زوال الكلس، كما يجب إزالة كربونات الكالسيوم قبل تقديم العينات قابلة للتسلل وباجتزاء باستخدام مشراح منتظم.

هذا هو المكان الذي يصبح ثنائي الفوتون مضان المجهري لا غنى عنه لتحليل الأنسجة البيولوجية بسبب فريدة من نوعها ثنائي الفوتون الظواهر إثارة لها. وأدى ذلك إلى تمديد 33-34 اختراق عمق الأنسجة المرجانية في هذه الدراسة، حيث تم القضاء على خطوة زوال الكلس بشكل فعال نظرا لاخطي ثنائي الفوتون الإثارة ظواهر 34. وبالإضافة إلى ذلك، قدمت وحدة precompensation مع ليزر ثنائي الفوتون أقصر بكثير عرض النبض، والتي بالإضافة إلى تحسين عمق الاختراق. على الجانب عينة، منذ كربونات الكالسيوم لا يمتص ضوء الأشعة تحت الحمراء القريب في 780 نانومتر، اختراق عمق يقتصر عادة من مسافة العمل من الهدف. وثمة عيب آخر بعد سو زوال الكلس وإزالة هيكل عظمي المرجانية هو فقدان السلامة الهيكلية للأنسجة المرجانية، مما يجعل تقديرات حجم الأنسجة أكثر صعوبة بعد أن ذهب من خلال العينة متعددة الجفاف والإماهة الخطوات وتضمينها في الشمع خالية من المياه. وهذا يؤكد على أهمية تحديد حجم الأنسجة المرجانية قبل وبعد المعالجة على حد سواء.

تم الانتهاء من توصيف متحد البؤر من البروتينات الفلورية من المرجان والشعاب المرجانية لالحاجز المرجاني العظيم، وقد ترتبط الخصائص الطيفية واقية مع عمق الموائل المرجانية 32. ولكن، في هذه الدراسة نظهر لأول مرة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري أن هناك انخفاض كبير في كل مكان من chromatophores المرجانية في المياه العميقة إلا في أنسجة الفم. وبالإضافة إلى ذلك، فقد لوحظ التغييرات متميزة في توزيع زوزانتلي فيما يتعلق chromatophores عبر المقاطع العرضية في عمق M. الحلقي، وهره وتغطي الأنسجة المرجانية في المياه الضحلة تماما مع chromatophores. مع القرار التي تقدمها التصوير عالية التكبير (أرقام 8C و8D)، يمكننا الآن تحديد بالضبط المساحة والحجم تناولها من قبل زوزانتلي، ويمكن تحديد نسبها كثافة الأنسجة فيما يتعلق المكونات الخلوية الأخرى. أخذت معا، ودمج SBFI واثنين من الفوتون مضان التصوير الطيفي في هذه الدراسة قد أسفرت عن رؤى جديدة ذات أهمية حيوية في مورفولوجيا وهيكل الأنسجة المرجانية. وهذه البيانات تساعد على تحديد المكونات الفردية من الأنسجة المرجانية، سواء على المستوى الفردي أو ورم على مستوى لسياق التفاعل بين الاورام الحميدة الاستعمارية على رأس المرجانية بأكمله. هذا السياق سوف تسمح الآن الاستجابة التكيفية للholobiont المرجانية للتغيرات في مستوى سطح البحر عمق المياه والإشعاع لتعقبها الكمية وتوقعت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
  2. Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
  3. Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
  4. Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
  5. Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
  6. Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
  7. Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
  8. Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
  9. Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
  10. Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
  11. Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
  12. Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
  13. Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
  14. Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
  15. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
  16. Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
  17. Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
  18. Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
  19. Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
  20. van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
  21. Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
  22. Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
  23. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
  24. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
  25. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
  26. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
  27. Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
  28. Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
  29. Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
  30. Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
  31. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  32. Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
  33. Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
  34. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).

Tags

العلوم البيئية، العدد 91، كتلة المسلسل التصوير الوجه، واثنين من الفوتون مضان المجهري،
المتعدد الوسائط البصرية الميكروسكوب طرق كشف ورم الأنسجة الصرف والبنية في منطقة البحر الكاريبي المرجانية بناء المرجان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller,… More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter