Summary
Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op poliep morfologie en weefselstructuur in het Caribisch gebied koralen Montastraea annularis en M. te bepalen faveolata. Fluorescentie, serieblok gezicht, en twee-foton confocale laser scanning microscopie hebben lobbige structuur, poliep muren, en de geschatte chromatophore en zoöxanthellen dichtheid en uitkeringen geïdentificeerd.
Abstract
Een geïntegreerde suite van beeldvormende technieken is toegepast op de driedimensionale (3D) morfologie en celstructuur van poliep weefsel omvattende het Caribische rif vormende koralen Montastraea annularis en M. bepalen faveolata. Deze benaderingen omvatten fluorescentiemicroscopie (FM), serieblok gezicht imaging (SBFI), en twee-foton confocale laser scanning microscopie (TPLSM). SBFI biedt deep tissue imaging na lichamelijke snijden; worden de details van het oppervlak weefsel textuur en 3D-visualisatie om weefsel diepten van meer dan 2 mm. Complementaire FM en TPLSM opbrengst ultra-hoge resolutie beelden van het weefsel cellulaire structuur. Resultaten zijn: (1) geïdentificeerd eerder gemeld lobbige weefsel morfologie op de buitenwand van de individuele koraalpoliepen en (2) creëerde het eerste oppervlak kaarten van de 3D distributie en weefsel dichtheid van chromatoforen en algen-achtige dinoflagellaten zooxanthellae endosymbionts. Spectrale absorptie erwtks van 500 nm en 675 nm, respectievelijk, suggereren dat M. annularis en M. faveolata bevatten gelijkaardige soorten chlorofyl en chromatophores. Echter, M. annularis en M. faveolata vertonen grote verschillen in dichtheid en 3D weefsel verdeling van deze belangrijke cellulaire componenten. Deze studie gericht op beeldvorming methoden geeft aan dat SBFI is uiterst nuttig voor de analyse van grote mm-schaal monsters van ontkalkt koraal weefsels. Gratis FM en TPLSM onthullen subtiele submillimeter schaal veranderingen in de cellulaire distributie en dichtheid in nondecalcified koraal weefselmonsters. De TPLSM techniek verschaft: (1) minimaal invasieve monstervoorbereiding, (2) superieure optische sectie vermogen, en (3) minimaal licht absorptie en verstrooiing, terwijl het toelaat deep tissue imaging.
Introduction
Opwarming van de aarde en de bijbehorende veranderingen in het milieu zijn directe gevolgen voor de gezondheid en de verspreiding van tropische mariene koralen 1-4. Meerdere effecten worden waargenomen, waaronder verbleking van koraal en de opkomst van infectieziekten 5-6. Echter, meer nauwkeurige voorspelling van de toekomstige koraal antwoord op deze bedreigingen voor het milieu vereisen dat een histologische "basislijn" worden opgericht, waardoor weefsel morfologie en cel samenstelling en distributie definieert voor "ogenschijnlijk gezonde" koralen. Op zijn beurt, "impact" koralen dan kwantitatief worden vergeleken. Voorts dient deze basislijn worden vastgesteld voor ogenschijnlijk gezonde koralen onder een scala van milieuomstandigheden, zodat "gezonde reactie" kan ook worden gemeten over milieu-gradiënten. Als een eerste stap in de richting van het opstellen van deze basislijn, heeft een hoge resolutie 3D-studie is uitgevoerd van hoe ogenschijnlijk gezonde koraalpoliep weefselmorfologie en cellulaire samenstelling reageert op toename van de waterdiepte (WD) en de bijbehorende afname van zonlicht instraling. De resultaten kunnen dan gebruikt worden om een uitgebreidere mechanistisch begrip van koraal aanpassing te bepalen en om inzicht in koraal-symbiont ontwikkeling en verbetering van light harvesting krijgen.
Steenkoralen (Scleractinia) zijn koloniale mariene ongewervelde dieren die gastheer spelen om een complexe verzameling van andere micro-organismen, gezamenlijk aangeduid als het koraal holobiont 7-10. Het onderzoek dat in de huidige studie tracht een suite van geavanceerde imaging technologieën gebruiken om tegelijkertijd veranderingen met toenemende waterdiepte in het weefsel pigmenten en symbiotische zoöxanthellen van ogenschijnlijk gezonde gastheer koralen volgen. Dit zal de nodige vergelijkende weefselcel "basislijn" op te richten over een bathymetrische gradiënt voor ogenschijnlijk gezonde koralen en fungeren als indicatoren van koraal heaLTH 10. Koraal pigmenten, genaamd chromatoforen, handelen om te absorberen, te reflecteren, scatter, breken, afbuigen of anderszins interfereren met de invallende zonnestraling 11. De zoöxanthellen-chromatophore endosymbiotic relatie is de co-evolutie van strategisch gunstige light-harvesting optimalisatie en groei van het skelet strategieën, evenals trofische plasticiteit (het verschuiven voerstrategieën heen-en-weer van de autotrofe tot heterotrofie) voor het koraal dier 12 ingeschakeld.
De zuidelijke Caribische eiland natie van Curaçao (voorheen onderdeel van de Nederlandse Antillen) ligt op ongeveer 65 km ten noorden van Venezuela in de oost-west trending Aruba-La Blanquilla archipel (figuur 1A). De 70 km lange zuidkust van Curaçao bevat een doorlopende moderne en Mioceen-Plioceen-Pleistoceen-Holoceen oude fringing koraalrif darmkanaal 13,14. Gemiddelde jaarlijkse SST op Curaçao varieert van ongeveer 3 ° C eenlijks, variërend van een minimum van 26 ° C in eind januari tot een maximum van 29 ° C in het begin van september, met een gemiddelde jaartemperatuur van 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST datasets 2000-2010). Het koraalrif bij Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), liggen in de buurt van de noordwestelijke puntje van Curaçao (figuur 1A), werd gekozen voor bemonstering, omdat het eerder goed bestudeerde en het is geweest mariene ecosysteem op deze locatie wordt badend in verse nonpolluted zeewater 7,15-19. . Twee nauwverwante scleractinian koralen, M. annularis en M faveolata, werden in deze studie gekozen voor experimenten en analyses omdat elke species: (1) vertoont duidelijk verschillend en overlappende bathymetrische verdelingen op het rif tract ten opzichte van de plank te maken met het geassocieerd carbonaat sedimentaire afzettingsmilieus (M. annularis range = 0-10 m WD; M. faveolatarange = 10-20 m WD 20; Figuren 1B, 2A en 2B); (2) is een veel voorkomende koraalrif kader bouwer gedurende de Caribische Zee 21; en (3) heeft een goed bestudeerde ecologische, fysiologische, en evolutionaire relaties 22.
Veld bemonstering voor de huidige studie werd uitgevoerd met behulp van standaard duiken technieken kust van Playa Kalki op Curaçao. Een ondiepe-tot-diep water bathymetrische transect werd vastgesteld dat liep over de plank, op de plank breken, en in het diepe water voorgrond rif omgevingen. Ogenschijnlijk gezonde koralen werden vervolgens geïdentificeerd voor de bemonstering langs deze bathymetrische transect, waaronder: (1) drie individuele ~ 1 m diameter koraal hoofden van M. annularis, die allemaal op 5 m waterdiepte (WD); en (2) drie individuele ~ 1 m diameter koraal hoofden van M. faveolata, die allemaal op 12 m van WD. Fotosynthetische actieve straling (PAR) werd gemeten als 33-36% PAR op 5 m WD en 18-22% PAR op 10 m van WD. Bemonstering werd uitgevoerd in januari wanneer de SST was 26 ° C aan de waterdieptes van zowel de 5 m en 12 m. Elk van deze zes koralen werd bemonsterd in drievoud bij equivalente ruimtelijke posities (dwz., Ongeveer 45 ° noorderbreedte op elk van de zes halfronde koralen). Elk individueel monster bestond uit een 2,5 cm diameter koraal weefsel-skelet kern biopsie die werd verzameld met een gereinigd boog punch. Drie koraal weefsel-skelet biopten werden bemonsterd op standaard SCUBA met handschoenen uit elk van de koralen (9 van M. annularis kolonies op 5 m WD en 9 van M. faveolata op 12 m WD). Onmiddellijk na verzameling op diepte, werd elke biopsie kernmonster in een steriele 50 ml polypropyleen centrifugebuis gebracht, schroefdop afgesloten en teruggebracht naar de oppervlakte. Het zeewater werd gedecanteerd van elke centrifugebuis en elk monster werd vervolgens ondergedompeld biopsie, opgeslagen en in 4% paraformaldehyde getransporteerd.
23-30. De meeste van deze studies gebruikt optische / lichtmicroscopie met ofwel fluorescentie of heldere veld technieken. Echter, zijn de studies uitgevoerd in ultra-hoge vergrotingen behulp van scanning electron serieblok gezicht beeldvorming in het verleden 31. In de onderhavige studie werd een gemodificeerd SBFI protocol ontwikkeld voor en toegepast op koralen voor de eerste keer. Omdat M. annularis en M. faveolata koraalpoliepen zijn 1-2 mm in dikte, zou geen van de routine lichtmicroscopie technieken kunnen doordringen van de gehele dikte van koraalpoliep weefsel. Daarom hebben we SBFI monstervoorbereiding protocol speciaal ontworpen voor koraal monsters. Daarnaast hebben we op maat ontworpen een stereomicroscoop houder, Die gemotoriseerd bewegen in zowel x en y richtingen. Deze inrichting neemt beelden van het blok van het monster dan verzamelen de gedeelten met bijvoorbeeld een microtoom voor de microscoop. We introduceerden ook een ander niet-lineaire optische twee-foton microscopische techniek op de foto dezelfde koraalpoliepen over de hele dikte van het koraal weefsel. Dit overwint de door SBFI gesteld wat ontkalking en de mogelijkheid van veranderingen in weefsel morfologie en volume (krimp) die kan worden geïnduceerd door monstervoorbereiding (dehydratie) en verwerkingsprotocollen beperkingen. Bovendien werden de emissie-profielen uit de koralen spectraal opgelost om hun piek uitstoot en variaties tussen de chromatoforen en de fotosynthetische zoöxanthellen identificeren. Deze resultaten werden in het kader van de methode en de individuele voordelen inzake acquisitie tijd, analysetijd en het vermogen om fijne structurele details lossen zonder afbreuk str geëvalueerductural integriteit van het koraal weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Reagentia om voorbereid te zijn Serial Block Gezicht Imaging van Coral Monsters
1 Preinfiltration Wax
- Smelt in een bekerglas 3,6 g stearine flakes. Meng goed op een hete plaat (60-70 ° C).
- Voeg 400 mg van Sudan IV (wax achtergrond fluorescentie te minimaliseren). Meng goed en wacht tot er een rode doorschijnende oplossing wordt bereikt.
- Voeg 96 ml hete gesmolten paraffine (100%) en meng goed.
1.2) Embedding Wax
- Smelt 7,2 g stearine flakes in een bekerglas en meng goed op een hete plaat (60-70 ° C).
- Voeg 0,8 g van Sudan IV. Meng goed en wacht tot er een rode doorschijnende oplossing wordt bereikt.
- Voeg paraffine granules (162 g) en meng tot paraffine smelt volledig.
- Voeg 30 g witte granulaire Vybar en smelt volledig in dezelfde beker; eenmaal gesmolten, meng.
- Losjes sluit de glazen fles met een deksel. Plaats de glazen fles in een 60 ° C convectie oven de ingrediënten in een vloeibare toestand te houden. Voeren alle infiltraties in deze oven.
- Splits het totale volume van de 200 ml rode lak in twee glazen flessen van elk 100 ml. Gebruik een aliquot voor infiltratie en de andere voor de definitieve inbedding.
1.3) Embedding Coral Tissues voor Serial Block Gezicht Imaging
- Was de koraalpoliepen in het veld (SI Video 1) verzameld en opgeslagen (3-6 maanden bij 4-5 ° C in paraformaldehyde) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (3x 5 min) en ontkalken wanneer je klaar bent om te worden afgebeeld. Ontkalken de poliepen in Excal oplossing gedurende 24 uur of totdat de poliepen zijn totaal verstoken van CaCO 3. Incubeer verscheidene ontkalkte koraalpoliepen als een blok in een 25, 50, 75, en 100% ethanol serie, gevolgd door 1x xyleen vervanging voor de monsters dehydrateren.
- Het bewerkte poliepen in een voorverwarmde oven 65 ° C met 100% xyleen vervangen. Incubeer gedurende 30 minuten twee keer per changing tot verse oplossing. Richt de poliepen zodanig dat de bovenkant van de poliepen naar beneden en de bovenzijde zo vlak mogelijk.
- Maak oplossingen van 2: 1, 1: 1 en 1: 2, xyleen vervangen en preinfiltration was (stap 1.1) in 50 ml Falcon buizen.
- Incubeer koraalpoliepen met deze drie toenemende concentraties van preinfiltration was, gevolgd door 3x incubatie in 100% preinfiltration wax voor 30-60 minuten per keer.
- Opmerking: Afhankelijk van de dikte van de monsters, stappen 1.3.1-1.3.5 kan worden verhoogd met een langere periode van tijd.
- Beweeg de monsters naar het inbedden van wax (zie stap 1.2.6) na 3x incubatie in 100% preinfiltration wax.
- Verwijder de inbedding was na 30 min. Vervang met verse inbedding was en verder incuberen gedurende ten minste 4 uur bij 65 ° C.
1.4) Inbedding in Red Wax
- 's Het blok (de roestvrijstalen plaat waar de witte was geplaatst en waar bovenop het sample wordt geplaatst). Dit is noodzakelijk omdat zodra ingebed in de was, zal de locatie van het monster onzichtbaar naarmate de inbedding rode wax is ondoorzichtig.
- Plaats kleine druppels hoog smeltpunt was rond de nieuwe voorverwarmde roestvrijstalen inbedding vorm en laat afkoelen. Giet een kleine hoeveelheid vers gesmolten was inbedden van tweede houder zoals in stap 1.2.6.
- Plaats de koraalpoliep naar beneden snel over de witte was stip, plaats dan een plastic monster houder op de roestvrijstalen plaat en giet meer inbedding wax zodat de was komt aan het oppervlak van de kunststof mal.
- Neem de volledige setup van de 65 ° C oven en laat hem afkoelen op een bankje of een koel oppervlak tot de was volledig verhardt.
- Dit kan 6 uur tot dag of twee duren. Plaats het blok gedroogd in een koelkast bij 4 ° C, beschermd tegen licht, voor langdurige opslag.
1.5) Snijden in de Serial Block Gezicht Setup
- Trim het blok en snijd 1 micrometer secties met behulp van een microtoom. Niet verzamelen de delen als ze als poeder zal worden. Vergeet niet, we zijn het afbeelden alleen het blok gezicht. Het monster wordt als de witte was begint te verdwijnen.
- Maak foto's van de gladde blok gezicht dat het monster telkens een sectie wordt verwijderd bevat. Ga door tot de koraalpoliep verdwijnt in SI Video 2.
- Opnemen / vastleggen van de beelden met een monochrome camera met behulp van een fluorescerende FITC filter te halen de auto-fluorescentie van de chromatoforen / koraalpoliep. Afbeelding 3-4 ontkalkt kernen van elke soort.
2 Imaging Koralen Onder twee-foton fluorescentie microscopie
- Fix koraalpoliep kernen, elk met ongeveer 10-12 poliepen ongeveer een centimeter in diameter, in 4% paraformaldehyde op de plaats van inzameling (kust), zodra ze worden geoogst onder water.
- Houd monsters bij 4 ° C tot beeldvorming. Gewassen kernen zijn in th geplaatste dezelfde oplossing ondersteboven in een afdekglas onderste schaal (0,17 mm dik).
- Met behulp van een twee foton laser bij 780 nm excitatie, afbeelding 3-4 poliepen op twee verschillende vergrotingen (digitale zoom) met behulp van een 10X (0,3 NA) doelstelling. De koraalpoliep vorm en hoogte varieert tussen de monsters (meestal 1-2 mm) en de beeldvorming diepte wordt ook beperkt door werkafstand van de doelstelling van de beeldvorming.
- Gebruik de modus tegel scan ongeveer 25-100 (5 x 5 of 10 x 10 tegels) beelden per focal plane in xy en 50-100 beelden via de z-as te verzamelen op 10 of 20 pm interval, in totaal zo'n 5.000-10.000 images / koraalpoliep.
- Afbeelding 3-4 poliep gebieden om een kern en koraalsoorten te vertegenwoordigen. OPMERKING: Beeldacquisitie varieert tussen 2-5 uur / poliep gebied.
- Bewaar alle beelden in raw data-formaat op de harde schijf van het systeem als LSM 5 Render 3D op een 3D-beeld analyse en rendering software.
3 3D Volume Rendering en Visualization van SBFI en twee-foton Spectral Fluorescentie Gegevens
- Gewas de 2D-gegevens om de bestandsgrootte te verkleinen door zich te richten op een enkele poliep met het plein bijsnijden in het programma en compileren als een tiff-bestand (het verminderen van de bestandsgrootte ook door het bestand in 8 bit-formaat) in de aanschaf van software.
- Open de verzamelde bestanden van de SBFI data (in stap 1.5.1 verzameld) of de betegelde meerdere z-stapels van twee foton optische secties (in stap 2.1.4 verzameld) in het programma Imaris Overtref module onder de volume-algoritme.
- Projecteer de SBFI gegevens weergegeven in 3D met behulp van een schaduw projectie. Maak een isosurface modus waarbij de voxels worden thresholded aan een vast oppervlak patroon (SI Video 3) te creëren.
- Visualiseer de 3D-projecties met behulp van een clipping plane algoritme op xy, xz en yz orthogonale modi om 3D-structuur en de vorm van koralen te onthullen.
- Animeren de projecties met behulp van een key frame animatie module in dezelfde Imaris programma (SI Videos 3-7).
- Genereer videobestanden op 5% compressie en het genereren van een filmclips in avi-formaat met behulp van volume (SI's 4 en 6), 3D en isosurface modaliteiten (SI's 5 en 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een op maat ontworpen SBFI apparaat (speciaal gefabriceerd voor de huidige studie; Figuur 3) produceerde de eerste gedetailleerde 3D digitale hoogte kaarten (DEMs) van het buitenste oppervlak structuur en morfologie van de M. annularis en M. faveolature koraalpoliepen (figuur 4 en SI's 1-2). Dit leverde beelden van eerder beschreven gestapelde lobben van koraal weefsel concentrisch naar buiten straalt vanuit het midden van elke poliep (figuren 4B, 4D en 4E). Deze lobben zijn gestapeld langs de bovenste nok van weefsel bedekt primaire en secundaire skelet septa, met de radiaal buitenste en onderste hoogte lobben uiteindelijk synthetiseren en het samenvoegen met coenosarc weefsels tussen de poliepen. De 3D poliep vorm en de bijbehorende lobben waren goed bewaard ondanks de koraalweefsel monster door verschillende stappen van hoge temperatuur infiltratie en inbedding zijn gegaan. De addition van kleurstof Sudan succes gemaskeerd de achtergrond als ondoorzichtig, met de zwarte kleur hebben bijgedragen tot het contrast van elk monster maximaliseren en de signaal-ruisverhouding. 3D en orthogonale vlak bleek de verdeling van fluorescente componenten langs de z-as (Figuur 4B). Er waren vliegtuigen met wax vlokken die soms verduisterd poliep oppervlak detail, die werden verwijderd voor de duidelijkheid bij het maken van projecties. Het grote voordeel van deze techniek is in het openbaren van interne gegevens van elke dikke monster, waardoor de noodzaak om meerdere secties te nemen en richt ze op een later tijdstip. Verder worden de afbeeldingen in deze techniek reeds uitgelijnd wanneer verzameld (figuur 4A), voorzien az resolutie van 1 urn van een monstergrootte van 10 mm of meer (afhankelijk van de totale aandrijving afstand van het blok houder in het microtoom ). Het is mogelijk om verschillende auto-fluorescerende componenten (met meerdere filters) en individuele onderscheidzooxanthellae bij een grotere vergroting, mits het gereduceerde gezichtsveld aanvaardbaar.
De apotome optische sectie fluorescentie microscoop bleek de verdeling van koraal weefsels cellen (zoöxanthellen en chromatophores) en oppervlakte weefsel structuur op een submillimeter resolutie. Derhalve kan de 6-13 urn diameter zooxanthellae gemakkelijk herkend en gekwantificeerd met betrekking tot het aantal cellen per volume weefsel (Figuur 5). De dual channel beeld acquisitie met de chlorofyl fluorescentie (groen) en de mucus gelabeld met WGB Alexa 647 (getoond in rood), werkte het beste om het niveau van slijm en het aantal zoöxanthellen binnen een bepaalde plaats van de poliep kwantificeren (major en minor septa van de poliep kan afzonderlijk worden berekend).
Naast deze microscoop benaderingen hebben we ook toegepast TPLSM, een lineaire techniek veel gebruikt voor dikke biologische monsters. De grote voordelen van TPLSM dan ope-foton continue lasers zijn dat: (1) excitatie alleen optreedt bij het focuspunt omdat de stroom van het excitatie lichtintensiteit wordt gekwadrateerd en de kans op een molecuul twee opeenvolgende fotonen absorberen een elektron exciteren van de fluorofoor beperkt de scherptediepte van het objectief, waardoor een inherente confocaliteit. en (2) als gevolg daarvan zal er geen verlies van een excitatiefoton terwijl dieper doordringen in het monster, in tegenstelling tot enkel foton lasers. Daarnaast meeste biologische weefselmonsters zichtbaar licht absorberen. Aangezien de twee-foton excitatie inherent lang (in nabije infrarood bij 780 nm), wordt de opname ook aanzienlijk geminimaliseerd. Anderzijds, de koraalskelet uit calciumcarbonaat nauwelijks absorbeert of verstrooit de twee-foton licht. Tot slot, omdat we geïnteresseerd waren in het bepalen van de verdeling van de voorwerpen alleen aan de geprofileerde oppervlak van het koraal skelet, vonden we dieper beeldvorming met behulp van deze modaliteit very geschikt voor koraal beeldvorming.
We hebben geprobeerd om de beschikbare spectrale signaturen karakteriseren M. annularis (figuren 6-9). Hier tonen we onder de 780 nm twee-foton excitatie, de chromatophore auto-fluorescentie een piek rond 500 nm, terwijl de chlorofylfluorescentie van zooxanthellae gecentreerd bij ongeveer 675 nm (figuur 6). Hoewel ontmenging van deze spectrale gegevens (figuren 6-7) is ook mogelijk met een ontmenging algoritme in de software (figuur 8), aangezien er een duidelijke spectrale afstand tussen de twee componenten, beeldvorming kunnen samen met twee detectoren op twee emissiebanden gebleken de meeste tijdwinst techniek. Dit is vooral het geval wanneer het monster is betegeld en afgebeeld over een heel 1-2 mm diepte van het weefsel. Dit elimineert de noodzaak voor fysieke snijden enkele duizenden beelden per locatie monster en poliep vereist. De verdeling o f auto-TL chromatoforen is ook duidelijk (Figuur 9) tussen de twee koraalsoorten getest. In een geval, zagen we een significante toename van chromatoforen in het ondiepere water levende koraal M. annularis vergeleken met dieper water M. faveolata (Figuur 9 en SI Video's 3 en 4).
Figuur 1 (A) Kaart van Curaçao in de zuidelijke Caraïbische Zee, die de plaats van het onderzoek ter plaatse bij Playa Kalki op de uiterst noordwestelijke Benedenwindse kust van het eiland. (B) Schematische doorsnede van het rif-omrande plank bij Playa Kalki op Curaçao, met de waterdiepte distributies van M. annularis en M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2 (A) In situ onderwater veld foto op 12 m WD van M. faveolata bij Playa Kalki, Curaçao. (B) Close-up uitbreiding van de afbeelding in (A) met de individuele koraalpoliepen van M. faveolata overdag lichtomstandigheden (elke poliep is ongeveer 2 mm in diameter, waarvan sommige zijn geschoven, aangegeven met *). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
5in "src =" / files / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3 De serieblok-face beeldvorming instrumentatie. (A en B) De speciaal ontworpen microscoop houder houdt de Stereolumar microscoop bij 180 ° tegenover het blok vlak van de geplaatste in het microtoom monster. Bij elke sectie werd verwijderd, werd het het blok gezicht gevangen met de doelstelling en de 2D-gegevens werd digitaal opgeslagen. Dit werd gedaan totdat het monster verdwenen in het blok. De microscoop is in x-en y-richting met behulp van een gemotoriseerde lood schroef en de z verplaatst, wordt aangepast aan het monster richten. Het is belangrijk op te merken dat wanneer elk 1 urn monster wordt doorgesneden, het blok beweegt 1 urn voren, zodat heroriënteren van het toepassingsgebied niet noodzakelijk. XYMOT, Maatwerk xy translationeel gemotoriseerde podium; FLS, fluorescentie lichtbron; MT, Microtoom; MIC, Stereomicroscoop; CAM, Axiocam monochrome camera; BH, Block houder; BF, Block gezicht vanhet monster; FLL, TL excitatie plek op het blok gezicht; OBJ, Microscoop objectief; HIP, Human interface-paneel. Een afbeelding op de dimensie van 1.388 horizontale x 1.040 pixels verticaal in monochrome modus werd verzameld op een xy pixel (single) resolutie van 1,25 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4 Serial blok gezicht beeldvorming van de koralen M. annularis en M. faveolata verzameld van Playa Kalki, Curaçao. (A) Voorbeeld data set galerie toont ongeveer 800 beelden van individuele 2D-beelden verkregen van een poliep op 1 micrometer resolutie in z. (B) In een ander koraal monster, het snijden ging ruim 2,000 micrometer in z. De afbeelding toont meerdere poliepen en de compilatie van alle 2D-schijfjes in een 3D-volume onder schaduw projectie met behulp van de Imaris volume visualisatie algoritme. (C) orthogonale projectie die een xz aanzicht van het monster (B), kan men de gehele diepte van het monster zien dan 2 mm en de pijlen geven de zwarte lijnen waar 2D schijfjes werden verwijderd door slechte kwaliteit; Dit beeld is van M. annularis. 3D volume (D), isosurface die (E) en visualisatie van de SBFI data. (D) Multiple koraalpoliepen die de poliep morfologie in langsdoorsnede aan de zijkant en het 3D-volume (schaduw projectie) van een enkele poliep in het midden. Snijden en visualisatie onder elke hoek mogelijk is in 3D (zie SI video). E. Aangezien voxels zijn fuzzy in 3D (D), de 3D-gerenderde isosurface oppervlak toont de contour van het koraalpoliep oppervlak en hun contextueleregeling met aangrenzende poliepen (zie SI video). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5 Fluorescentie microscopie van koraalpoliepen. (A) Dwarsdoorsnede van een ontkalkt poliep van M. faveolata exposeren zoöxanthellen met chlorofyl autofluorescence onder blauw licht (in het groen) en mucosale zakken gelabeld met tarwekiemagglutinine (aangegeven in rood) als afgebeeld onder rood licht. De afbeelding wordt automatisch betegeld in twee kanalen en gestikt en uitgelijnd met behulp van het instrument software. (B) De uitbreiding van de doos getoond in (A), waaruit individuele zoöxanthellen (elke groene cirkels, onderlingeveer 6-8 micrometer in doorsnede in het groen) en de oppervlakte slijmlaag (rood), en het samenvoegen van de twee kanalen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6 twee-foton spectrale karakterisering van fluorescentie van koralen. Met de spectrale detector van het LSM 710 systeem, fluorescentiesignalen uit het gehele zichtbare spectrum (419-722 nm) werden gescand op een diepte van ongeveer 190 urn. Het beeld toont de diepte-interval op 5 micrometer x-as voor de z-stack en de y-as is de golflengte 419-722 nm bij 10 nm interval (in totaal rond 1.154 beelden toonden) verworven. Men kan de twee spectrale componenten een gecentreerd bij 500 nm en de tweede bij 650 nm zien. Een twee-foton laser EXCItatie golflengte van 780 nm werd gebruikt om de emissie-profielen te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7 Karakterisering van de twee spectrale componenten. (A) De spectrale profiel van de achtergrond (blauw), autofluorescentie van chromatophores (groen) en chlorofyl fluorescentie (red) opgewekt door de twee foton laser excitatie golflengte van 780 nm laser. De spectra afkomstige getoond aan de rechterzijde van de veelkleurige spectrale data overlay en pseudo-gekleurd volgens de emissie profiel. (B) De individuele spectrale bakken waar de signalen worden verzameld op 10 nm interval de spectra en het beeld van (A) af te leiden. Opmerking dat de twee verschillende componenten, een gecentreerd op ongeveer 500 nm (chromatophore autofluorescentie) en de andere meer dan 675 nm (chlorofyl fluorescentie). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8 Dezelfde afbeeldingen in figuren 7A en 7B, spectrale gegevens onvermengd met de software en de bijbehorende emissiepieken / spectra. Zowel M. annularis en M. faveolata, de spectrale componenten zijn erg vergelijkbaar, evenals hun emissie-pieken. Het grote verschil is echter vanwege de locatie van deze spectrale componenten en hun overvloed (zie figuur 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9 twee-foton fluorescentie 3D-beelden van koraalpoliepen van M. annularis (AD) en M. faveolata (EH). (A en E) werden afgebeeld zonder spectrale scheiding van componenten met 780 nm excitatie van de twee-foton laser, waarbij het optische signaal verzameld 450-700 nm. (B en F) werden verzameld met hetzelfde excitatie (780 nm), maar twee PMT detectoren gelijktijdig gebruikt om de gegevens van twee componenten verzamelen dwz., Een 500-550 nm (groen-chromatophore autofluorescentie) en de andere 650- 720 nm (rood-chlorofyl fluorescentie). (C en G) zijn diepte gecodeerde beelden van(B en F), rood is ondiepste en blauw is diepste componenten in 2D. (D en H) zijn yz beelden doorsnijden (B en F) respectievelijk, met de fluorescentie alleen afkomstig is van het oppervlak van het koraal en het skelet geen fluorescentie bij 780 nm excitatie. Let op het aanzienlijke verschil in chromatophore inhoud tussen de twee koralen. De M. annularis habitat (0-10 m WD) is ondieper dan de M. faveolata habitat (10-20 m WD). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 10 De Powers of Ten hiërarchische ruimtelijke structuur van studies of ecosystemen van het koraalrif. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
SI Figuur 1 Screen shots zien stappen (AI) die betrokken zijn bij het creëren van 3D-volume en isosurface renderen van ofwel de SBFI gegevens of de 2Photon microscopie met behulp van de software voor beeldanalyse (zie Materialen tabel). (A) de 2D plakjes van de ruwe gegevens in segment modus met een enkel vlak; (B) 3D volume van de 2D plakken; (C) de isosurface wizard voor het maken van een regio van belang (ROI) geselecteerd; (D) een algoritme met een achtergrond aftrekken geselecteerd; (E) een drempelwaarde toegepast te halen de pixels die vertegent de data; (F) centrum zaad punten van het oppervlak; (G) een volume gebaseerde filter wordt toegepast geringere hoeveelheid puin en elimineren; (H) de uiteindelijke 3D isosurface; (I) key frame animation wizard om de films te maken zoals in het SI-video's. Het uiteindelijke gerenderde beelden worden getoond in zowel volume als isosurface modaliteiten in het SI Video 3-7. Het protocol stappen 3.1.3-3.1.5 dekt deze procedures. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Materiaal / uitrusting | Bedrijf | Catalogus / Modelnummer | Commentaar / Beschrijving |
| Coral Tissue Skeleton | Geen | Geen | 2,5 cm Biopsy van natuurlijke habitat |
| Boog Punch Coring Device | CS Osborne and Company | Nr. 149 | Coral biopsie collectie |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-verdund |
| Histoclear / Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Niet-giftig alternatief voor xyleen, Uitdroging en Deparafinization |
| Xyleen en Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Uitdroging |
| Paraffine | Richard Allen Wetenschappelijke | Type H REF 8338 | Infiltratie oplossing |
| Vybar | De Candle Maker | Geen | Onderdeel van Red Wax |
| Stearine | De Candle Maker | Geen | Onderdeel van Red Wax |
| Soedan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque achtergrond |
| Tarwekiemagglutinine (WGA) | Life Technologies | W32466 | Voor het labelen van Coral Slijm |
| Verleng Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade montage media |
| Fluor Dish | World precisie-instrumenten | FD-35-100 | Voor twee-foton beeldvorming |
| XY Motor, Driver en Controller | Lin Techniek | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translationeel Beweging |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting alle wax |
| Convectie Oven | Yamato | DX-600 | Infiltratie en Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | |
| Microtoom | Leica | RM2055 | Wegwerp messen |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Doelstelling |
| Fluorescentiemicroscoop met apotome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, apotome ik System | Beeldvorming dunne gedeelte van een poliep: Zoöxanthellen |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRM | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| AxioVision Software | Carl Zeiss | Versie 4.8 | Beeldaanwinst programma |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai EHP, gepulste laser (70 fs) | Met DeepSee module |
| Laser scanning microscoop | Carl Zeiss | LSM 710 met Spectral Detector | 34kanaal PMT detectie |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 of hoger | voor twee-foton en spectrale beeldaanwinst |
| Imaris Suite Software | Bitvlak, Inc, | Versie 7.0 of hoger | 3D Volume, Iso-oppervlak Rendering, Visualisatie |
Tabel 1 Belangrijkste materialen, uitrusting, microscopen en software die wordt gebruikt in deze studie.
SI Video 1. In situ onderwater veld video waarin het koraal leefgebied op 12 m WD van M. faveolata bij Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. Individuele 2D serieblok gezicht beelden van de 3D-gerenderde afbeelding getoond in Figuur 4E.
SI Video 3. isosurface 3D beeld weer serieblok gezicht weergegeven in Figuur 4E en SI video 1 toont de topografie van het koraal poliep.
SI Video 4. 3D volume gerenderde ruwe data van twee-foton microscopie afbeelding van de koraalpoliep M. faveolata. De excitatie is 780 nm en de emissie tegelijkertijd gevangen op twee bandbreedtes voor zoöxanthellen (pseudo-gekleurde rood, 600-700 nm) en chromatophores (pseudo-groen gekleurd, 500-550 nm).
SI Video 5. 3D volume gegenereerd in isosurface-plekken twee-foton microscopie afbeelding van de koraalpoliep M.faveolata. De excitatie is 780 nm en de emissie tegelijkertijd gevangen op twee bandbreedtes voor zoöxanthellen (pseudo-gekleurde rood, 600-700 nm) en chromatophores (pseudo-groen gekleurd, 500-550 nm).
SI Video 6. 3D volume gerenderde ruwe data van twee-foton microscopie afbeelding van de koraalpoliep M. annularis. De excitatie is 780 nm en de emissie tegelijkertijd gevangen op twee bandbreedtes voor zoöxanthellen (pseudo-gekleurde rood, 600-700 nm) en chromatophores (pseudo-groen gekleurd, 500-550 nm).
SI Video 7. 3D volume gerenderde isosurface-plekken twee-foton microscopie afbeelding van de koraalpoliep M. annularis. De excitatie is 780 nm en de emissie tegelijkertijd gevangen op twee bandbreedtes voor zoöxanthellen (psEUDO-rood gekleurd, 600-700 nm) en chromatophores (pseudo-groen gekleurd, 500-550 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koraalrif onderzoek is een sterk interdisciplinair onderzoek inspanning, waarbij de analyse van de gelijktijdige fysieke, chemische en biologische verschijnselen die actief zijn in het mariene milieu. De studie van complexe ecosystemen van het koraalrif is daarom het beste binnen een 'Powers of Ten' contextueel kader (figuur 10). Deze grafische compilatie illustreert dat het koraal ecosysteem omvat een breed scala van ruimtelijke dimensies (10 -9 tot 10 5 m). Bovendien is deze oefening illustreert dat geobiologische analyseert op een tussenliggende lengte-schaal van 1 mm-1 cm zijn de brug nodig zijn veld te combineren en laboratoriumanalyses. Dit Powers of Ten kader is de context voor de experimenten, analyses, modellering, en synthese van de fysische, chemische en biologische parameters die Curaçao koraalrif ecosysteem beheersen.
De huidige studie is de eerste die de volledig geïntegreerde suite o toepassingf FM, SBFI en CLSM technieken om de respons van ogenschijnlijk gezonde koralen waterdiepte toenemende volgen. Lichtmicroscopie tools beschikbaar om het gehele weefsel of dikke biologische monsters zijn beperkt door een verscheidenheid aan optische eisen gesteld door de monsters zelf, die absorptie, verstrooiing en andere fenomenen omvatten. Binnen slechts het laatste decennium werd SBFI scanning elektronenmicroscopie gebruikt ultrahoge resolutie 31 en licht microscopische beeldvorming middels wide-field gebaseerde SBFI beeldvorming van verscheidene biologische monsters. Dit heeft opgenomen analyses van alles, van de hersenen om hele hart weefsels en zelfs monsters met botten die geslepen, gepolijst waren, geëtiketteerd, en afgebeeld op hetzelfde moment na elke sectie werd 23-29. Recent werden fluorescentie en confocale microscopie gebruikt om de contouren, vorm en verdeling van eiwitten en pigmenten in biologische monsters 32-33 onthullen. De 3D-structuur van individuele koraalpoliepen had niet eerder opgelost. Voorwaarde voor SBFI met koraal monsters ontkalking, zoals calciumcarbonaat voordat waardoor de monsters vatbaar voor infiltratie en snijden met bijvoorbeeld een microtoom worden verwijderd.
Hier twee-foton fluorescentiemicroscopie wordt onmisbaar voor de analyse van biologische weefsels vanwege de unieke twee-foton excitatie verschijnselen. Dit leidde tot uitgebreide diepte penetratie 33-34 van het koraal weefsel in het huidige onderzoek, waar de ontkalking stap effectief werd geëlimineerd als gevolg van de niet-lineaire twee-foton excitatie verschijnselen 34. Bovendien, de precompensatie module met de twee-foton laser ontvangen veel kortere pulsduur, die bovendien verbeterde indringdiepte. Aan de staalzijde, aangezien calciumcarbonaat niet het nabij infrarood licht absorbeert bij 780 nm, is dieptepenetratie doorgaans beperkt door de werkafstand van de doelstelling. Nog een nadeel of ontkalking en de verwijdering van koraal skelet is het verlies van de structurele integriteit van het koraal weefsel, waardoor weefsel volume schattingen maakt het nog moeilijker nadat het monster is gegaan door meerdere uitdroging en rehydratatie stappen en inbedding in-water vrij was. Dit benadrukt het belang van het bepalen van koraal weefsel volumes, zowel voor als na de verwerking.
De confocale karakterisering van fluorescerende eiwitten van koraal is afgerond voor Great Barrier Reef koralen en de beschermende spectrale eigenschappen zijn gecorreleerd met de diepte van het koraal leefgebied 32. In de onderhavige studie tonen we voor de eerste keer met behulp van twee-foton microscopie dat er een aanzienlijke vermindering van chromatophores overal in diep water koraal behalve mond weefsels. Bovendien heeft het duidelijke veranderingen in de verdeling van zoöxanthellen ten opzichte van de chromatophores waargenomen in diepte transects in M. annularis, where het ondiepe water koraal weefsels zijn volledig bedekt met chromatoforen. De resolutie door de sterke vergroting imaging (figuren 8C en 8D), kunnen we nu exact kwantificeren stippellijn volume door de zoöxanthellen genomen en de weefseldichtheid's wordt bepaald ten opzichte van andere cellulaire componenten. Samen genomen, hebben de integratie van SBFI en twee-foton fluorescentie spectrale beeldvorming in de huidige studie van vitaal belangrijke nieuwe inzichten in de morfologie en structuur van koraal weefsel opgeleverd. Deze gegevens zullen helpen om de afzonderlijke componenten van koraal weefsel te kwantificeren, zowel op het individuele poliep niveau of op het contextuele niveau van wisselwerking tussen koloniale poliepen op een hele koraal hoofd. Dit kader zal nu toestaan dat de adaptieve respons van het koraal holobiont op veranderingen in de zeespiegel waterdiepte en instraling kwantitatief te worden gevolgd en voorspeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
