Summary
Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare polipo morfologia e struttura del tessuto in coralli dei Caraibi Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescenza, blocco faccia seriale, e due fotoni laser microscopio confocale a scansione hanno identificato struttura lobate, pareti polipo, e chromatophore stimato e densità di zooxantelle e distribuzioni.
Abstract
Una suite integrata di tecniche di imaging è stata applicata per determinare il tridimensionale (3D), morfologia e struttura cellulare dei tessuti polipo che comprende la costruzione di coralli dei Caraibi barriera corallina Montastraea annularis e M. faveolata. Questi approcci includono microscopia a fluorescenza (FM), blocco di serie faccia di imaging (SBFI), e due fotoni laser microscopio confocale a scansione (TPLSM). SBFI fornisce l'imaging dei tessuti profondi dopo il sezionamento fisico; dettaglia la struttura della superficie del tessuto e la visualizzazione 3D per profondità tissutali di più di 2 mm. FM complementare e resa TPLSM immagini ad altissima risoluzione della struttura cellulare dei tessuti. I risultati sono: (1) identificato precedentemente non dichiarata morfologie del tessuto lobate sulla parete esterna dei singoli polipi corallini e (2) ha creato le prime mappe superficiali della distribuzione e del tessuto 3D densità di cromatofori e endosimbionti dinoflagellato alghe zooxantelle-like. Pisello assorbimento spettraleks di 500 nm e 675 nm, rispettivamente suggeriscono che M. annularis e M. faveolata contiene tipi simili di clorofilla e cromatofori. Tuttavia, M. annularis e M. faveolata presentano differenze significative nella densità dei tessuti e la distribuzione 3D di questi componenti cellulari fondamentali. Questo studio incentrato sui metodi di imaging indica che SBFI è estremamente utile per l'analisi di campioni di grandi dimensioni mm scala di tessuti di corallo decalcificata. FM gratuito e TPLSM rivelano sottili cambiamenti di scala submillimeter nella distribuzione cellulare e la densità in campioni di tessuto del corallo nondecalcified. La tecnica TPLSM offre: (1) la preparazione minimamente invasiva del campione, (2) la capacità sezionamento ottico superiore, e (3) l'assorbimento della luce minima e dispersione, pur permettendo l'imaging dei tessuti profondi.
Introduction
Il riscaldamento globale e di accompagnamento cambiamenti ambientali stanno interessando direttamente la salute e la distribuzione dei coralli tropicali marini 1-4. Sono stati osservati effetti multipli, tra cui sbiancamento dei coralli e la comparsa di malattie infettive 5-6. Tuttavia, la previsione più accurata della futura risposta corallo a queste minacce ambientali richiede che una "linea di base" istologica essere stabilito, che definisce la morfologia dei tessuti e la composizione delle cellule e la distribuzione dei coralli "apparentemente sani". A sua volta, "influenzati" coralli possono quindi essere confrontati quantitativamente. Inoltre, dovrebbe essere stabilito questa linea di base per i coralli apparentemente sani in una varietà di condizioni ambientali, in modo che "la risposta sana" può essere misurato attraverso gradienti ambientali. Come primo passo verso la creazione di questa linea di base, uno studio 3D ad alta risoluzione è stata intrapresa di come apparentemente polipo tessuto del corallo sanomorfologia e composizione cellulare risponde agli aumenti di profondità d'acqua (WD) e diminuzioni di accompagnamento alla luce del sole irraggiamento. I risultati possono poi essere utilizzati per stabilire una più completa comprensione meccanicistica di adattamento corallo, nonché al fine di conoscere l'evoluzione corallo simbionte e il miglioramento della raccolta della luce.
Coralli duri (Scleractinia) sono coloniali animali invertebrati marini che ospitano un complesso assemblaggio di altri microrganismi, indicate collettivamente come il corallo holobiont 7-10. La ricerca condotta nel presente studio si propone di utilizzare una suite di tecnologie di imaging all'avanguardia per monitorare contemporaneamente le modifiche con l'aumentare della profondità dell'acqua nei tessuti e pigmenti zooxantelle simbionti dei coralli ospitanti apparentemente sani. Questo stabilirà il tessuto comparativa cella "di base" necessaria attraverso un gradiente batimetrico per i coralli apparentemente sani e fungono da indicatori di corallo health 10. Pigmenti corallo, chiamato cromatofori, agiscono per assorbire, riflettere, dispersione, rifrangere, diffrangere, o in altro modo interferire con radiazione solare incidente 11. Il rapporto endosimbiontica zooxantelle-chromatophore ha permesso la coevoluzione di strategicamente vantaggiosa ottimizzazione della luce-raccolta e strategie di crescita scheletrica, nonché di plasticità trofica (strategie di alimentazione spostando avanti e indietro da autotrofia a eterotrofia) per il corallo animale 12.
Il sud dei Caraibi isola nazione di Curaçao (ex parte delle Antille olandesi) si trova a circa 65 km a nord del Venezuela nel nord-ovest trend Aruba-La Blanquilla arcipelago (Figura 1A). Il lungo 70 km costa meridionale di Curaçao contiene un continuo moderno e Miocene-Pliocene-Pleistocene-Olocene antico fringing reef di corallo tratto 13,14. SST media annuale su Curaçao varia di circa 3 ° C unnualmente, che vanno da un minimo di 26 ° C alla fine di gennaio ad un massimo di 29 ° C all'inizio di settembre, con una temperatura media annua di 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST Data Set, 2000-2010). La barriera corallina a Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), situata vicino alla punta nord-occidentale di Curaçao (Figura 1A), è stato scelto per il campionamento perché è stato già ben studiato e la ecosistema marino in questa località è immersa in acqua di mare fresco nonpolluted 7,15-19. . Due strettamente legate specie di coralli Scleractinia, M. annularis e M faveolata, sono stati scelti per la sperimentazione e l'analisi in questo studio perché ogni specie: (1) mostre nettamente diversi e non sovrapposti distribuzioni batimetriche sul tratto di barriera rispetto alla rottura scaffale e l' ambienti deposizionali carbonato sedimentari associati (gamma annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; figure 1B, 2A, e 2B); (2) è un costruttore quadro barriera corallina comune in tutto il Mar dei Caraibi 21; e (3) ha ben studiato ecologico, fisiologico, e le relazioni evolutive 22.
Campo di campionamento per il presente studio è stato condotto utilizzando tecniche standard di immersioni subacquee al largo di Playa Kalki su Curaçao. A poco a profondità batimetriche acqua transetto è stato stabilito che attraversava la mensola, durante la pausa scaffale, e negli ambienti di scogliera anteriori in acque profonde. A quanto pare teste di corallo sano sono stati poi identificati per il campionamento lungo questo transetto batimetrico, tra cui: (1) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. annularis, tutti erano a 5 m di profondità d'acqua (WD); e (2) tre singoli ~ 1 m di diametro teste di corallo di M. faveolata, tutti erano a 12 m di WD. Fotosinteticamente radiazione attiva (PAR) è stata misurata come 33-36% PAR a 5 m di WD e il 18-22% PAR a 10 m di WD. Il campionamento è stato condotto nel mese di gennaio, quando il SST era 26 ° C alle profondità dell'acqua sia del 5 me 12 m. Ciascuno di questi sei teste di corallo è stato campionamento in triplice copia a posizioni spaziali equivalenti (es., Circa 45 ° N di latitudine su ciascuna delle sei teste di corallo emisferiche). Ogni singolo campione consisteva di un corallo biopsia tessuto di base-scheletro 2,5 centimetri di diametro che è stato raccolto con un pugno arco pulito. Tre biopsie di tessuto-scheletro di corallo sono stati campionati in serie SCUBA con le mani guantate di ciascuna delle teste di corallo (9 da M. annularis colonie a 5 m di WD e 9 da M. faveolata a 12 m WD). Subito dopo la raccolta in profondità, ogni campione biopsia è stata posta in una sterile 50 ml provetta per centrifuga in polipropilene, tappo a vite sigillato, e tornò in superficie. L'acqua di mare è stato decantato da ciascuna provetta per centrifuga e ogni biopsia nucleo è stato poi immerso, immagazzinato e trasportato in paraformaldeide al 4%.
23-30. La maggior parte di questi studi utilizzati microscopia ottica / luce sia con fluorescenza o tecniche in campo chiaro. Tuttavia, sono stati condotti studi in ultra-alto ingrandimento con blocco elettronico a scansione seriale volto di imaging nel passato 31. Nel presente studio, un protocollo SBFI modificato è stato sviluppato e applicato alla coralli per la prima volta. Perché M. annularis e M. faveolata polipi corallini sono 1-2 mm di spessore, nessuna delle tecniche di microscopia luce di routine sarebbe in grado di penetrare l'intero spessore del tessuto del corallo polipi. Pertanto, abbiamo SBFI protocollo di preparazione del campione specificamente progettato per i campioni di corallo. Inoltre, abbiamo personalizzato progettato un titolare stereomicroscopio, Che è motorizzato per muoversi in entrambe le direzioni x ed y. Questo apparecchio prende immagini del volto blocco del campione piuttosto che raccogliere le sezioni utilizzando un microtomo regolare davanti al microscopio. Abbiamo anche introdotto un altro ottico a due fotoni tecnica microscopica non lineare per l'immagine degli stessi polipi corallini attraverso l'intero spessore dei tessuti di corallo. Questo supera le limitazioni imposte dalla SBFI in termini di decalcificazione e la possibilità di cambiamenti nella morfologia del tessuto e del volume (contrazione) che possono essere indotte dalla preparazione del campione (disidratazione) e protocolli di trattamento. Inoltre, i profili di emissione dei coralli sono spettralmente risolte per identificare le loro emissioni picchi e variazioni tra i cromatofori e zooxantelle fotosintetica. Questi risultati sono stati valutati nel contesto del metodo utilizzato e loro vantaggi individuali riguardanti tempo di acquisizione, tempi di analisi, e la capacità di risolvere dettagli fini strutturali senza compromettere structural integrità del tessuto del corallo.
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Protocol
NOTA: I reagenti devono essere preparati per Serial Block Volto Imaging di Coral Campioni
1 Preinfiltration Cera
- Sciogliere 3,6 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro. Mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C).
- Aggiungere 400 mg di Sudan IV (per ridurre al minimo la cera fluorescenza di fondo). Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso.
- Aggiungere 96 ml di paraffina fusa a caldo (100%) e mescolare bene.
1.2) Embedding Wax
- Sciogliere 7,2 g di fiocchi stearina in un bicchiere di vetro e mescolare bene su una piastra calda (60-70 ° C).
- Aggiungere 0,8 g di Sudan IV. Mescolare bene e attendere fino ad ottenere una soluzione trasparente rosso.
- Aggiungere granuli di paraffina (162 g) e mescolare fino a quando la paraffina si scioglie completamente.
- Aggiungere 30 g del bianco granulare Vybar e sciogliere completamente nello stesso bicchiere; una volta sciolto, mescolare.
- Liberamente chiudere la bottiglia di vetro con un coperchio. Posizionare la bottiglia di vetro in un 60 ° C convezione ovit per mantenere gli ingredienti in uno stato liquido. Effettuare tutte le infiltrazioni di questo forno.
- Dividere il volume totale della cera rossa 200 ml in due bottiglie di vetro da 100 ml. Utilizzare una aliquota di infiltrazione e l'altro per l'incorporamento finale.
1.3) Incorporare Coral tessuti per Serial Block Viso Imaging
- Lavare i polipi di corallo raccolti sul campo (SI Video 1) e memorizzati (3-6 mesi a 4-5 ° C in paraformaldeide) in tampone fosfato (3x 5 min) e decalcificazione quando è pronto per essere ripreso. Disincrostare il polipi in soluzione Excal per 24 ore o fino a quando i polipi sono totalmente prive di CaCO 3. Incubare diversi polipi di corallo decalcificata da un singolo blocco di una serie di 25, 50, 75 e 100% etanolo, seguito da 1x sostituto dello xilene a disidratare i campioni.
- Posizionare i polipi trattati in preriscaldato a 65 ° C forno contenente 100% sostituto di xilene. Incubare per 30 minuti due volte da Changing di soluzione fresca. Orientare i polipi in modo tale che la parte superiore dei polipi rivolto verso il basso e la superficie superiore è più piatta possibile.
- Fate soluzioni di 2: 1, 1: 1, e 1: 2 sostituto di xilene e cera preinfiltration (passo 1.1) in 50 ml provette Falcon.
- Incubare polipi corallini con queste tre concentrazioni crescenti di cera preinfiltration, seguita da 3x incubazione in cera preinfiltration 100% per 30-60 minuti ogni volta.
- Nota: A seconda dello spessore dei campioni, a pochi passi 1.3.1-1.3.5 potrebbero essere aumentati con periodi di tempo più lunghi.
- Spostare i campioni per l'incorporamento di cera (vedi punto 1.2.6), dopo incubazione 3x in cera preinfiltration 100%.
- Rimuovere la cera embedding dopo 30 min. Sostituire con cera incorporamento fresco e continuare l'incubazione per un minimo di 4 ore a 65 ° C.
1.4) Incorporare in cera rossa
- Fotografare il blocco (vassoio in acciaio inox dove la cera bianca è posto e sulla cui sommità della samPLE è collocato). Ciò è necessario perché una volta incorporato nella cera, la posizione del campione diventa invisibile come la cera rossa incorporamento è opaco.
- Mettere piccole gocce di cera alto punto di fusione intorno al nuovo in acciaio inox stampo embedding preriscaldato e lasciarlo raffreddare. Versare una piccola quantità di cera appena fuso integrazione da secondo contenitore, come indicato al punto 1.2.6.
- Posizionare il polipo di corallo rivolto verso il basso rapidamente sopra il puntino cera bianca, quindi inserire un portacampioni plastica sul vassoio di acciaio inossidabile e versare cera più incorporamento in modo che la cera si avvicina alla superficie dello stampo di plastica.
- Prendere l'intera impostazione di 65 ° C forno e lasciare raffreddare su una panchina o su una superficie fredda fino a quando la cera si indurisce completamente.
- Questo può richiedere fino a 6 ore giorno o due. Posizionare il blocco essiccata in frigorifero a 4 ° C, al riparo dalla luce, per la conservazione a lungo termine.
1.5) il sezionamento a Serial Setup Block Viso
- Trim il blocco e tagliare 1 micron sezioni con un microtomo. Non raccogliere le sezioni in cui diventerà come polvere. Ricordate, stiamo Imaging solo il volto blocco. Il campione appare quando la cera bianca comincia a scomparire.
- Cattura immagini del viso liscia blocco che contiene il campione ogni volta che una sezione viene rimosso. Continuare fino a quando il polipo del corallo scompare come in SI Video 2.
- Record / Cattura le immagini con una macchina fotografica in bianco e nero usando un filtro fluorescente FITC per prendere l'auto-fluorescenza del cromatofori / corallo polipo. Immagine 3-4 nuclei decalcificati di ciascuna specie.
2. Imaging Coralli Sotto due fotoni microscopia a fluorescenza
- Fissare nuclei polipo di corallo, ciascuno contenente circa 10-12 polipi di circa un centimetro di diametro, in 4% paraformaldeide presso il sito di raccolta (riva del mare) non appena vengono raccolte sotto l'acqua.
- I campioni a 4 ° C fino imaging. Nuclei Lavato sono collocati in the stessa soluzione a testa in giù in un piatto fondo di vetro di copertura (spessore di 0,17 millimetri).
- Utilizzando un laser a due fotoni a 780 nm di eccitazione, immagine 3-4 polipi in due diversi ingrandimenti (zoom digitale) con un (NA 0,3) obiettivo 10X. La forma dei polipi del corallo e l'altezza varia tra i campioni (di solito 1-2 mm) e la profondità delle immagini è anche limitata dalla distanza di lavoro del oggettivo di imaging.
- Utilizzare la modalità di scansione tegola per la raccolta di circa 25-100 (5 x 5 o 10 x 10 piastrelle) immagini al piano focale di 50-100 xy e immagini attraverso l'asse Z a intervalli di 10 o 20 micron, un totale di circa 5.000-10.000 immagini / polipi del corallo.
- Immagine 3-4 aree polipo per rappresentare una specie di base e corallo. NOTA: L'immagine tempo di acquisizione varia tra 2-5 hr zona / polipo.
- Memorizzare tutte le immagini in formato RAW in disco rigido del sistema LSM 5 rendering 3D in una analisi di immagini 3D e software di rendering.
3. 3D Volume Rendering e Visualization di SBFI e due fotoni Spectral fluorescenza dati
- Ritagliare i dati 2D per ridurre la dimensione del file, concentrandosi su un singolo polipo utilizzando lo strumento di ritaglio quadrato nel programma e compilare come un unico file tiff (ridurre le dimensioni del file anche salvando il file in formato 8 bit) nel software di acquisizione.
- Aprire i file montati dei dati SBFI (raccolti nella fase 1.5.1) o le piastrelle più z-pile di sezioni ottiche a due fotoni (raccolti nella fase 2.1.4) nel programma Imaris modulo Surpass sotto algoritmo di volume.
- Proiettare i dati SBFI resi in 3D utilizzando una proiezione dell'ombra. Creare una modalità isosurface dove i voxel sono thresholded per creare un modello di superficie solida (SI Video 3).
- Visualizza le proiezioni in 3D utilizzando un algoritmo piano di ritaglio a xy, xz, yz e modalità ortogonali per rivelare la struttura 3D e la forma dei coralli.
- Animare le proiezioni con un modulo di un'animazione fotogramma chiave nello stesso programma Imaris (SI Videos 3-7).
- Generare i file video al 5% di compressione e generare un clip filmato in formato avi utilizzando il volume (SI Video 4 e 6), 3D e Isosurface modalità (SI Video 5 e 7).
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Representative Results
Un apparato SBFI progettato su misura (realizzato appositamente per il presente studio, Figura 3) ha prodotto le prime dettagliate mappe 3D digitali di elevazione (DEM) della struttura della superficie esterna e la morfologia del M. annularis e M. polipi corallini faveolature (Figura 4 e SI Video 1-2). Questo ha prodotto immagini di lobi sovrapposti precedentemente non descritta di tessuto del corallo concentrica irradia verso l'esterno dal centro di ogni (4B figure, 4D e 4E) polipo. Questi lobi sono accatastati lungo la cresta superiore di tessuto ricoperto di setti scheletrica primaria e secondaria, con i radialmente più esterno e più profondi lobi elevazione alla fine la sintesi e la fusione con i tessuti coenosarc tra polipi. La forma polipi 3D e i lobi associati sono stati ben conservati nonostante il campione di tessuto del corallo dopo aver attraversato diverse fasi di infiltrazione ad alta temperatura e incorporamento. Il SUPPLEMENTARIn di colorante Sudan mascherato successo background come opaco, con il colore nero aver contribuito a massimizzare il contrasto di ciascun campione e aumentare il rapporto segnale-rumore. 3D e viste ortogonali piane mostrato la distribuzione di componenti fluorescenti lungo l'asse z (Figura 4B). C'erano aerei con scaglie di cera che a volte oscuravano polipo dettagli della superficie, che sono stati rimossi per chiarezza durante la creazione di proiezioni. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel rivelare dettagli interni di un campione di spessore, eliminando così la necessità di adottare più sezioni e allinearle in un secondo momento. Inoltre, le immagini in questa tecnica sono già allineati quando raccolti (Figura 4A), fornendo la risoluzione az fino a 1 micron da un campione uguale o superiore fino a 10 mm (a seconda della distanza totale di unità del supporto blocchetto nel microtomo ). E 'possibile discriminare diversi componenti auto-fluorescente (utilizzando più filtri), così come individuozooxantelle a maggiore ingrandimento, a condizione che il campo ridotto di vista è accettabile.
Il sezionamento ottico microscopio a fluorescenza apotome rivelato la distribuzione di tessuti cellule di corallo (zooxantelle e cromatofori) e la struttura dei tessuti della superficie con una risoluzione submillimetrica. Quindi, il diametro 6-13 micron zooxantelle potrebbe essere facilmente riconosciuto e quantificato rispetto al numero di cellule per volume tissutale (Figura 5). La doppia acquisizione delle immagini del canale utilizzando la fluorescenza della clorofilla (verde) e il muco etichettato con WGB Alexa 647 (mostrato in rosso), ha lavorato meglio per quantificare il livello di muco e il numero di zooxantelle all'interno di un determinato luogo del polipo (maggiore e minore setti di polipi potrebbe essere calcolato in modo indipendente).
Oltre a questi approcci microscopio, abbiamo anche applicato TPLSM, una tecnica non lineare ampiamente utilizzato per campioni biologici spessi. I vantaggi principali di TPLSM oltre ile-fotone laser a onda continua sono che: (1) l'eccitazione si verifica solo nel punto di messa a fuoco perché il potere della intensità della luce di eccitazione diventa quadrato e la possibilità di una molecola di assorbire due fotoni consecutivi per eccitare un elettrone dal fluoroforo è limitato alla profondità di campo dell'obiettivo, fornendo così un parafocalità intrinseca. e (2) di conseguenza non ci sarà alcuna perdita di un fotone di eccitazione mentre penetra più in profondità nel campione, al contrario di laser singoli fotoni. Inoltre, la maggior parte dei campioni di tessuti biologici assorbono anche la luce visibile. Dal momento che l'eccitazione a due fotoni è intrinsecamente lunga (nel vicino infrarosso a 780 nm), l'assorbimento è anche sostanzialmente ridotto al minimo. D'altra parte, lo scheletro di corallo composto di carbonato di calcio assorbe poco o disperde la luce a due fotoni. Infine, dato che eravamo interessati a determinare la distribuzione degli oggetti solo sulla superficie sagomata dello scheletro del corallo, abbiamo trovato l'imaging profondo utilizzando questa modalità very adatto per l'imaging del corallo.
Abbiamo cercato di caratterizzare le firme spettrali disponibili in M. annularis (Figure 6-9). Qui mostriamo che sotto il 780 nm eccitazione a due fotoni, l'chromatophore auto-fluorescenza ha un picco a circa 500 nm, mentre la fluorescenza della clorofilla da zooxantelle è centrata a circa 675 nm (Figura 6). Mentre unmixing di questi dati spettrali (Figure 6-7) è possibile anche con un algoritmo unmixing nel software (Figura 8), poiché non vi è una chiara distanza spettrale tra le due componenti, l'imaging contemporaneamente utilizzando due rivelatori a due bande di emissione dimostrato per essere più tecnica di risparmio di tempo. Questo è particolarmente vero quando il campione è piastrellato e ripreso su un intero 1-2 mm di profondità del tessuto. Questo elimina la necessità di sezionamento fisico, che richiede diverse migliaia di immagini per la posizione e campione e polipi. La distribuzione o f cromatofori auto-fluorescente è anche distinto (Figura 9) tra le due specie di coralli testate. In un caso, abbiamo osservato un significativo aumento del cromatofori in profonda-acqua dimora corallo M. annularis rispetto all'acqua più profonda M. faveolata (Figura 9 e SI Video 3 e 4).
Figura 1 (A) Mappa di Curaçao nel Mar dei Caraibi a sud, che mostra la posizione del sito di studio a Playa Kalki sulla costa sottovento lontano nord-occidentale dell'isola. (B) Schema di sezione trasversale della piattaforma corallina con la montatura a Playa Kalki su Curaçao, mostrando le distribuzioni profondità d'acqua di M. annularis e M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 (A) in situ fotografia subacquea campo a 12 m WD di M. faveolata a Playa Kalki, Curaçao. (B) Primo piano ingrandimento dell'immagine in (A) mostra i singoli polipi corallini di M. faveolata in condizioni di luce diurna (ogni polipo è di circa 2 mm di diametro, alcuni dei quali sono rientrati, indicato con *). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3 La strumentazione di imaging blocco-faccia seriale. (A e B) Il titolare microscopio progettato su misura, detiene il microscopio Stereolumar a 180 ° di fronte al viso blocco del campione posto in microtomo. Quando ogni sezione è stato rimosso, l'immagine blocco faccia è stata catturata con l'obiettivo ei dati 2D è stato memorizzato digitalmente. Ciò è stato fatto fino a quando il campione scomparso nel blocco. Il microscopio viene spostato in direzione x e y con una madrevite motorizzato e la z, la regolazione viene effettuata per mettere a fuoco il campione. E 'importante notare che quando ogni 1 micron campione viene sezionato, il blocco si muove 1 micron in avanti, in modo da una ridefinizione del campo di applicazione non è necessario. XYMOT, personalizzato costruito xy motorizzato fase traslazionale; FLS, fonte di luce di fluorescenza; MT, microtomo; MIC, Stereomicroscopio; CAM, AxioCam macchina fotografica in bianco e nero; BH, Block titolare; BF, Blocco volto diil campione; FLL, macchia fluorescente luce di eccitazione sul viso blocco; OBJ, obiettivo microscopio; HIP, pannello di interfaccia umana. Una immagine a dimensione di 1.388 x 1.040 pixel orizzontali verticali in modalità monocromatica è stato raccolto in un pixel xy (singolo) Risoluzione di 1,25 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura faccia 4 blocco serie di immagini dei coralli M. annularis e M. faveolata raccolti da Playa Kalki, Curaçao. dati (A) dei campioni di galleria che mostra circa 800 immagini di singole immagini 2D ottenute da un polipo alla risoluzione di 1 micron di z. (B) In un altro campione di corallo, il sezionamento è andato ben oltre 2,000 micron a z. L'immagine sta mostrando più polipi e la compilazione di tutte le sezioni 2D in un volume 3D sotto l'ombra di proiezione utilizzando l'algoritmo di visualizzazione del volume Imaris. (C) ortogonale proiezione che mostra una vista XZ del campione in (B), si può vedere tutta la profondità del campione superiore a 2 mm e le frecce indicano le linee nere dove fette 2D sono stati rimossi a causa di scarsa qualità; questa immagine è da M. annularis. Volume 3D (D), isosurface di rendering (E) e la visualizzazione dei dati SBFI. (D) multipli polipi dei coralli mostrano la morfologia polipo in sezione longitudinale sul lato e il volume 3D (ombra proiezione) di un singolo polipo nel mezzo. Sezionamento e la visualizzazione da qualsiasi angolazione è possibile in 3D (vedi SI video). E. Poiché voxel sono fuzzy in 3D (D), la superficie 3D rendering isosurface mostra il contorno della superficie del polipo del corallo e la loro contestualeaccordo con polipi adiacenti (vedi SI video). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5 microscopia a fluorescenza dei polipi corallini. (A) Sezione trasversale di un polipo decalcificata di M. faveolata espositrici zooxantelle con clorofilla autofluorescenza sotto luce blu (in verde) e tasche mucose marcati con germe di grano agglutinina (mostrato in rosso) come fotografato sotto luce rossa. L'immagine è piastrellato automaticamente in due canali e cucita e allineato con il software dello strumento. (B) L'allargamento del dialogo mostrata in (A), che mostra zooxantelle individuale (ognuno verde cerchi, Approxinell'intervallo 6-8 micron di diametro in verde) e lo strato di muco superficiale (rosso), e la fusione di entrambi i canali. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6 a due fotoni Caratterizzazione spettrale della fluorescenza da coralli. Usando il rivelatore spettrale del sistema LSM 710, segnali di fluorescenza di tutto lo spettro visibile (419-722 nm) sono stati scansiti una profondità di circa 190 micron. L'immagine mostra l'intervallo di profondità a 5 micron di x sull'asse per lo stack z e l'asse y è la lunghezza d'onda 419-722 nm acquisito in 10 intervalli nm (per un totale intorno a 1.154 immagini hanno mostrato). Si possono vedere i due componenti spettrali, uno centrato a 500 nm ed il secondo a 650 nm. Un laser EXCI due fotonizione lunghezza d'onda di 780 nm è stato utilizzato per ottenere i profili di emissione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7 Caratterizzazione dei due componenti spettrali. (A) Il profilo spettrale di sfondo (blu), autofluorescenza da cromatofori (verde) e fluorescenza della clorofilla (rosso) eccitato dalla due fotoni eccitazione laser di lunghezza d'onda di 780 nm del laser. Gli spettri derivata visualizzata sul lato destro dei dati spettrali multicolore sovrapposti e colorato pseudo-secondo il profilo delle emissioni. (B) I singoli contenitori spettrali dove i segnali sono raccolti a 10 nm intervallo per ricavare gli spettri e l'immagine in (A). Nota che i due componenti distinte, una centrata a circa 500 nm (chromatophore autofluorescenza) e l'altro di 675 nm (fluorescenza della clorofilla). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 8 Le stesse immagini nelle Figure 7A e 7B, dati spettrali non miscelato con il software e le loro corrispondenti picchi di emissione / spettri. Sia M. annularis e M. faveolata, le componenti spettrali sono molto simili, come pure i loro picchi di emissione. La differenza significativa, tuttavia, è dovuto alla posizione di questi componenti spettrali e loro abbondanza (vedi Figura 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9. Due fotoni di fluorescenza immagini 3D di polipi di corallo da M. annularis (AD) e M. faveolata (EH). (A ed E) sono stati ripreso senza separazione spettrale dei componenti utilizzando 780 nm del laser di eccitazione a due fotoni, con il segnale ottico raccolto 450-700 nm. (B e F) sono stati raccolti con la stessa eccitazione (780 nm), ma due rivelatori PMT sono stati utilizzati contemporaneamente per raccogliere i dati provenienti da due componenti es., Un 500-550 nm (verde-chromatophore autofluorescenza) e l'altra 650- 720 nm (rosso-fluorescenza della clorofilla). (C e G) sono codificati immagini di profondità(B e F), il rosso è meno profondo e blu è più profonde componenti in 2D. (D e H) sono immagini yz di tagliare (B e F), rispettivamente, mostrando la fluorescenza proviene solo dalla superficie del corallo e lo scheletro non ha alcuna fluorescenza a 780 nm di eccitazione. Si noti la sostanziale differenza di contenuto chromatophore tra i due coralli. Il M. annularis habitat (0-10 m WD) è meno profonda della M. habitat faveolata (10-20 m WD). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 10 I Powers of Ten gerarchica struttura spaziale di studi of ecosistemi delle barriere coralline. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
SI Figura 1 colpi di schermo che mostrano passi (AI) coinvolte nella creazione di volumi 3D e il rendering isosurface da entrambi i dati SBFI o microscopia 2Photon utilizzando il software di analisi di immagine (vedi Materiali Tavolo). (A) le fette 2D del grezzo dati in modalità fetta mostrando un unico piano; (B) volume 3D di tutte le sezioni 2D; (C) la procedura guidata di creazione isosurface con una regione di interesse (ROI) selezionata; (D) un algoritmo con una sottrazione sfondo selezionato; (E) un valore di soglia applicata per raccogliere i pixel che rappret dati; (F) punti seme centro della superficie; (G) un filtro basato sul volume è applicata per eliminare minore volume di detriti e rumore; (H) il 3D rendering finale isosurface; (I) chiave mago dell'animazione fotogramma per creare il film, come nei video SI. Le immagini finali resi vengono mostrati in entrambe le modalità di volume e Isosurface nel SI Video 3-7. Il protocollo passi 3.1.3-3.1.5 copre queste procedure. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Materiale / dotazione | Azienda | Catalogo / Numero di modello | Commenti / Descrizione |
| Tessuto del corallo Skeleton | Nessuno | Nessuno | 2,5 centimetri BIOPSY da habitat naturale |
| Arch Punch carotaggio dispositivo | CS Osborne and Company | No. 149 | Per la collezione biopsia Coral |
| Paraformaldeide | Electron Scienze Microscopia | RT 15700 | 16% pre-diluito |
| Histoclear / Safeclear II | Electron Scienze Microscopia | RT 64111-04 | Supplente non tossico per xilene, disidratazione e Deparafinization |
| Xilene e Etanolo | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Disidratazione |
| Paraffina | Richard Allen scientifico | Tipo H REF 8338 | Soluzione Infiltrazione |
| Vybar | La candela Maker | Nessuno | Componente di cera rossa |
| Stearina | La candela Maker | Nessuno | Componente di cera rossa |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Sfondo rosso Cera-opaco |
| Germe di Grano Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | Per l'etichettatura Coral Muco |
| Prolong Oro | Life Technologies | P36095 | Mezzo di montaggio Anti-fade |
| Fluoro Dish | Mondo Strumenti di precisione | FD-35-100 | Per l'imaging a due fotoni |
| XY motore, driver e controller | Lin Ingegneria | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY traslazionale Movimento |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting tutta la cera |
| Forno a convezione | Yamato | DX-600 | Infiltrazione e l'inclusione |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | |
| Microtome | Leica | RM2055 | Coltelli monouso |
| Microscopio Stereo | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 millimetri WD) Obiettivo |
| Fluorescenza Microscopio con apotome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, apotome I Sistema | Imaging sezione sottile di un polipo: zooxantelle |
| Fotocamera AxioCam | Carl Zeiss | MRm | Telecamera monocromatica 1388x1040 pixel |
| AxioVision Software | Carl Zeiss | Versione 4.8 | Programma di acquisizione immagine |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai EHP, laser pulsato (70 fs) | Con modulo DeepSee |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 con rivelatore Spectral | 34canale di rilevamento PMT |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 o sopra | per due fotoni e acquisizione dell'immagine spettrale |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Versione 7.0 o superiore | Volume 3D, Rendering Iso-superficie, visualizzazione |
Tabella 1. materiali chiave, attrezzature, microscopi, e software utilizzati in questo studio.
SI Video 1. In situ video di campo subacqueo che mostra l'habitat di corallo a 12 m WD di M. faveolata a Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. immagini blocco faccia seriale individuale 2D dell'immagine 3D rendering mostrato in Fifigura 4E.
SI Video. 3 isosurface immagine 3D faccia blocco seriale resi presentato in Figura 4E e SI video 1 mostra la topografia del polipo del corallo.
SI Video 4. volume 3D rendering dati grezzi due fotoni immagine di microscopia del polipo di corallo M. faveolata. L'eccitazione è 780 nm e l'emissione catturato simultaneamente in due larghezze di banda per zooxantelle (pseudo-colore rosso, 600-700 nm) e cromatofori (pseudo-colore verde, 500-550 nm).
SI Video 5. del volume 3D resi in Isosurface-spot a due fotoni immagine di microscopia del polipo di corallo M.faveolata. L'eccitazione è 780 nm e l'emissione catturato simultaneamente in due larghezze di banda per zooxantelle (pseudo-colore rosso, 600-700 nm) e cromatofori (pseudo-colore verde, 500-550 nm).
SI Video 6. volume 3D rendering dati grezzi due fotoni immagine di microscopia del polipo di corallo M. annularis. L'eccitazione è 780 nm e l'emissione catturato simultaneamente in due larghezze di banda per zooxantelle (pseudo-colore rosso, 600-700 nm) e cromatofori (pseudo-colore verde, 500-550 nm).
SI Video 7. volume 3D resi Isosurface-spot immagine microscopia a due fotoni del polipo di corallo M. annularis. L'eccitazione è 780 nm e l'emissione catturato simultaneamente in due larghezze di banda per le zooxantelle (pseudo color rosso, 600-700 nm) e cromatofori (pseudo-colore verde, 500-550 nm).
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Discussion
Ricerca barriera corallina è uno sforzo di ricerca fortemente interdisciplinare, che coinvolge l'analisi della simultanea fisiche, chimiche e fenomeni biologici che operano in ambiente marino. Lo studio di complessi ecosistemi delle barriere coralline è quindi meglio completata entro un 'Powers of Ten' quadro contestuale (Figura 10). Questa grafica compilation dimostra che l'ecosistema corallo copre una vasta gamma di dimensioni spaziali (10 -9 a 10 5 m). Inoltre, questo esercizio dimostra che geobiologico analizza in un intermedio lunghezza scala 1 mm-1 centimetro sono il ponte necessario per combinare campo e analisi di laboratorio. Questo Powers of Ten quadro è il contesto per gli esperimenti, analisi, modellazione e sintesi della fisica, chimica, e parametri biologici che controllano Curaçao ecosistemi delle barriere coralline.
Il presente studio è il primo ad applicare la suite o completamente integratof FM, SBFI e tecniche CLSM per monitorare la risposta dei coralli apparentemente sani per aumentare la profondità dell'acqua. Strumenti di microscopia ottica a disposizione di immagine tutto il tessuto o campioni biologici spessi sono stati limitati a causa di una serie di vincoli ottici posti dai campioni stessi, che includono l'assorbimento, dispersione, e altri fenomeni. Nel giro degli ultimi dieci anni, SBFI microscopia elettronica a scansione è stato utilizzato a ultra-alta risoluzione 31 così come la luce di imaging microscopico con grande campo base SBFI immagini di diversi campioni biologici. Questo ha incluso analisi di tutto, dalle cervello ai tessuti cardiaci intere e persino campioni contenenti ossa che erano a terra, lucido, etichettati, e ripreso al tempo stesso dopo ogni sezione è stata fatta 23-29. Recentemente, microscopia a fluorescenza e confocale sono stati usati per rivelare i contorni, la forma, e la distribuzione di proteine e pigmenti in campioni biologici 32-33. Tuttavia, la struttura 3D dei singoli polipi di corallo had non è stato precedentemente risolto. Il prerequisito per SBFI con i campioni di corallo è la decalcificazione, come il carbonato di calcio deve essere rimosso prima del rendering dei campioni suscettibili di infiltrazione e di sezionamento con un microtomo normale.
Questo è dove due fotoni microscopia a fluorescenza diventa indispensabile per l'analisi di tessuti biologici per le sue uniche fenomeni di eccitazione a due fotoni. Ciò ha portato a estesa profondità di penetrazione 33-34 dei tessuti coralline del presente studio, in cui la fase di decalcificazione è stato effettivamente eliminato a causa della non lineare a due fotoni di eccitazione fenomeni 34. Inoltre, il modulo precompensazione con il laser a due fotoni disponibile larghezza di impulso molto più breve, che ulteriormente migliorata profondità di penetrazione. Sul lato del campione, dal momento che il carbonato di calcio non assorbe la luce nel vicino infrarosso a 780 nm, la profondità di penetrazione è limitata in genere la distanza di lavoro dell'obiettivo. Ancora un altro svantaggio ola decalcificazione F e la rimozione dello scheletro del corallo è la perdita di integrità strutturale del tessuto del corallo, che rende le stime di volume dei tessuti ancora più difficile dopo che il campione è passato attraverso più passaggi di disidratazione e reidratazione e l'inclusione in cera senza acqua. Questo sottolinea l'importanza di determinare i volumi di tessuto di corallo sia prima che dopo l'elaborazione.
La caratterizzazione confocale di proteine fluorescenti del corallo è stata completata per i coralli Grande Barriera Corallina e le proprietà spettrali di protezione sono stati correlati con la profondità dell'habitat corallo 32. Tuttavia, nel presente studio abbiamo dimostrato per la prima volta usando la microscopia a due fotoni che vi è una sostanziale riduzione di cromatofori ovunque nel profondo corallo acqua, tranne nei tessuti della bocca. Inoltre, i cambiamenti distinti nella distribuzione delle zooxantelle rispetto ai cromatofori è stata osservata attraverso transetti di profondità in M. annularis, where tessuti di corallo in acque poco profonde sono completamente coperti con cromatofori. Con la risoluzione fornita dal immagini ad alto ingrandimento (Figure 8C e 8D), ora possiamo quantificare con precisione l'area e il volume occupato dal zooxantelle, e per i rapporti di densità del tessuto può essere determinato rispetto ad altri componenti cellulari. Nel loro insieme, l'integrazione dei SBFI e due fotoni di fluorescenza di imaging spettrale nel presente studio hanno prodotto di vitale nuove importanti intuizioni nella morfologia e la struttura dei tessuti di corallo. Questi dati contribuirà a quantificare i singoli componenti del tessuto del corallo, sia a livello individuale o di polipi a livello contestuale di interazione tra polipi coloniali su un'intera testa di corallo. Questo contesto sarà ora permettere la risposta adattativa del holobiont corallo alle variazioni di profondità del livello del mare e irraggiamento da quantitativa rintracciato e previsto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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