Summary
En integrert pakke med bildeteknikker har blitt brukt for å bestemme polypp morfologi og vev struktur i Karibia koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Fluorescens, serie blokk ansikt, og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi har identifisert lobate struktur, polypp vegger, og estimert chromatophore og zooxanthellae tettheter og fordelinger.
Abstract
En integrert pakke med bildeteknikker har blitt brukt for å bestemme den tredimensjonale (3D) morfologi og cellestruktur av polypp vev bestående Karibia rev bygningen koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Disse metodene inkluderer fluorescens mikroskopi (FM), serie blokk ansiktet imaging (SBFI), og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi (TPLSM). SBFI gir dype vev bildebehandling etter fysisk seksjonering; Det detaljer vev overflatestruktur og 3D-visualisering til vev dybder på mer enn 2 mm. Komplementær FM og TPLSM avkastning ultra-høyoppløselige bilder av vev cellestruktur. Resultatene er: (1) identifisert tidligere har vært rapportert fliket vev morfologier på den ytre vegg av individuelle korall polypper, og (2) skapte de første overflatekart av 3D-fordeling og tetthet av vev chromatophores og algelignende dinoflagellate zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorpsjon ertks 500 nm og 675 nm på henholdsvis, antyder at M. annularis og M. faveolata inneholde lignende typer klorofyll og chromatophores. Imidlertid, M. annularis og M. faveolata oppviser betydelige forskjeller i vevet tetthet og 3D fordeling av disse viktige cellulære komponenter. Denne studien fokuserer på avbildningsmetoder indikerer at SBFI er svært nyttig for analyse av store mm-skjellprøver av decalcified korall vev. Gratis FM og TPLSM avsløre subtile Submillimeter skala endringer i mobilnettet fordeling og tetthet i nondecalcified korall vevsprøver. Den TPLSM teknikken gir: (1) minimalt invasiv prøvepreparering, (2) overlegen optisk snitte evne, og (3) minimal lys absorpsjon og spredning, samtidig som tillater dype vev avbildning.
Introduction
Global oppvarming og medfølgende miljøendringer er direkte påvirker helse og fordelingen av tropiske marine koraller 1-4. Flere virkninger blir observert, inkludert korallbleking og fremveksten av smittsomme sykdommer 5-6. Imidlertid vil mer nøyaktig prediksjon av fremtidig korall svar på disse miljøtrusler krever at en histologisk "baseline" etableres, som definerer vev morfologi og celle sammensetning og fordeling for "tilsynelatende friske" koraller. I sin tur, "påvirket" koraller kan deretter kvantitativt forhold. Videre bør dette baseline etableres for tilsynelatende friske koraller under en rekke miljøforhold, slik at "sunn reaksjon" kan også måles på tvers av miljø gradienter. Som et første skritt mot å etablere denne baseline, har en høyoppløselig 3D studie foretatt av hvordan tilsynelatende sunn koraller polypp vevmorfologi og cellulær sammensetning reagerer på økninger i vanndybde (WD) og tilhørende reduksjon i sollys irradians. Resultatene kan så brukes til å etablere en mer omfattende forståelse av mekanistisk korall tilpasning, samt å få innsikt i korall-symbiont evolusjon og forbedring av lys høsting.
Steinkoraller (Scleractinia) er koloni marine virvelløse dyr som spiller vertskap for en kompleks samling av andre mikroorganismer, kollektivt referert til som koraller holobiont 7-10. Forskningen foretatt i denne studien søker å bruke en pakke med cutting-edge imaging teknologi å samtidig spore endringer med økende vanndyp i vevet pigmenter og symbiotisk zooxanthellae av tilsynelatende friske verts koraller. Dette vil etablere den nødvendige sammenlignende vev celle "baseline" over en batymetrisk gradient for tilsynelatende friske koraller og fungere som indikatorer på koraller heaLTH 10. Korall pigmenter, kalt chromatophores, handle for å absorbere, reflektere, scatter, brekker, diffract, eller på annen måte forstyrre hendelsen solstråling 11. Den zooxanthellae-chromatophore endosymbiotic forholdet har aktivert coevolution strategisk fordelaktig lys-høsting optimalisering og skjelettvekststrategier, samt trofiske plastisitet (skiftende fôringsstrategier back-og-tilbake fra autotrophy å heterotrophy) for koraller dyr 12.
Den sørlige karibiske øya nasjon av Curaçao (tidligere en del av De nederlandske Antillene) ligger ca 65 km nord for Venezuela i øst-vest trending Aruba-La Blanquilla skjærgården (figur 1A). Den 70 km lange sørkysten av Curaçao inneholder en kontinuerlig moderne og miocen-pliocen-pleistocen-Holocene gamle fringing korallrev kanalen 13,14. Gjennomsnittlig årlig SST på Curaçao varierer ca 3 ° C enett år om gangen, alt fra et minimum på 26 ° C i slutten av januar til maksimalt 29 ° C i begynnelsen av september, med en gjennomsnittlig årlig temperatur på 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST datasett, 2000-2010). Korallrevet ved Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), liggende nær nordvestspissen av Curaçao (figur 1A), ble valgt for prøvetaking fordi det har vært tidligere godt studert og marine økosystem på dette stedet er badet i frisk nonpolluted sjøvann 7,15-19. . To nært beslektede scleractinian korallarter, M. annularis og M faveolata, ble valgt for eksperimentering og analyse i denne studien fordi hver art: (1) utstillinger distinkt forskjellige og nonoverlapping batymetriske distribusjoner på rev veiene med hensyn til sokkelen pause og assosiert karbonat sedimentære avsetningsmiljø (M. annularis range = 0-10 m WD; M. faveolataområde = 10-20 m WD 20; figurene 1B, 2A og 2B); (2) er en vanlig korallrev rammeverk byggmester hele det karibiske hav 21; og (3) har godt studert økologiske, fysiologiske, og evolusjonære relasjonene 22.
Feltet prøvetaking for denne studien ble gjennomført ved hjelp av standard dykking teknikker offshore av Playa Kalki på Curaçao. Et grunt til dypt vann batymetriske transekt ble etablert som kjørte over sokkelen, over sokkelen pause, og inn i de dype vann forgrunnen rev miljøer. Tilsynelatende friske koraller hoder ble deretter identifisert for prøvetaking langs denne batymetrisk transektet, inkludert: (1) tre individuelle ~ 1 m diameter korallhoder M. annularis, som alle var på 5 m vanndyp (WD); og (2) tre individuelle ~ 1 m diameter korallhoder M. faveolata, som alle var på 12 m WD. Photosynthetically aktiv stråling (PAR) ble målt som 33-36% PAR ved 5 m WD og 18-22% PAR på 10 m WD. Prøvetakingen ble utført i januar når SST var 26 ° C ved vanndybder på både 5 m og 12 m. Hver av disse seks koraller hoder ble samplet i tre eksemplarer på tilsvarende romlige posisjoner (ie., Ca 45 ° N breddegrad på hver av de seks halvkuleformet koraller hoder). Hver enkelt prøve besto av en 2,5 cm diameter korall vev-skjelett kjerne biopsi som ble samlet inn med en renset bue punch. Tre koraller vev-skjelett biopsier ble samplet på standard SCUBA med hansker fra hver av de korallhoder (9 fra M. annularis kolonier ved 5 m WD og 9 fra M. faveolata på 12 m WD). Umiddelbart etter innsamling på dybde, ble hver biopsi kjerneprøve plasseres i et sterilt 50 ml sentrifugerør av polypropylen, skrue-toppen forsegles, og returneres til overflaten. Sjøvannet ble dekantert fra hvert sentrifugerør og hver kjernebiopsi ble deretter nedsenket, lagres og transporteres i 4% paraformaldehyd.
23-30. De fleste av disse studiene benyttet optisk / lysmikroskopi med enten fluorescens eller lyse feltteknikker. Men studier har blitt utført ved ultra-høy forstørrelse ved hjelp av scanning elektronserie blokk ansiktet bildebehandling i det siste 31. I denne studien har en modifisert SBFI protokoll utviklet for og brukes på koraller for første gang. Fordi M. annularis og M. faveolata korall polypper er 1-2 mm i tykkelse, ville ingen av de rutinemessige lysmikroskopi teknikker være i stand til å trenge inn i hele tykkelsen av koraller polypp vev. Derfor har vi SBFI prøveopparbeidelse protokollen spesielt utviklet for korallprøver. I tillegg har vi tilpasset designet en stereo holder, Som er motorisert for å bevege seg i både x og y-retningene. Denne anordning tar bilder av blokken flate av prøven i stedet for å samle delene ved hjelp av en vanlig mikrotomen i front av mikroskop. Vi har også innført en annen ikke-lineære optiske to-foton mikroskopisk teknikk for å bli det same koraller polypper over hele tykkelsen av koraller vev. Dette overvinner de begrensninger som følger av SBFI i form av decalcification og muligheten for endringer i vev morfologi og volum (krympende) som kan induseres av behandlingsprotokoller prøveopparbeidelse (dehydrering) og. Videre ble utslipps profiler fra korallene spektralt vedtatt å identifisere sine peak utslipp og variasjoner mellom chromatophores og fotosyntese zooxanthellae. Disse resultatene ble vurdert i sammenheng med den metode som brukes, og deres individuelle fordeler med hensyn til anskaffelses tid, analyse tid, og evnen til å løse gode strukturelle detaljer uten at structural integritet av koraller vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Reagenser for å være forberedt for Serial Block Face Imaging av Coral Samples
1. Preinfiltration Wax
- Smelt 3,6 g stearin flak i et begerglass. Bland godt på en varm plate (60-70 ° C).
- Tilsett 400 mg av Sudan IV (for å minimalisere voks bakgrunnsfluorescens). Bland godt og vente til en rød gjennomskinnelig løsning er oppnådd.
- Legg 96 ml varmt smeltet parafin (100%) og bland godt.
1.2) Inkludering Wax
- Smelt 7,2 g stearin flak i et begerglass og bland godt på en varm plate (60-70 ° C).
- Legg 0,8 g Sudan IV. Bland godt og vente til en rød gjennomskinnelig løsning er oppnådd.
- Legg parafin granulater (162 g) og bland til parafin smelter helt.
- Tilsett 30 g av et hvitt granulært Vybar og smelte fullstendig i samme begerglass; gang smeltet, bland.
- Løst lukke glassflaske med lokk. Plasser glassflasken i en 60 ° C varmluftsovn oven for å holde ingrediensene i en flytende tilstand. Utføre alle infiltrasjoner i denne ovnen.
- Split det totale volum av 200 ml røde voks i to glassflasker på 100 ml hver. Bruk en porsjon for infiltrasjon og den andre for endelig innebygging.
1.3) Inkludering Coral Vev for Serial Block Face Imaging
- Vask korall polypper som samles i feltet (SI Video 1) og lagret (3-6 måneder ved 4-5 ° C i paraformaldehyd) i fosfatbufret saltløsning (3 x 5 min), og avkalk da klar til å bli avbildet. Avkalke polypper i Excal løsning for 24 timer eller til som polypper er helt blottet for CaCO 3. Inkuber flere decalcified korall polypper som en enkelt blokk i et 25, 50, 75 og 100% etanol serien, fulgt av 1x xylen erstatning å dehydratisere prøvene.
- Plasser de behandlede polypper i et forvarmet 65 ° C ovn inneholdende 100% xylen erstatning. Inkuber i 30 min to ganger ved Changing til frisk løsning. Orienter polypper på en slik måte at toppen av polypper vender nedover og toppflaten er så flat som mulig.
- Lag oppløsninger av 2: 1, 1: 1 og 1: 2, og xylen erstatning preinfiltration voks (trinn 1.1) i 50 ml Falcon-rør.
- Inkuber korall polypper med disse tre økende konsentrasjoner av preinfiltration voks, etterfulgt av inkubasjon i 3 x 100% preinfiltration voks i 30-60 min hver gang.
- Merk: Avhengig av tykkelsen av prøvene, trinn 1.3.1-1.3.5 kunne økes med lengre perioder av gangen.
- Flytt prøvene til embedding voks (se trinn 1.2.6) etter 3x inkubasjon i 100% preinfiltration voks.
- Fjern embedding voks etter 30 min. Sett med frisk innstøping voks og inkubasjon fortsatt i minst 4 timer ved 65 ° C.
1.4) Inkludering i Red Wax
- Fotografi blokken (den rustfrie stålbrett hvor innholdet av hvit voks er plassert, og på toppen av hvilken det sample er plassert). Dette er nødvendig fordi når innleiret i voks, vil plasseringen av prøven bli usynlig som innebygging røde voks er ugjennomsiktig.
- Plasser små dråper med høyt smeltepunkt voks rundt den nye forvarmet rustfritt stål embedding mugg og la den avkjøles. Hell et lite volum av fersk smeltet embedding voks fra andre beholder som nevnt i punkt 1.2.6.
- Plasser koraller polypp vendt ned raskt over den hvite voks dot, deretter plassere en plast utvalget holder på brett i rustfritt stål og hell mer embedding voks slik at voksen kommer opp til overflaten av plast mold.
- Ta hele oppsettet av 65 ° C ovnen og la den avkjøles på en benk eller en kald overflate til voksen helt stivner.
- Dette kan ta 6 timer opp til dag eller to. Plasser blokken tørkes i et kjøleskap ved 4 ° C, beskyttet fra lys, for langtidslagring.
1.5) Seksjonering på Serial Block Face Setup
- Trim blokken og kutte en mikrometer seksjoner ved hjelp av en mikrotom. Ikke samle de delene som de vil bli som pulver. Husk, vi er tenkelig bare blokken ansiktet. Prøven vises når hvit voks begynner å forsvinne.
- Ta bilder av den glatte blokkside som inneholder prøven hver gang en seksjon er fjernet. Fortsett til koraller polypp forsvinner som i SI Video 2.
- Record / fange bilder med et monokromt kamera med et FITC fluorescerende filter for å plukke opp auto-fluorescens av chromatophores / coral polypp. Bilde 3-4 decalcified kjerner fra hver art.
2. Imaging Koraller under to-foton Fluorescensmikroskopi
- Fix koraller polypp kjerner, som hver inneholder rundt 10-12 polypper om en tomme i diameter, i 4% paraformaldehyde på stedet av samlingen (kysten) så snart de er høstet under vann.
- Hold prøvene ved 4 ° C til bildebehandling. Vaskede kjerner er plassert i the samme løsningen opp ned i en omslagsglassbunn fatet (0,17 mm tykk).
- Ved hjelp av en to foton laser på 780 nm eksitasjon, bilde 3-4 polypper ved to forskjellige forstørrelser (digital zoom) med en 10X (0,3 NA) objektiv. Koraller polypp form og høyde varierer mellom prøvene (vanligvis 1-2 mm) og bildedybde er også begrenset av bilde objektiv arbeidsavstand.
- Bruk flis skannemodus for å samle inn ca 25-100 (5 x 5 eller 10 x 10 fliser) bilder per fokusplanet i xy og 50-100 bilder gjennom z-aksen på 10 eller 20 mikrometer intervall, totalt rundt 5000-10000 images / koraller polypp.
- Bilde 03:57 polypp områder å representere en kjerne og korallrev. MERK: Bilde oppkjøpet Tiden varierer mellom 2-5 timer / polypp området.
- Lagre alle bilder i RAW dataformat i systemets harddisk som LSM 5. Render 3D i en 3D-bildeanalyse og rendering programvare.
3. 3D volumgjengivelse og Visualization av SBFI og to-foton Spectral fluorescens data
- Beskjære 2D data for å redusere filstørrelsen ved å fokusere på en enkelt polypp den firkantede beskjæringsverktøyet i programmet og kompilere som en enkelt TIFF-fil (redusere filstørrelsen også ved å lagre filen i 8 bit format) i oppkjøpet programvare.
- Åpne den sammensatte filer av SBFI data (samlet i trinn 1.5.1) eller flislagt flere z-stabler av to foton optiske seksjoner (i trinna 2.1.4) i programmet Imaris overgå modulen under volum algoritme.
- Projisere SBFI data gjengitt i 3D ved hjelp av en skygge projeksjon. Lag en isosurface modus hvor voxel er terskelverdier for å skape et solid overflatemønster (SI Video 3).
- Visualisere 3D-projeksjoner med en klippeplan algoritme på xy, XZ, og YZ ortogonale moduser å avsløre 3D-struktur og form av koraller.
- Animere anslagene bruke en nøkkel frame animasjon modul i samme Imaris program (SI Videos 3-7).
- Generere videofiler ved 5% komprimering og generere et filmklipp i AVI-format ved hjelp av volum (SI Videoer 4 og 6), 3D og Isosurface modaliteter (SI Videoer 5 og 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En tilpasset utformet SBFI apparat (fremstilt spesielt for den foreliggende studie, figur 3) produserte den første detaljerte 3D digitale terrengkart (dems) av den ytre overflatestruktur og morfologi av M. annularis og M. faveolature korall polypper (figur 4 og SI Videoer 1-2). Dette ga bilder av tidligere ubeskrevne stablede fliker av korall vev konsentrisk stråler utover fra midten av hver polypp (figur 4B, 4D og 4E). Disse lappene er stablet langs den øverste mønet av vev-dekket primære og sekundære skjelett septa, med den radielt ytterste og nederste høyde lobes slutt syntetisere og sammenslåing med coenosarc vev mellom polypper. 3D polypp form og tilhørende lapper var godt bevart til tross for korall vevsprøve å ha gått gjennom flere trinn av høy temperatur infiltrasjon og innebygging. Tilsetnn av fargestoff Sudan hell maskert bakgrunnen som ugjennomsiktige, med svart farge som har bidratt til å øke kontrasten i hver prøve og øke signal-til-støy-forhold. 3D og ortogonale projeksjoner plane viste fordelingen av fluorescerende komponenter langs z-aksen (figur 4B). Det var fly med voks flak som noen ganger skjult polypp overflatedetaljer, som ble fjernet for klarhet når du lager prognoser. Den store fordelen med denne teknikken er i å avsløre interne opplysninger om eventuelle tykk prøven, og dermed eliminere behovet for å ta flere deler og justere dem på et senere tidspunkt. Videre, er bildene i denne teknikk som allerede er på linje når oppsamlet (figur 4A), noe som gir az oppløsning på opp til 1 mikrometer fra en prøvestørrelse på opptil 10 mm eller mer (avhengig av den totale driv avstand av blokken holder i mikrotomen ). Det er mulig å diskriminere ulike auto-fluorescerende komponenter (med flere filtre) samt individuellezooxanthellae ved høyere forstørrelse, forutsatt redusert synsfelt er akseptabelt.
Den ApoTome optisk seksjonering fluorescens mikroskop avslørte fordelingen av koraller vev celler (zooxanthellae og chromatophores) og overflaten vev struktur på en Submillimeter oppløsning. Derfor, kunne 6-13 mikrometer diameter zooxanthellae lett gjenkjennes og kvantifisert med hensyn til antall celler pr volum vev (figur 5). Den dual channel image oppkjøpet ved hjelp av klorofyll fluorescens (grønn) og slim merket med WGB Alexa 647 (vist i rødt), fungerte best å kvantifisere graden av slim og antall zooxanthellae innenfor en gitt plassering av polypp (store og små septa av polypp kan beregnes uavhengig).
I tillegg til disse mikroskop tilnærminger, har vi også anvendt TPLSM, en ikke-lineær teknikk mye brukt for tykke biologiske prøver. De store fordelene med TPLSM over påe-foton kontinuerlig bølge lasere er at: (1) eksitasjon forekommer bare på det punktet av fokus fordi kraften i eksitasjon lysintensiteten blir squared og sjansen for et molekyl til å absorbere to påfølgende fotoner å opphisse ett elektron fra fluoroforen er begrenset til dybdeskarphet av målet, og dermed gi en iboende confocality. og (2) som en konsekvens vil det være noe tap av en eksitasjon foton mens trenge dypere inn i prøven, i motsetning til enkeltfoton lasere. I tillegg har de fleste biologiske vevsprøver også absorbere synlig lys. Siden de to-foton eksitasjon er iboende lang (i nær infrarødt ved 780 nm), er absorpsjonen også i det vesentlige minimert. På den annen side, koraller skjelett sammensatt av kalsiumkarbonat knapt absorberer eller sprer den to-foton lys. Til slutt, siden vi var interessert i å bestemme fordelingen av objekter bare på den profilerte overflaten av korall skjelett, fant vi dypere avbildning ved hjelp av denne modalitet very egnet for koraller imaging.
Vi har forsøkt å karakterisere de tilgjengelige spektrale signaturer i M. annularis (figurene 6-9). Her viser vi at under 780 nm to-foton-eksitasjon, har chromatophore auto-fluorescens en topp rundt 500 nm, mens klorofyll fluorescens fra zooxanthellae er sentrert ved omtrent 675 nm (figur 6). Mens unmixing av denne spektrale data (tall 6-7) er også mulig med en unmixing algoritmen i programvaren (Figur 8), siden det er en klar spektral avstanden mellom de to komponentene, bildebehandling dem samtidig ved hjelp av to detektorer på to utslipps band påviste å være mest tidsbesparende teknikk. Dette gjelder spesielt når prøven er side ved side og avbildes over en hel 1-2 mm dybde av vev. Dette eliminerer behovet for fysisk seksjonering, som krever flere tusen bilder per plassering og prøve og polypp. Fordelingen o t auto-fluorescerende chromatophores er også tydelig (figur 9) mellom de to korall arter som ble testet. I ett tilfelle observerte vi en betydelig økning av chromatophores i grunnere vann bolig korall M. annularis forhold til dypere vann M. faveolata (figur 9 og SI filmer 3 og 4).
Figur 1. (A) Kart over Curaçao i den sørlige karibiske hav, som viser plasseringen av studiested på Playa Kalki på langt nordvestlige le kysten av øya. (B) Skjematisk tverrsnitt av rev-rimmed hylle på Playa Kalki på Curaçao, som viser vanndybden distribusjoner av M. annularis og M. faveolata. iles / Ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. (A) I situ undervanns felt fotografi ved 12 m WD av M. faveolata på Playa Kalki, Curaçao. (B) Nærbilde forstørrelse av bildet i (A) som viser de enkelte koraller polypper av M. faveolata i dagtid lysforhold (hver polypp er ca 2 mm i diameter, hvorav noen er trukket tilbake, merket med *). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
5in "src =" / filer / Ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Serie blokk-ansikt bildebehandling instrumentering. (A og B) Det tilpassede laget mikroskop holderen, holder Stereolumar mikroskop ved 180 ° vendt mot blokken flate av prøven plasseres i mikrotomen. Når hver del ble fjernet, ble blokken ansiktet bilde tatt med objektiv og 2D data ble digitalt lagret. Dette ble gjort inntil prøven forsvant i blokken. Mikroskopet blir beveget i x-og y-retningen ved hjelp av en motordrevet ledeskrue, og z, er justeringen gjøres for å konsentrere prøven. Det er viktig å merke seg at når hver 1 mikrometer prøven er seksjonert, blokken beveger seg 1 mikrometer fremover, slik refokusere av omfang er ikke nødvendig. XYMOT, bygget Custom xy translasjonell motorisert scenen; FLS, Fluorescence lyskilde; MT, Mikrotomen; MIC, stereomikroskop; CAM, Axiocam monokrom kamera; BH, Block holder; BF, Block ansiktprøven; FLL, fluoriserende lys eksitasjon flekk på blokken ansiktet; OBJ, mikroskop mål; HIP, grensesnitt panel Menneskelig. Ett bilde dimensjonen av 1388 horisontale x 1040 vertikale piksler i svart-hvitt modus ble samlet inn på en xy pixel (single) oppløsning på 1,25 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Serie blokk ansiktet avbildning av koraller M. annularis og M. faveolata samlet inn fra Playa Kalki, Curaçao. (A) Eksempel datasett galleri som viser rundt 800 bilder av individuelle 2D-bilder hentet fra en polypp på en mikrometer oppløsning i z. (B) I en annen korall prøve, gikk snitte godt over 2,000 mikrometer i z. Bildet viser flere polypper og sammenstilling av alle 2D-skiver på et 3D-volum skygge projeksjon bruker Imaris volum visualisering algoritme. (C) ortogonale projeksjon som viser et xz visning av prøven i (B), kan man se at hele dybden av prøven i løpet av 2 mm, og pilene indikerer de sorte linjer der 2D skivene ble fjernet på grunn av dårlig kvalitet; Dette bildet er fra M. annularis. 3D-volum (D), Isosurface rende (E) og visualiseringen av SBFI data. (D) Flere koraller polypper viser polypp morfologi i lengdesnitt på siden og 3D-volumet (skygge projeksjon) av en enkelt polypp i midten. Seksjonering og visualisering i alle vinkler er mulig i 3D (se SI video). E. Siden voxel er uklar i 3D (D), viser 3D Isosurface gjengis overflaten konturen av koraller polypp overflaten og deres kontekstuelleordning med tilstøtende polypper (se SI video). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. fluorescensmikropskopi av koraller polypper. (A) Tverrsnitt av en decalcified polypp av M. faveolata stiller zooxanthellae med klorofyll autofluorescence henhold blått lys (vist i grønt) og slimhinne lommer merket med hvetekim agglutinin (vist i rødt) som avbildes i henhold til rødt lys. Bildet blir automatisk flislagt i to kanaler og sydd og justert ved hjelp av instrumentets programvare. (B) Utvidelse av boksen vist i (A), som viser individuelle zooxanthellae (hver grønne sirkler, approxilag 6-8 mikrometer i diameter i grønt) og overflaten slimlaget (rød), og sammenslåingen av begge kanaler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. To-foton spektral karakterisering av fluorescens fra koraller. Bruke den spektrale detektor av LSM-systemet 710, ble fluorescens-signaler fra hele det synlige spektrum (419-722 nm) skannes over en dybde på omkring 190 mikrometer. Bildet viser dybdeintervall på 5 mikrometer i x-aksen for z-stakken, og y-aksen er bølgelengde 419-722 nm ervervet ved 10 nm intervallet (totalt rundt 1,154 bilder viste). Man kan se de to spektrale komponenter, en sentrert ved 500 nm og den andre ved 650 nm. En to-foton laser excitering bølgelengde på 780 nm ble brukt for å få utslippsprofiler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7. Karakterisering av de to spektrale komponenter. (A) Den spektrale profilen bakgrunn (blått), autofluorescens fra chromatophores (grønn) og klorofyll fluorescens (rød) eksitert av de to foton laser eksitasjonsbølgelengde på 780 nm laser. Den spektra utledet vist på høyre side av flerfarget spektraldata overlagt og pseudo-farget i henhold til utslipp profil. (B) De enkelte spektrale hyllene hvor signalene blir innsamlet ved 10 nm intervall for å utlede spektra og bildet i (A). Note at de to forskjellige komponenter, ett sentrert på ca 500 nm (chromatophore autofluorescence) og den andre over 675 nm (klorofyll fluorescens). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8. De samme bildene i 7A og 7B, spektrale data ublandet bruk programvaren, og deres tilsvarende utslipps topper / spektra. Både M. annularis og M. faveolata, de spektrale komponentene er svært like, samt deres emisjonstoppene. Den vesentlige forskjell er imidlertid på grunn av plasseringen av disse spektrale komponenter og deres overflod (se figur 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9. To-foton fluorescens 3D bilder av koraller polypper fra M. annularis (AD) og M. faveolata (EH). (A og E) ble fotografert med ingen spektral separering av komponenter ved bruk av 780 nm eksitasjon av de to-foton-laser, med det optiske signalet oppsamlet 450-700 nm. (B og C) ble oppsamlet med den samme eksitering (780 nm), men to PMT detektorer ble benyttet samtidig for å samle inn data fra to komponenter ie., En 500-550 nm (grønn-chromatophore autofluorescens) og den andre 650 720 nm (rød-Klorofyll fluorescens). (C, G) er dybdebilder av kodet(B og F), er rød grun og blått er dypeste komponenter i 2D. (D og H) er YZ bilder av snitt gjennom (B og F) henholdsvis, som viser fluorescens kommer bare fra overflaten av koraller og skjelettet ikke har noen fluorescens ved 780 nm eksitering. Legg merke til den betydelige forskjellen i chromatophore innhold mellom de to koraller. The M. annularis habitat (0-10 m WD) er grunnere enn M. faveolata habitat (10-20 m WD). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10. tierpotenser hierarkisk romlige strukturen av studiene of korallrev økosystemer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
SI Figur 1. Skjermbilder som viser trinn (AI) som er involvert i etableringen av 3D volum og isosurface gjengivelse fra enten SBFI data eller 2Photon mikroskopi ved hjelp av bildeanalyse programvare (se Materialer tabell). (A) 2D skiver av rå data i bit-modus som viser et enkelt plan; (B) 3D volumet av alle 2D skiver; (C) isosurface veiviseren med en region av interesse (ROI) valgt; (D) en algoritme med bakgrunn subtraksjon valgt; (E) en terskelverdi brukes til å plukke opp de piksler som representant dataene; (F) midtsettepunkter på overflaten; (G) en volumbasert filter er anvendt for å eliminere mindre volum av rusk og støy; (H) den endelige 3D gjengitt isosurface; (I) nøkkelbilde animasjon veiviseren for å lage filmer som i SI videoer. De endelige gjengitte bilder er vist i både volum og isosurface modaliteter i SI Videoer 3-7. Protokollen trinn 3.1.3-3.1.5 dekker disse prosedyrene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Materiell / utstyr | Selskapet | Katalog / Modellnummer | Kommentarer / beskrivelse |
| Coral Tissue Skeleton | None | None | 2,5 cm Biopsy fra naturlige habitat |
| Arch Punch Coring Device | CS Osborne and Company | Nei 149 | For Coral biopsi samling |
| Paraformaldehyde | Elektronmikroskopi Sciences | RT 15700 | 16% pre-fortynnet |
| Histoclear / Safeclear II | Elektronmikroskopi Sciences | RT 64111-04 | Giftfri alternativ til Xylen, Dehydrering og Deparafinization |
| Xylen og etanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydrering |
| Parafinvoks | Richard Allen Scientific | Type H NR 8338 | Infiltrasjon løsning |
| Vybar | The Candle Maker | None | Komponent av Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | None | Komponent av Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque bakgrunn |
| Wheat Germ agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For merking Coral mucus |
| Forleng Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade montering media |
| Fluor Dish | Verdens Precision Instruments | FD-35-100 | For to-foton bildebehandling |
| XY Motor, Driver og Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY translasjonell bevegelse |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Smelter all voks |
| Konveksjonsovner | Yamato | DX-600 | Infiltrasjon og Inkludering |
| Tissue prosessor | Leica | ASP 300 | |
| Mikrotomen | Leica | RM2055 | Engangs kniver |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Mål |
| Fluorescens mikroskop med ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging tynne delen av en polypp: Zooxanthellae |
| Axiocam kamera | Carl Zeiss | MRM | Monokrom kamera 1388x1040 piksler |
| Axiovision Programvare | Carl Zeiss | Versjon 4.8 | Bilde anskaffelsesprogram |
| To-foton laser | Spectraphysics | Maitai EHP, pulset laser (70 fs) | Med DeepSee modul |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 med Spectral Detector | 34kanal PMT deteksjon |
| Zen programvare | Carl Zeiss | 2010 eller høyere | for to-foton og spektral bilde oppkjøpet |
| Imaris Suite programvare | Bitplane, Inc., | Versjon 7.0 eller nyere | 3D-volum, Iso-overflaten Rendering, Visualisering |
Tabell 1. Nøkkel materialer, utstyr, mikroskoper, og programvaren som brukes i denne studien.
SI Video 1. In situ undervanns felt video som viser koraller habitat på 12 m WD av M. faveolata på Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. Individuell 2D serie blokk ansikt bilder av 3D-gjengitte bildet vist i Figur 4E.
SI Video 3. Isosurface 3D gjengitt serie blokk ansiktet bildet som presenteres i figur 4E og SI video 1 viser topografien av koraller polypp.
SI Video 4. 3D volum gjengitt rådata to-foton mikroskopi bilde av koraller polypp M. faveolata. Eksitasjon er 780 nm og utslipp fanget samtidig på to båndbredder for zooxanthellae (pseudo-farget rød, 600-700 nm) og chromatophores (pseudo-farget grønn, 500-550 nm).
SI Video 5. 3D volum gjengitt i Isosurface-spots to-foton mikroskopi bilde av koraller polypp M.faveolata. Eksitasjon er 780 nm og utslipp fanget samtidig på to båndbredder for zooxanthellae (pseudo-farget rød, 600-700 nm) og chromatophores (pseudo-farget grønn, 500-550 nm).
SI Video 6. 3D volum gjengitt rådata to-foton mikroskopi bilde av koraller polypp M. annularis. Eksitasjon er 780 nm og utslipp fanget samtidig på to båndbredder for zooxanthellae (pseudo-farget rød, 600-700 nm) og chromatophores (pseudo-farget grønn, 500-550 nm).
SI Video 7. 3D volum ytet Isosurface-spots to-foton mikroskopi bilde av koraller polypp M. annularis. Den er 780 nm eksitasjon og emisjon fanges samtidig på to båndbredder for zooxanthellae (psEudo-farget rød, 600-700 nm) og chromatophores (pseudo-farget grønn, 500-550 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Korallrev forskning er en svært tverrfaglig forskningsinnsats, som involverer analyse av samtidige fysiske, kjemiske og biologiske fenomener som opererer i det marine miljø. Studiet av komplekse korallrev økosystemer er derfor best ferdig i løpet av noen 'Powers of Ten' kontekstuelle rammeverk (Figur 10). Denne grafisk sammenstilling illustrerer at korall økosystem dekker et bredt spekter av romlige dimensjoner (10 -9-10 5 m). Videre illustrerer denne øvelsen at geobiological analyser på en middels lengde-skala fra 1 mm-1 cm er broen som trengs for å kombinere felt og laboratorieanalyser. Dette Powers of Ten rammeverket er konteksten for eksperimentene, analyser, modellering og syntese av det fysiske, kjemiske og biologiske parametere som styrer Curaçao korallrev økosystemer.
Denne studien er den første til å bruke fullt integrert suite of FM, SBFI og CLSM teknikker for å spore responsen fra tilsynelatende friske koraller til økende vanndybde. Lysmikroskopi verktøy tilgjengelig for bilde hele vev eller tykke biologiske prøver har vært begrenset på grunn av en rekke optiske begrensninger som utgjøres av prøvene selv, som inkluderer absorpsjon, spredning, og andre fenomener. Innen kun det siste tiåret, ble SBFI scanning elektronmikroskopi brukes på superhøye oppløsninger 31 samt lys mikroskopisk avbildning ved hjelp wide-feltet basert SBFI avbildning av flere biologiske prøver. Dette har inkludert analyser av alt fra hjernen til hele hjertevevet og til og med prøver som inneholder ben som ble malt og polert, merket, og avbildes på samme tid etter at hver del ble gjort 23-29. Nylig ble fluorescens og Konfokalmikroskopi brukes til å avsløre konturene, form og fordeling av proteiner og pigmenter i biologiske prøver 32-33. Imidlertid 3D-strukturen av individuelle korall polypper hektard ikke tidligere blitt løst. Forutsetningen for SBFI med korallprøver er avkalking, som kalsiumkarbonat må fjernes før rende prøvene mottagelig for infiltrasjon og seksjonering ved hjelp av en vanlig mikrotom.
Det er her to-foton fluorescensmikroskopi blir uunnværlig for analyse av biologiske vev på grunn av sine unike to-foton-eksitasjon fenomener. Dette førte til utvidet dybdepenetrering 33-34 av koraller vev i denne studien, der avkalking trinnet ble effektivt eliminert på grunn av ikke-lineær to-foton eksitasjon fenomener 34. I tillegg precompensation modulen med to-foton laser tilgjengelig mye kortere pulsbredde, som i tillegg forbedret inntrengningsdybde. På prøven side, siden kalsiumkarbonat absorberer ikke nær infrarødt lys ved 780 nm, er dybdepenetrering begrenses typisk av arbeidsavstanden til målet. Enda en annen ulempe of avkalking og fjerning av korall skjelettet er tap av strukturell integritet av koraller vev, noe som gjør vevet volumanslag enda vanskeligere etter at prøven har gjennomgått flere dehydrering og rehydrering trinn og innstøping i vann-fri voks. Dette understreker viktigheten av å bestemme korall vev volumer både før og etter behandling.
Confocal karakterisering av fluorescerende proteiner av koraller er gjennomført for Great Barrier Reef koraller og de beskyttende spektrale egenskaper er korrelert med dybden av koraller habitat 32. Imidlertid, i den foreliggende studie demonstrerer vi for første gang ved hjelp av to-fotonmikroskopi at det er en betydelig reduksjon av chromatophores overalt på dypt vann korall unntatt i munnen vev. I tillegg har de forskjellige endringer i fordelingen av zooxanthellae med hensyn til chromatophores blitt observert over dybde snitt i M. annularis, der hvore de gruntvannskorall vev er helt dekket med chromatophores. Med oppløsningen gitt ved høy forstørrelse avbildning (figurene 8C og 8D), kan vi nå nøyaktig kvantifisere areal og volum som opptas av zooxanthellae, og deres vev tetthetsforhold kan bestemmes med hensyn til andre cellulære komponenter. Til sammen har integreringen av SBFI og to-foton fluorescens spektral avbildning i denne studien ga livsviktige ny innsikt i morfologi og struktur av koraller vev. Denne informasjonen vil bidra til å kvantifisere de enkelte komponentene av koraller vev, enten på individ polypp nivå eller på det kontekstuelle nivået av samspillet mellom koloni polypper på en hel coral hodet. Denne sammenheng vil nå tillate det adaptive av koraller holobiont til endringer i havnivået vanndyp og irradians å bli kvantitative spores og spådd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
