Summary
Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología de pólipo y estructura de los tejidos en el Caribe corales Montastraea annularis y M. faveolata. Fluorescencia, cara del bloque de serie y de dos fotones del láser confocal de barrido microscopía han identificado la estructura lobulada, paredes de pólipos, y chromatophore estimado y las densidades de zooxantelas y distribuciones.
Abstract
Un conjunto integrado de las técnicas de imagen se ha aplicado para determinar la morfología tridimensional (3D) y la estructura celular de los tejidos de los pólipos que comprende la corales constructores de arrecifes del Caribe Montastraea annularis y M. faveolata. Estos enfoques incluyen microscopía de fluorescencia (FM), la cara de bloque serial de formación de imágenes (SBFI), y de dos fotones microscopía de barrido láser confocal (TPLSM). SBFI proporciona imágenes de tejido profundo después de seccionamiento física; se detalla la textura de la superficie del tejido y la visualización 3D a profundidades de tejido de más de 2 mm. FM complementaria y rendimiento TPLSM imágenes de ultra-alta resolución de la estructura celular del tejido. Los resultados han: (1) identificaron morfologías no reportados previamente tejido lobulados en la pared exterior de los pólipos de coral individuales y (2) creado el primer mapa de la superficie de la densidad de la distribución y el tejido 3D de cromatóforos y endosimbiontes zooxantelas dinoflagelado similares a algas. Guisante absorción espectralks de 500 nm y 675 nm, respectivamente, sugieren que M. annularis y M. faveolata contienen tipos similares de clorofila y cromatóforos. Sin embargo, M. annularis y M. faveolata exhibir diferencias significativas en la densidad del tejido y la distribución 3D de estos componentes celulares clave. Este estudio se centra en los métodos de imagen indica que SBFI es extremadamente útil para el análisis de grandes muestras mm escala de tejidos de coral descalcificar. FM cortesía y TPLSM revelan cambios sutiles escala submilimétrica en la distribución celular y la densidad en muestras de tejido de coral nondecalcified. La técnica TPLSM proporciona: (1) la preparación mínimamente invasiva de la muestra, (2) la capacidad de seccionamiento óptico superior, y (3) la absorción de luz mínima y la dispersión, permitiendo al mismo tiempo de formación de imágenes de tejido profundo.
Introduction
El calentamiento global y el cambio ambiental que acompaña están afectando directamente la salud y la distribución de los corales marinos tropicales 1-4. Se observan múltiples impactos, incluyendo la decoloración del coral y la aparición de enfermedades infecciosas 5-6. Sin embargo, la predicción más exacta de la futura respuesta coral a estas amenazas ambientales, será necesario que se establezca una "línea de base" histológico, que define la morfología del tejido y la composición celular y la distribución de los corales "aparentemente sanos". A su vez, "impactados" corales pueden compararse cuantitativamente. Además, esta línea de base debe ser establecido para corales aparentemente sanos bajo una variedad de condiciones ambientales, por lo que "respuesta saludable" también se puede medir a través de gradientes ambientales. Como un primer paso hacia el establecimiento de esta línea de base, un estudio en 3D de alta resolución se ha llevado a cabo de la forma aparentemente tejido de los pólipos de coral saludablela morfología y la composición celular responde a los aumentos en la profundidad del agua (WD) y disminuciones que se acompañan en la luz del sol irradiancia. Resultados se pueden utilizar para establecer una comprensión mecanicista más completo de la adaptación de coral, así como para obtener una perspectiva de la evolución-coral simbionte y el mejoramiento de la recolección de luz.
Los corales pétreos (Scleractinia) son animales invertebrados marinos coloniales que acogen a un complejo conjunto de otros microorganismos, denominados colectivamente como el coral holobionte 7-10. La investigación llevada a cabo en el presente estudio busca utilizar un conjunto de tecnologías de imagen de vanguardia para seguir simultáneamente los cambios a medida que aumenta la profundidad del agua en los tejidos y pigmentos zooxantelas de los corales anfitriones aparentemente sanos. Esto establecerá el tejido celular comparativo "línea de base" necesaria a través de un gradiente batimétrico para los corales aparentemente sanos y actúan como indicadores de hea corallth 10. Pigmentos de coral, llamados cromatóforos, actúan para absorber, reflejar, de dispersión, refractan, difractan, o interferir con la radiación solar incidente 11. La relación endosimbiótica-zooxantelas chromatophore ha permitido a la coevolución de estratégicamente ventajosa optimización captador de luz y las estrategias de crecimiento del esqueleto, así como la plasticidad trófica (estrategias de alimentación desplazamiento de ida y vuelta desde autotrofia a heterotrofía) para el animal coral 12.
El sur de la isla caribeña de Curaçao (antes parte de las Antillas Neerlandesas) está a 65 km al norte de Venezuela dentro de la tendencia este-oeste Aruba-La Blanquilla archipiélago (Figura 1A). La costa sur de 70 kilometros de largo de Curaçao contiene una antigua franja tracto arrecife de coral continua moderno y Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno 13,14. SST media anual en Curazao varía de aproximadamente 3 ° C unanuamente, que van desde un mínimo de 26 ° C a finales de enero a un máximo de 29 ° C a principios de septiembre, con una temperatura media anual de 27,5 ± 0,5 º C (SST datos NOAA Establece, 2000-2010). El arrecife de coral en Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), situada cerca de la punta noroeste de Curazao (Figura 1A), fue elegido para el muestreo, ya que ha sido previamente bien estudiado y la ecosistema marino en este lugar se baña en el agua de mar fresca 7,15-19 no contaminados. . Dos especies de coral escleractinios estrechamente relacionados, M. annularis y M faveolata, fueron elegidos para la experimentación y el análisis en este estudio porque cada especie: (1) exposiciones muy diferentes y que no se superponen las distribuciones batimétricas en el tracto arrecife con respecto al borde de la plataforma y la ambientes de depósito sedimentario carbonato asociados (rango annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarango = 10-20 m WD 20; las figuras 1B, 2A, y 2B); (2) es un coral común constructor marco de arrecifes en todo el Mar Caribe 21; y (3) tiene bien estudiado ecológica, fisiológica y relaciones evolutivas 22.
Muestreo de campo para el presente estudio se llevó a cabo usando técnicas estándar de buceo SCUBA en alta mar de Playa Kalki en Curazao. A batimétrico agua transecto-superficial-a lo profundo se estableció que corrió a través de la plataforma, el talud continental, y en los ambientes del arrecife frontal en aguas profundas. Al parecer, luego se identificaron cabezas de coral saludable para el muestreo a lo largo de este transecto batimétrico, incluyendo: (1) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. annularis, todos los cuales estaban en 5 m de profundidad de agua (WD); y (2) tres individuales ~ 1 m cabezas de coral diámetro de M. faveolata, todos los cuales estaban en 12 m WD. Radiación fotosintéticamente activa (PAR) se midió como 33-36% de PAR en 5 m WD y 18-22% PAR a 10 m WD. El muestreo se llevó a cabo en enero, cuando la SST fue de 26 ° C en las profundidades marinas de ambos extremos, 5 my 12 m. Cada uno de estos seis cabezas de coral se tomaron muestras por triplicado en las posiciones espaciales equivalentes (es decir., Aproximadamente 45 ° de latitud norte en cada una de las seis cabezas de coral hemisféricas). Cada muestra individual consistía en una biopsia de 2,5 cm de diámetro coral esqueleto de tejido de núcleo que se recogió con un arco punch limpiado. Tres biopsias de tejido esqueleto de coral se muestrearon en SCUBA estándar con las manos enguantadas de cada una de las cabezas de coral (9 de M. annularis colonias a 5 m WD y 9 de M. faveolata a 12 m WD). Inmediatamente después de la recolección en profundidad, cada muestra de biopsia de núcleo se colocó en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml estéril, con tapa de rosca sellado, y volvió a la superficie. El agua de mar se decantó de cada tubo de centrífuga y luego cada uno de biopsia de núcleo se sumergió, almacenada y transportada en 4% de paraformaldehído.
23-30. La mayoría de estos estudios utilizaron microscopía óptica / luz, ya sea con fluorescencia o técnicas de campo claro. Sin embargo, se han realizado estudios en ultra-grandes aumentos utilizando imágenes de la cara del bloque de serie electrónico de barrido en el pasado 31. En el presente estudio, un protocolo SBFI modificado ha sido desarrollado para y se aplica a los corales por primera vez. Debido a que M. annularis y M. pólipos de coral faveolata son de 1-2 mm de espesor, ninguna de las técnicas de microscopía de luz de rutina sería capaz de penetrar todo el espesor del tejido de los pólipos de coral. Por lo tanto, tenemos SBFI protocolo de preparación de muestra diseñada específicamente para muestras de coral. Además, hemos diseñado a medida un soporte estereoscópico, Que está motorizado para moverse en ambas direcciones x e y. Este aparato toma imágenes de la cara del bloque de la muestra en lugar de la recogida de las secciones usando un microtomo regular en frente del microscopio. También hemos introducido otra técnica microscópica de dos fotones óptica no lineal a la imagen los mismos pólipos de coral a través de todo el espesor de los tejidos de coral. Esto supera las limitaciones impuestas por la SBIF en términos de la descalcificación y la posibilidad de cambios en la morfología de los tejidos y el volumen (contracción) que pueden ser inducidas por la preparación de muestras (deshidratación) y protocolos de tratamiento. Además, los perfiles de emisión de los corales fueron resueltos espectralmente para identificar sus picos de emisiones y las variaciones entre los cromatóforos y las zooxantelas fotosintética. Estos resultados se evaluaron en el contexto del método utilizado y sus ventajas individuales con respecto a tiempo de adquisición, el tiempo de análisis, y la capacidad de resolver detalles finos estructurales sin comprometer strintegridad uctural del tejido del coral.
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Protocol
NOTA: Los reactivos que se preparen para Serial Bloquear Cara Imaging de Coral Muestras
1. Preinfiltration Cera
- Derretir 3,6 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio. Mezclar bien en un plato caliente (60-70 ° C).
- Añadir 400 mg de Sudán IV (para minimizar la cera de la fluorescencia de fondo). Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo.
- Añadir 96 ml de parafina fundida caliente (100%) y mezclar bien.
1.2) Incorporación de Cera
- Derretir 7,2 g de copos de ESTEARINA en un vaso de precipitados de vidrio y mezclar bien sobre una placa caliente (60-70 ° C).
- Añadir 0,8 g de Sudán IV. Mezclar bien y esperar hasta que se logre una solución transparente de color rojo.
- Añadir gránulos de parafina (162 g) y mezclar hasta que la parafina se derrite por completo.
- Añadir 30 g de blanco granular Vybar y fundir completamente en el mismo vaso de precipitados; una vez derretida, mezclar.
- Sin apretar cerrar la botella de vidrio con una tapa. Coloque la botella de vidrio en un 60 ° C convección oven mantener los ingredientes en estado líquido. Llevar a cabo todas las infiltraciones en este horno.
- Dividir el volumen total de la 200 ml de cera roja en dos frascos de vidrio de 100 ml cada uno. Utilice una alícuota para la infiltración y el otro para la incrustación final.
1.3) incrustación de coral Los tejidos para Serial Bloquear Cara Imaging
- Lave los pólipos de coral recogidos sobre el terreno (SI Video 1) y almacenados (3-6 meses a 4-5 ° C en paraformaldehído) en tampón fosfato salino (3x 5 min) y descalcificación cuando esté listo para ser fotografiado. Descalcifique los pólipos en solución Excal durante 24 horas o hasta que los pólipos son totalmente desprovisto de CaCO3. Incubar varios pólipos de coral descalcificada como un solo bloque en una serie 25, 50, 75, y 100% de etanol, seguido por 1x sustituto de xileno para deshidratar las muestras.
- Coloca los pólipos procesados en un horno C 65 ° precalentado que contiene 100% sustituto xileno. Incubar durante 30 minutos dos veces por changing a solución fresca. Orientar los pólipos de tal manera que la parte superior de los pólipos está orientado hacia abajo y la superficie superior es tan plana como sea posible.
- Hacen que las soluciones de 2: 1, 1: 1, y 1: 2 xileno sustituto y cera preinfiltration (paso 1.1) en 50 ml tubos Falcon.
- Incubar los pólipos de coral con estas tres concentraciones crecientes de cera preinfiltration, seguido de 3x incubación en 100% de cera preinfiltration durante 30-60 minutos cada vez.
- Nota: Dependiendo del grosor de las muestras, los pasos 1.3.1-1.3.5 podrían incrementarse con períodos más largos de tiempo.
- Mueva las muestras a la incrustación de cera (vea el paso 1.2.6) después de la incubación 3x en el 100% de cera preinfiltration.
- Quite la cera de incrustación después de 30 min. Reemplace con cera incrustación fresco y continuar la incubación durante un mínimo de 4 horas a 65 ° C.
1.4) Incorporación en rojo de la cera
- Fotografiar el bloque (la bandeja de acero inoxidable donde se coloca la cera blanca y en la parte superior de la que el sample se coloca). Esto es necesario porque una vez incrustado en la cera, la ubicación de la muestra se volverá invisible como la incrustación de cera roja es opaco.
- Coloque pequeñas gotas de cera de alto punto de fusión en torno al nuevo molde de inclusión acero inoxidable precalentado y deje que se enfríe. Vierta un pequeño volumen de cera de incrustación recién fundido de segundo recipiente como se indica en el paso 1.2.6.
- Coloque el pólipo de coral hacia abajo rápidamente sobre el punto cera blanca, a continuación, colocar un soporte de muestra de plástico en la bandeja de acero inoxidable y se vierte cera más incrustación de manera que la cera se acerca a la superficie del molde de plástico.
- Tome toda la configuración de 65 ° C horno y deje que se enfríe en un banco o una superficie fría hasta que la cera se endurece por completo.
- Este proceso puede tardar 6 horas hasta uno o dos días. Coloque el bloque desecado en un refrigerador a 4 ° C, protegido de la luz, para almacenamiento a largo plazo.
1.5) seccionamiento en la serie de configuración de bloque de la cara
- Trim la manzana y cortar 1 micras secciones usando un microtomo. No recoger los apartados tal como serán como polvo. Recuerde, estamos Imaging sólo la cara del bloque. La muestra aparece cuando la cera blanca comienza a desaparecer.
- Capturar imágenes de la cara del bloque lisa que contiene la muestra cada vez que se retira una sección. Continúe hasta que el pólipo de coral desaparece como en SI Video 2.
- Grabar / Captura las imágenes con una cámara monocromática utilizando un filtro fluorescente FITC para recoger la autofluorescencia del cromatóforos / coral pólipo. Imagen 3-4 núcleos descalcificados de cada especie.
2. Imaging corales Bajo de dos fotones microscopía de fluorescencia
- Fijar núcleos de pólipos de coral, cada uno con alrededor de 10 a 12 pólipos alrededor de una pulgada de diámetro, en el 4% de paraformaldehído en el sitio de la colección (orilla del mar) tan pronto como se recogen bajo el agua.
- Mantenga las muestras a 4 ° C hasta que la imagen. Núcleos lavados se colocan en ee misma solución boca abajo en un plato con fondo de cristal cubierta (0,17 mm de grosor).
- El uso de un láser de dos fotones de excitación a 780 nm, imagen 3-4 pólipos en dos diferentes aumentos (zoom digital) con un (NA 0.3) objetivo de 10X. La forma pólipo de coral y la altura varía entre las muestras (generalmente 1-2 mm) y la profundidad de formación de imágenes también está limitada por la distancia de trabajo del objetivo de formación de imágenes.
- Utilice el modo de exploración de azulejos para recoger aproximadamente 25 a 100 (5 x 5 o 10 x 10 azulejos) imágenes por plano focal en xy y 50-100 imágenes a través del eje z en el intervalo de 10 o 20 micras, por un total de alrededor de 5.000-10.000 images / pólipo de coral.
- Imagen en tres en cuatro ámbitos de pólipos para representar una especie de núcleo y de coral. NOTA: La imagen de tiempo de adquisición varía entre 2-5 hr área / pólipo.
- Guarde todas las imágenes en formato de datos en bruto en el disco duro del sistema como LSM 5. Render 3D en un análisis de imágenes 3D y software de renderizado.
3. 3D Volume Rendering y Visualization de la SBIF y de dos fotones de fluorescencia espectral de datos
- Recortar los datos 2D para reducir el tamaño del archivo, centrándose en un solo pólipo utilizando la herramienta de recorte cuadrado en el programa y compilar en un solo archivo tiff (reducir el tamaño del archivo también guardando el archivo en formato de 8 bits) en el software de adquisición.
- Abra los archivos reunidos de los datos recogidos (SBIF en el paso 1.5.1) o las baldosas múltiples z-pilas de secciones ópticas de dos fotones (recogidos en el paso 2.1.4) en el programa Imaris Supera módulo de bajo volumen algoritmo.
- Proyectar los datos SBFI prestados en 3D usando una proyección de sombras. Crear un modo de isosuperficie donde se thresholded los voxels para crear un patrón de superficie sólida (SI vídeo 3).
- Visualice las proyecciones en 3D usando un algoritmo de plano de corte en xy, xz y yz modos ortogonales para revelar la estructura 3D y la forma de los corales.
- Animar las proyecciones utilizando un módulo de animación fotograma clave en el mismo programa Imaris (SI Videos 3-7).
- Generar archivos de vídeo en el 5% de compresión y generar unos clips de película en formato avi usando volumen (SI Videos 4 y 6), modalidades 3D y Isosurface (SI Videos 5 y 7).
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Representative Results
Un aparato SBFI diseñado a medida (fabricado específicamente para el presente estudio, figura 3) produjo los primeros mapas detallados 3D digitales de elevación (DEM) de la textura de la superficie exterior y la morfología de la M. annularis y M. Los pólipos de coral faveolature (Figura 4 y SI Videos 1-2). Esto produjo imágenes de lóbulos apilados previamente no descrita de tejido coralino concéntricamente irradia hacia fuera del centro de cada una (4B figuras, 4D y 4E) de pólipos. Estos lóbulos se apilan a lo largo de la cresta más alta de septos esquelético primaria y secundaria cubierta de tejido, con las radialmente más exterior y más inferiores lóbulos de elevación finalmente sintetizar y combinar con los tejidos coenosarc entre pólipos. La forma pólipo 3D y los lóbulos asociados estaban bien conservados a pesar de la muestra de tejido del coral de haber pasado por varias etapas de la infiltración de alta temperatura y la incrustación. El addition de colorante Sudán enmascaró el fondo como opaco, con el color negro haber ayudado para maximizar el contraste de cada muestra y aumentar la relación señal-ruido. 3D y vistas plano ortogonal mostraron la distribución de los componentes fluorescentes a lo largo del eje z (Figura 4B). Había aviones con copos de cera que a veces oscurecida detalle de la superficie del pólipo, que fueron retirados para mayor claridad al crear proyecciones. La principal ventaja de esta técnica es en revelar detalles internos de cualquier muestra de espesor, eliminando así la necesidad de tomar múltiples secciones y alinearlos en un momento posterior. Además, las imágenes en esta técnica ya están alineados cuando se cobran (Figura 4A), proporcionando az resolución de hasta 1 m de un tamaño de muestra de hasta 10 mm o más (dependiendo de la distancia total de la unidad del soporte del bloque en el microtomo ). Es posible discriminar diferentes componentes auto-fluorescente (utilizando múltiples filtros), así como individuozooxantelas a mayor aumento, siempre que el campo de vista reducida es aceptable.
El ApoTome seccionamiento óptico microscopio de fluorescencia reveló la distribución de células de coral tejidos (zooxantelas y cromatóforos) y estructura de tejido de la superficie con una resolución submilimétrica. Por lo tanto, las zooxantelas 6-13 micras de diámetro podría ser reconocida y cuantificada con respecto al número de células por volumen de tejido (Figura 5) fácilmente. La adquisición de imágenes de doble canal utilizando la fluorescencia de la clorofila (verde) y el moco marcado con WGB Alexa 647 (se muestra en rojo), que funcionó mejor para cuantificar el nivel de moco y el número de zooxantelas dentro de un lugar determinado del pólipo (mayor y menor tabiques de pólipo podría calcularse de forma independiente).
Además de estos enfoques microscopio, también hemos aplicado TPLSM, una técnica no lineal ampliamente utilizado para muestras biológicas de espesor. Las principales ventajas de TPLSM Más ene-fotón láseres de onda continua son que: (1) de excitación se produce sólo en el punto de enfoque, porque la potencia de la intensidad de la luz de excitación se convierte al cuadrado y la posibilidad de una molécula para absorber dos fotones consecutivos para excitar un electrón del fluoróforo es limitado a la profundidad de campo del objetivo, proporcionando así una confocalidad inherente. y (2) como consecuencia no habrá pérdida de un fotón de excitación mientras penetra más profundamente en la muestra, a diferencia de los láseres de fotones individuales. Además, la mayoría de muestras de tejidos biológicos también absorben la luz visible. Puesto que la excitación de dos fotones es inherentemente tiempo (en el infrarrojo cercano a 780 nm), la absorción también se minimiza sustancialmente. Por otro lado, el esqueleto de coral compuesto de carbonato de calcio apenas absorbe o dispersa la luz de dos fotones. Por último, ya que estaban interesados en la determinación de la distribución de los objetos sólo en la superficie contorneada del esqueleto de coral, encontramos las imágenes más profundo utilizando esta modalidad de very adecuado para la imagen de coral.
Hemos tratado de caracterizar las firmas espectrales disponibles en M. annularis (Figuras 6-9). Aquí nos muestran que en el marco del 780 nm de excitación de dos fotones, el chromatophore autofluorescencia tiene un pico alrededor de 500 nm, mientras que la fluorescencia de la clorofila de las zooxantelas está centrada en aproximadamente 675 nm (Figura 6). Mientras desmezcla de estos datos espectrales (Figuras 6-7) también es posible con un algoritmo de desmezcla en el software (Figura 8), puesto que hay una clara distancia espectral entre los dos componentes, la formación de imágenes utilizando simultáneamente dos detectores en dos bandas de emisión demostrado para ser más técnica de ahorro de tiempo. Esto es especialmente cierto cuando la muestra es de baldosas y fotografiado en toda una profundidad de 1-2 mm de tejido. Esto elimina la necesidad de seccionamiento física, lo que requiere varios miles de imágenes por localización y de la muestra y pólipo. El o la distribución f cromatóforos auto-fluorescente es también distinta (Figura 9) entre las dos especies de coral probadas. En un caso, se observó un aumento significativo de los cromatóforos en el agua menos profunda morada coral M. annularis comparación con el agua más profunda M. faveolata (Figura 9 y SI Videos 3 y 4).
Figura 1 (A) Mapa de Curaçao, en el sur del mar Caribe, con la ubicación del sitio de estudio en Playa Kalki, en la costa de sotavento extremo noroeste de la isla. (B) sección transversal esquemática de la plataforma de coral montura en Playa Kalki en Curazao, que muestra las distribuciones de profundidad de agua de M. annularis y M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 (A) In situ submarina fotografía de campo a 12 m WD de M. faveolata en Playa Kalki, Curaçao. (B) Cierre de la ampliación de la imagen en (A) que muestra los pólipos de coral individuales de M. faveolata en condiciones de luz diurna (cada pólipo es de aproximadamente 2 mm de diámetro, algunas de las cuales se retraen, indicados por *). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3 La serie de bloques cara instrumentación de imagen. (A y B) El titular microscopio de diseño personalizado, sostiene el microscopio Stereolumar a 180 ° frente a la cara del bloque de la muestra colocada en el microtomo. Cuando se retiró de cada sección, la imagen de la cara del bloque fue capturado con el objetivo y los datos 2D se almacena digitalmente. Esto se hizo hasta que la muestra desapareció en el bloque. El microscopio se mueve en dirección X e Y usando un tornillo de avance motorizado y la z, se hace el ajuste para enfocar la muestra. Es importante señalar que cuando se secciona cada 1 m de la muestra, el bloque se mueve 1 m adelante, por lo reorientar del alcance no es necesario. XYMOT, Custom construido xy platina motorizada traslacional; FLS, fuente de luz de fluorescencia; MT, Microtomo; MIC, estereoscópico; CAM, cámara monocromática Axiocam; BH, Block titular; BF, Block cara dela muestra; FLL, Fluorescente punto de luz de excitación en la cara del bloque; OBJ, el objetivo del microscopio; HIP, panel de interfaz humana. Una imagen en la dimensión de 1388 x 1040 píxeles horizontales verticales en modo monocromo se recogió en un píxel xy resolución (individual) de 1,25 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. bloque serial cara de formación de imágenes de los corales M. annularis y M. faveolata recogido de Playa Kalki, Curaçao. datos (A) muestra establecida galería que muestra alrededor de 800 imágenes de imágenes 2D individuales obtenidos a partir de un pólipo en 1 m de resolución en z. (B) En otra muestra coral, el seccionamiento ido bien en 2,000 m en z. La imagen está mostrando múltiples pólipos y la compilación de todos los cortes 2D en 3D a un volumen bajo de proyección de sombra utilizando el algoritmo de visualización volumen Imaris. Proyección (C) que muestra una vista ortogonal xz de la muestra en (B), uno puede ver toda la profundidad de la muestra a lo largo de 2 mm y las flechas indican las líneas negras donde se eliminaron las rebanadas en 2D debido a la mala calidad; esta imagen es de M. annularis. Volumen 3D (D), Isosuperficie representación (E) y la visualización de los datos SbfI. (D) múltiples pólipos de coral que muestran la morfología de pólipos en sección longitudinal en el lado y el volumen 3D (proyección de sombra) de un solo pólipo en el medio. Seccionamiento y visualización desde cualquier ángulo es posible en 3D (ver video SI). E. Desde voxels son borrosos en 3D (D), la superficie 3D Isosuperficie rendido muestra el contorno de la superficie del pólipo de coral y su contextoarreglo con pólipos adyacentes (ver vídeo SI). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. microscopía de fluorescencia de los pólipos de coral. (A) Sección transversal de un pólipo descalcificada de M. faveolata exhibiendo zooxantelas con autofluorescencia clorofila bajo luz azul (en verde) y los bolsillos de la mucosa etiquetados con aglutinina de germen de trigo (en rojo) como fueron fotografiadas con luz roja. La imagen es de baldosas de forma automática en dos canales y se cose y se alinea con el software del instrumento. (B) La ampliación de la caja se muestra en (A), que muestra las zooxantelas individuales (cada uno círculos verdes, aproximadamente 6-8 micras de diámetro en verde) y la capa de moco superficie (rojo), y la combinación de ambos canales. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6.-dos fotones caracterización espectral de fluorescencia de los corales. Usando el detector espectral del sistema LSM 710, las señales de fluorescencia de todo el espectro visible (419-722 nm) se escanearon en una profundidad de alrededor de 190 micras. La imagen muestra el intervalo de profundidad a 5 m en el eje x para la pila de z y el eje y es la longitud de onda 419-722 nm adquirió en el intervalo de 10 nm (un total de alrededor de 1154 mostraron imágenes). Uno puede ver los dos componentes espectrales, uno centrado en 500 nm y la segunda a 650 nm. A excitato láser de dos fotonestación longitud de onda de 780 nm se utilizó para obtener los perfiles de emisión. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Caracterización de los dos componentes espectrales. (A) El perfil espectral de fondo (azul), la autofluorescencia de cromatóforos (verde) y fluorescencia de la clorofila (rojo) excitado por la excitación de dos fotones de láser de longitud de onda de 780 nm láser. Los espectros derivados se muestra en el lado derecho de los datos espectrales y de color superpuesta multicolor pseudo-de acuerdo con el perfil de emisión. (B) Los contenedores espectrales individuales en los que se recogen las señales en el intervalo de 10 nm para obtener los espectros y la imagen en (A). Nota que los dos componentes distintos, uno con centro en aproximadamente 500 nm (autofluorescencia chromatophore) y la otra sobre 675 nm (fluorescencia de la clorofila). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8. Las mismas imágenes en las figuras 7A y 7B, los datos espectrales sin mezclar con el software y sus correspondientes picos de emisión / espectros. Tanto en M. annularis y M. faveolata, los componentes espectrales son muy similares, así como sus picos de emisión. La diferencia significativa, sin embargo, es debido a la ubicación de estos componentes espectrales y su abundancia (véase la Figura 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9.-Dos fotones de fluorescencia imágenes 3D de los pólipos de coral de M. annularis (AD) y M. faveolata (EH). (A y E) fueron imágenes sin separación espectral de componentes utilizando 780 nm de excitación del láser de dos fotones, con la señal óptica de recogida 450 a 700 nm. (B y F) fueron recogidos con la misma excitación (780 nm), pero dos detectores PMT se utilizan simultáneamente para recoger los datos de dos componentes, es decir., Uno 500-550 nm (autofluorescencia verde-chromatophore) y el otro 650- 720 nm (fluorescencia roja-clorofila). (C y G) son de profundidad codificada imágenes de(B y F), el rojo es menos profundo y azul son los componentes más profundos en 2D. (D y H) son imágenes yz de corte a través de (B y F), respectivamente, que muestran la fluorescencia viene sólo de la superficie de los corales y el esqueleto no tiene ninguna fluorescencia a 780 nm de excitación. Tenga en cuenta la diferencia sustancial en el contenido chromatophore entre las dos corales. El M. hábitat annularis (0-10 m WD) es menos profunda que la M. hábitat faveolata (10-20 m WD). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 Los Powers of Ten estructura espacial jerárquica de estudios of ecosistemas de arrecifes de coral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
SI Figura 1. tiros de pantalla que muestran las etapas (AI) que participan en la creación de volumen 3D y isosuperficie prestación de cualquiera de los datos SBFI o la microscopía 2Photon usando el software de análisis de imágenes (ver Materiales Tabla). (A) los cortes 2D de la prima datos en modo slice que muestran un solo plano; (B) volumen 3D de todos los cortes 2D; (C) el asistente de creación isosuperficie con una región de interés (ROI) seleccionada; (D) un algoritmo con una sustracción de fondo seleccionada; (E) un valor de umbral aplicada a recoger los píxeles que represent los datos; (F) de semillas puntos centrales de la superficie; (G) un filtro basado volumen se aplica para eliminar menor volumen de residuos y el ruido; (H) el final 3D isosuperficie prestados; (I) asistente clave de la animación fotograma para crear las películas como en los videos de la IS. Las imágenes finales prestados se muestran en ambas modalidades de volumen y isosuperficie en los Videos SI 3-7. El protocolo de los pasos 3.1.3-3.1.5 cubre estos procedimientos. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Materiales / Equipos | Empresa | Catálogo / Número de modelo | Comentarios / Descripción |
| Tejido Coral Skeleton | Ninguno | Ninguno | 2,5 cm BioPsy del hábitat natural |
| Arch Ponche Coring Device | CS Osborne y Empresa | N ° 149 | Para la recolección de la biopsia Coral |
| Paraformaldehído | Microscopía Electrónica de Ciencias | RT 15700 | 16% diluido Pre |
| Histoclear / Safeclear II | Microscopía Electrónica de Ciencias | RT 64111-04 | Alternativa no tóxica a Xileno, deshidratación y Deparafinization |
| Xileno y etanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Deshidratación |
| Cera de parafina | Richard Allen Científico | Tipo H REF 8338 | Solución de infiltración |
| Vybar | El Fabricante de velas | Ninguno | Componente de cera roja |
| Estearina | El Fabricante de velas | Ninguno | Componente de cera roja |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Fondo rojo de la cera-Opaco |
| Germen de Trigo aglutinina (WGA) | Life Technologies | W32466 | Para rotular Coral Moco |
| Prolong Oro | Life Technologies | P36095 | Medios de montaje anti-fade |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | Para dos fotones de imágenes |
| XY Motor, el conductor y el controlador | Lin Ingeniería | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Movimiento Traslacional |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting toda la cera |
| Horno de convección | Yamato | DX-600 | La infiltración e incrustación |
| Procesador de Tejidos | Leica | ASP 300 | |
| Microtomo | Leica | RM2055 | Cuchillos desechables |
| Microscopio estéreo | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objetivo |
| Microscopio de fluorescencia con ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert 200 M, ApoTome Sistema I | Imaging sección delgada de un pólipo: Zooxantelas |
| Cámara Axiocam | Carl Zeiss | MRm | Cámara monocromática 1388x1040 pixeles |
| Software Axiovision | Carl Zeiss | Versión 4.8 | Programa de adquisición de imagen |
| De dos fotones láser | Spectraphysics | Maitai EHP, láser pulsado (70 fs) | Con el módulo de DeepSee |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 con detector espectral | 34detección PMT canal |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 o superior | de dos fotones y adquisición de imágenes espectral |
| Imaris Software Suite | Bitplane, Inc., | Versión 7.0 o superior | Volumen 3D, renderizado Iso-superficie, Visualización |
Cuadro 1 materiales clave, equipos, microscopios y software utilizado en este estudio.
SI Video 1. In situ submarina de vídeo campo que muestra el hábitat coralino en 12 m WD de M. faveolata en Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. individual 2D imágenes de la cara del bloque de serie de la imagen renderizada en 3D se muestra en la Fi4E figura.
SI vídeo. 3 imagen de la cara de bloque serial Isosuperficie 3D prestados presenta en la Figura 4E y SI de vídeo 1, que muestra la topografía del pólipo de coral.
SI Video 4. volumen 3D representa la imagen de microscopía de datos en bruto de dos fotones del pólipo de coral M. faveolata. La excitación es de 780 nm y la emisión capturado simultáneamente en dos anchos de banda para las zooxantelas (pseudo-color rojo, 600-700 nm) y cromatóforos (pseudo-color verde, 500-550 nm).
SI Video 5. Imagen de microscopía de dos fotones del pólipo de coral M. volumen 3D prestados en Isosurface-spotsfaveolata. La excitación es de 780 nm y la emisión capturado simultáneamente en dos anchos de banda para las zooxantelas (pseudo-color rojo, 600-700 nm) y cromatóforos (pseudo-color verde, 500-550 nm).
SI Video 6. volumen 3D representa la imagen de microscopía de datos en bruto de dos fotones del pólipo de coral M. annularis. La excitación es de 780 nm y la emisión capturado simultáneamente en dos anchos de banda para las zooxantelas (pseudo-color rojo, 600-700 nm) y cromatóforos (pseudo-color verde, 500-550 nm).
SI Video 7. volumen 3D prestados Isosurface-spots imagen de microscopía de dos fotones del pólipo de coral M. annularis. La excitación es de 780 nm y la emisión capturado simultáneamente en dos anchos de banda para las zooxantelas (ps-eudo color rojo, 600-700 nm) y cromatóforos (pseudo-color verde, 500-550 nm).
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Discussion
Investigación de los arrecifes de coral es un esfuerzo de investigación altamente interdisciplinario, que involucra el análisis de la simultánea física, química, y los fenómenos biológicos que operan en el medio marino. Por lo tanto, mejor El estudio de los ecosistemas de arrecifes de coral complejos se completa dentro de un 'Powers of Ten' marco contextual (Figura 10). Esta compilación gráfico ilustra que el ecosistema de coral cubre una amplia gama de dimensiones espaciales (10 -9-10 5 m). Además, este ejercicio ilustra que geobiológico analiza en una longitud de escala intermedia de 1 mm-1 cm son el puente necesario para combinar campo y análisis de laboratorio. Este Powers of Ten marco es el contexto para los experimentos, análisis, modelado y síntesis de la física, química, y los parámetros biológicos que controlan los ecosistemas de arrecifes de coral de Curaçao.
El presente estudio es el primero en aplicar el o totalmente integrado en suitef FM, SBIF y técnicas CLSM para rastrear la respuesta de los corales aparentemente saludables para aumentar la profundidad del agua. Herramientas de microscopía de luz disponible para la imagen todo el tejido o muestras biológicas de espesor se han limitado debido a una variedad de limitaciones ópticas planteados por las propias muestras, que incluyen absorción, dispersión, y otros fenómenos. En tan sólo la última década, se utilizó microscopía electrónica de barrido SBFI a resoluciones ultra-alta 31, así como imágenes microscópicas de luz usando de campo amplio de formación de imágenes basado SBFI de varias muestras biológicas. Esto ha incluido el análisis de todo, desde el cerebro a los tejidos del corazón enteros e incluso muestras que contienen los huesos que eran de tierra, pulido, etiquetados, y fotografiado a la vez después de cada sección se hizo 23-29. Recientemente, se utilizan microscopía de fluorescencia y confocal para revelar los contornos, la forma y distribución de las proteínas y pigmentos en muestras biológicas 32-33. Sin embargo, la estructura 3D de individuales pólipos de coral had no ha resuelto previamente. El requisito previo para SBFI con muestras de coral es la descalcificación, como el carbonato de calcio se debe retirar antes de renderizar las muestras susceptibles de infiltración y seccionar utilizando un micrótomo regular.
Aquí es donde microscopía de fluorescencia de dos fotones se convierte en indispensable para el análisis de tejidos biológicos debido a sus únicos fenómenos de excitación de dos fotones. Esto llevó a la extendida 33-34 profundidad de penetración de los tejidos del coral en el presente estudio, en el que el paso de descalcificación fue eliminado de manera efectiva debido a la no lineal de excitación de dos fotones fenómenos 34. Además, el módulo de precompensación con el láser de dos fotones siempre mucho más corto de ancho de pulso, lo que mejoró adicionalmente la profundidad de penetración. En el lado de la muestra, ya que el carbonato de calcio no absorbe la luz en el infrarrojo cercano a 780 nm, la profundidad de penetración está limitada típicamente por la distancia de trabajo del objetivo. Sin embargo, otra desventaja of descalcificación y la eliminación de esqueleto de coral es la pérdida de la integridad estructural del tejido del coral, lo que hace que las estimaciones de volumen de tejido aún más difícil después de que la muestra ha pasado por varias etapas de deshidratación y rehidratación y la incrustación en cera libre de agua. Esto pone de relieve la importancia de determinar los volúmenes de tejido de coral, tanto antes como después del procesamiento.
La caracterización confocal de proteínas fluorescentes de coral se ha completado para los corales Gran Barrera de Coral y las propiedades espectrales de protección se han correlacionado con la profundidad del hábitat de coral 32. Sin embargo, en el presente estudio hemos demostrado por primera vez utilizando microscopía de dos fotones que hay una reducción sustancial de los cromatóforos en todas partes corales de aguas profundas, salvo en los tejidos de la boca. Además, los distintos cambios en la distribución de zooxantelas con respecto a los cromatóforos se ha observado a través de transectos de profundidad en M. annularis, where los tejidos de coral de aguas poco profundas están completamente cubiertos con cromatóforos. Con la resolución proporcionada por la proyección de imagen de alta magnificación (Figuras 8C y 8D), ahora podemos cuantificar con precisión el área y el volumen ocupado por las zooxantelas, y sus índices de densidad de tejido se puede determinar con respecto a otros componentes celulares. En conjunto, la integración de SBFI y la imagen espectral de fluorescencia de dos fotones en el presente estudio han dado vital importancia nuevos conocimientos sobre la morfología y estructura de los tejidos coralinos. Estos datos ayudará a cuantificar los componentes individuales de tejido del coral, ya sea a nivel individual o de pólipos en el nivel contextual de interacción entre pólipos coloniales en una cabeza de coral entero. Este contexto ahora permitirá la respuesta adaptativa del holobionte coral a los cambios en la profundidad del agua del nivel del mar y la irradiancia a ser cuantitativa seguimiento y predijo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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