Summary
En integreret suite af billeddannende teknikker er blevet anvendt til at bestemme polyp morfologi og væv struktur i Caribien koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Fluorescens, seriel blok ansigt, og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi har identificeret tunget struktur, polyp væggene, og estimeret chromatophore og zooxanthellae tætheder og fordelinger.
Abstract
En integreret suite af billeddannende teknikker er blevet anvendt til at bestemme den tredimensionelle (3D) morfologi og cellestruktur polyp væv omfattende Vestindien revet bygning koraller Montastraea annularis og M. faveolata. Disse tilgange omfatter fluorescensmikroskopi (FM), seriel blok ansigt imaging (SBFI), og to-foton konfokal laser scanning mikroskopi (TPLSM). SBFI giver dyb væv billedbehandling efter fysisk sektionering; Den beskriver vævet overfladestruktur og 3D-visualisering til væv dybder mere end 2 mm. Supplerende FM og TPLSM yield ultrahøje opløsning billeder af væv cellestruktur. Resultaterne er: (1) identificeret tidligere urapporteret tunget væv morfologier på den ydre væg af individuelle koralpolypper og (2) skabte de første overflade kort i 3D-distribution og væv tæthed af chromatophores og alger-lignende dinoflagellat zooxanthellae endosymbionts. Spectral absorption ærtaa 500 nm og 675 nm, antyder, at M. annularis og M. faveolata indeholde tilsvarende typer af klorofyl og chromatophores. Men M. annularis og M. faveolata udviser betydelige forskelle i vævstæthed og 3D-fordeling af disse centrale cellulære komponenter. Denne undersøgelse fokuserer på billeddiagnostiske metoder indikerer, at SBFI er særdeles nyttig til analyse af mm-skala prøver af afkalket koraller væv store. Gratis FM og TPLSM afslører subtile submillimeter skala ændringer i cellulær fordeling og tæthed i nondecalcified koral vævsprøver. Den TPLSM teknik giver: (1) minimalt invasiv prøveforberedelse, (2) overlegen optisk skæring evne, og (3) minimal lys absorption og spredning, mens det stadig tillader dybe væv billeddannelse.
Introduction
Global opvarmning og ledsagende miljøændringer direkte påvirker sundhed og distribution af tropiske marine koraller 1-4. Flere påvirkninger bliver overholdt, herunder koraller blegning og fremkomsten af infektionssygdomme 5-6. Mere præcis forudsigelse af fremtidige koral reaktion på disse trusler mod miljøet, vil dog kræve, at der etableres en histologisk "baseline", som definerer vævsmorfologi og celle sammensætning og fordeling af "tilsyneladende raske" koraller. Til gengæld "påvirket" koraller kan derefter kvantitativt sammenlignes. Desuden bør der etableres denne baseline for tilsyneladende sunde koraller under forskellige miljømæssige forhold, således at "sund reaktion" også kan måles på tværs af miljømæssige gradienter. Som et indledende skridt i retning af oprettelse af denne baseline, har en høj opløsning 3D-undersøgelse er foretaget af, hvor tilsyneladende sunde koraller polyp vævmorfologi og cellulære sammensætning reagerer på stigninger i vanddybde (WD) og ledsagende fald i sollys bestråling. Resultaterne kan derefter bruges til at etablere en mere omfattende mekanistisk forståelse af koraller tilpasning, samt at få indsigt i koral-symbionten udvikling og forbedring af lys høst.
Stenkoraller (Scleractinia) er koloniale marine hvirvelløse dyr, der spiller vært til en kompleks samling af andre mikroorganismer, samlet benævnt koraller holobiont 7-10. Den forskning, der foretages i nærværende undersøgelse ønsker at benytte en suite af cutting-edge imaging teknologier til samtidigt at spore ændringer med stigende vanddybde i vævet pigmenter og symbiotisk zooxanthellae af tilsyneladende raske vært koraller. Dette vil skabe det nødvendige sammenlignende væv celle "baseline" over en bathymetriske gradient i tilsyneladende sunde koraller og fungere som indikatorer for koraller HEALTH 10. Coral pigmenter, kaldet chromatophores, handle for at absorbere, reflektere, scatter, bryder, afbøje eller på anden måde forstyrre indfaldende solstråling 11. Den zooxanthellae-chromatophore endosymbiotic forhold har muliggjort coevolution strategisk fordelagtig lys høst optimering og skelet vækststrategier samt trofiske plasticitet (skiftende fodringsstrategier back-og-tilbage fra autotrophy til heterotrophy) for den koral dyr 12.
Den sydlige caribiske ø-nation af Curaçao (tidligere en del af De Nederlandske Antiller) ligger ca 65 km nord for Venezuela i øst-vest Trendvisning Aruba-La Blanquilla øgruppe (figur 1A). De 70 km lange sydkyst Curaçao indeholder en kontinuerlig moderne og Miocæn-Pliocæn-Pleistocæn-Holocæn gamle sløring koralrev tarmkanalen 13,14. Mean årlig SST på Curaçao varierer ca. 3 ° C ennually, der spænder fra et minimum på 26 ° C i slutningen af januar til et maksimum på 29 ° C i begyndelsen af september, med en gennemsnitlig årlig temperatur på 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST Datasæt 2000-2010). Den koralrev ved Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), der ligger nær den nordvestlige spids af Curaçao (figur 1A), blev valgt til prøveudtagning, fordi det tidligere har været godt undersøgt og marine økosystem på dette sted er badet i frisk nonpolluted havvand 7,15-19. . To nært beslægtede scleractinian koraller arter, M. annularis og M faveolata, blev udvalgt til eksperimenter og analyse i denne undersøgelse, fordi hver art: (1) udviser tydeligt forskellige og nonoverlapping bathymetriske fordelinger på revet tarmkanalen med hensyn til hylden pause og tilknyttede carbonat sedimentære depositional miljøer (M. annularis rækkevidde = 0-10 m WD M. faveolataområde = 10-20 m WD 20, figur 1B, 2A og 2B); (2) er en fælles koralrev rammer bygmester i hele det Caribiske Hav 21; og (3) har velundersøgte økologiske, fysiologiske og evolutionære relationer 22.
Felt prøvetagning for den nuværende undersøgelse blev udført ved hjælp af standard dykning teknikker offshore for Playa Kalki på Curaçao. En lavvandet-til-dybt vand batymetriske transekt blev fastslået, at løb over hylden over hylden pausen, og i det dybe vand forgrunden reef miljøer. Tilsyneladende sund koraller hoveder blev derefter udpeget til prøvetagning langs denne bathymetriske transekt, herunder: (1) tre individuelle ~ 1 mi diameter koraller hoveder M. annularis, som alle var i 5 m vanddybde (WD); og (2) tre individuelle ~ 1 mi diameter koraller hoveder M. faveolata, som alle var på 12 m WD. Fotosyntetisk aktiv stråling (PAR) blev målt som 33-36% PAR i 5 m WD og 18-22% PAR ved 10 m WD. Stikprøver blev gennemført i januar, da SST var 26 ° C på vanddybder både 5 m og 12 m. Hver af disse seks koraller hoveder blev udtaget i tre eksemplarer ved ækvivalente rumlige positioner (dvs.. Ca. 45 ° nordlig bredde på hver af de seks halvkugleformede koraller hoveder). Hver enkelt prøve bestod af en 2,5 cm i diameter koral væv-skelet kerne biopsi, der blev opsamlet med en rengjort bue punch. Tre koral væv-skelet biopsier blev udtaget på standard SCUBA med behandskede hænder fra hver af de koraller hoveder (9 fra M. annularis kolonier på 5 m WD og 9 fra M. faveolata på 12 m WD). Umiddelbart efter indsamling på dybde, blev hver biopsi kerne prøve anbringes i en steril 50 ml centrifuge polypropylen rør, skrue-top forseglet, og vendte tilbage til overfladen. Havvandet blev dekanteret fra hvert centrifugerør og hver kerne biopsi blev derefter neddykket, opbevaret og transporteret i 4% paraformaldehyd.
23-30 hel-hjerne og hel-hjerte humane væv, intakte museembryoer, zebra fisk embryoner, og. De fleste af udnyttet optisk / lysmikroskopi med enten fluorescens eller lyse felt teknikker disse undersøgelser. Men undersøgelser har været gennemført ved ultra-høje forstørrelser anvender scanning elektron seriebloknummer ansigt billeddannelse i fortiden 31. I den foreliggende undersøgelse, er en modificeret SBFI protokol er udviklet til og anvendt til koraller for første gang. Fordi M. annularis og M. faveolata koralpolypper er 1-2 mm i tykkelse, ville ingen af de rutinemæssige lysmikroskopi teknikker være i stand til at trænge ind i hele tykkelsen af koraller polyp væv. Derfor har vi SBFI prøveforberedelse protokol specielt designet til koral prøver. Derudover har vi specialdesignet et stereomikroskop indehaveren, Der er motoriseret til at bevæge sig i både x og y-retningen. Dette apparat tager billeder af blokken flade af prøven snarere end at indsamle de sektioner ved hjælp af en regelmæssig mikrotom foran mikroskopet. Vi indførte også en anden ikke-lineær optisk to-foton mikroskopisk teknik til afbildning af samme koralpolypper over hele tykkelsen af koral væv. Dette overvinder de begrænsninger, som SBFI i form af afkalkning og muligheden for ændringer i vævsmorfologi og volumen (skrumpende), der kan genereres af prøveforberedelse (dehydrering) og forarbejdning protokoller. Endvidere blev emissionsprofiler fra korallerne spektralt besluttet at identificere deres peak emissioner og variationer mellem chromatophores og den fotosyntetiske zooxanthellae. Disse resultater blev evalueret i forbindelse med den anvendte metode og deres særlige fordele i forbindelse med køb tid, analyse tid, og evnen til at løse fine strukturelle detaljer uden at kompromittere structural integritet af koraller væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Reagenser at være forberedt på seriebloknummer Face Imaging for Coral Prøver
1. Preinfiltration Wax
- Smelt 3,6 g stearin flager i et bægerglas. Bland godt på en varm plade (60-70 ° C).
- Tilsæt 400 mg Sudan IV (for at minimere voks baggrund fluorescens). Bland godt og vente, indtil en rød gennemsigtig løsning er opnået.
- Tilføj 96 ml varm smeltet paraffin (100%), og bland godt.
1.2) Embedding Wax
- Smelt 7,2 g stearin flager i et bægerglas og blandes godt på en varm plade (60-70 ° C).
- Tilsæt 0,8 g Sudan IV. Bland godt og vente, indtil en rød gennemsigtig løsning er opnået.
- Tilføj paraffin granulat (162 g) og bland indtil paraffinen smelter helt.
- Tilsæt 30 g hvidt kornet Vybar og smelte fuldstændigt i samme bæger; når smeltet, blandes.
- Løst lukke glasflaske med et låg. Placer glasflaske i en 60 ° C konvektion ovOr at holde ingredienserne i en flydende tilstand. Foretag alle infiltrationer i denne ovn.
- Split den samlede volumen af 200 ml røde voks i to glasflasker på 100 ml hver. Brug en portion til infiltration og den anden til den endelige indlejring.
1.3) indlejring Coral væv til Serial Block Face Imaging
- Vask koralpolypper indsamlet i marken (SI video 1) og opbevaret (3-6 måneder ved 4-5 ° C i paraformaldehyd) i phosphatpufret saltvand (3x 5 min) og afkalke når de er klar til at blive afbildet. Afkalke polypper i Excal løsning i 24 timer, eller indtil de polypper er totalt blottet for CaCO 3. Inkuber flere afkalket koralpolypper som en enkelt blok i en 25, 50, 75, og 100% ethanol-serien, efterfulgt af 1x xylen stedfortræder til at dehydrere prøverne.
- Placer de forarbejdede polypper i en forvarmet 65 ° C ovn indeholder 100% xylen stedfortræder. Inkuber i 30 minutter to gange ved changing til frisk opløsning. Orientere polypper på en sådan måde, at toppen af polypper vender nedad og den øverste overflade er så flad som muligt.
- Gør opløsninger af 2: 1, 1: 1 og 1: 2 xylen erstatning og preinfiltration voks (trin 1.1) i 50 ml Falcon-rør.
- Inkuber koralpolypper med disse tre stigende koncentrationer af preinfiltration voks, efterfulgt af 3x inkubation i 100% preinfiltration voks til 30-60 minutter hver gang.
- Bemærk: Afhængig af tykkelsen af prøverne, trin 1.3.1-1.3.5 kunne øges med længere perioder.
- Flyt prøverne til indlejring voks (se trin 1.2.6) efter 3x inkubation i 100% preinfiltration voks.
- Fjern indlejring voks efter 30 min. Udskift med frisk indlejring voks og fortsætte inkubation i mindst 4 timer ved 65 ° C.
1.4) Embedding i Red Wax
- Fotografere blok (den bakke af rustfrit stål, hvor hvid voks anbringes og på toppen af hvilken samPLE er placeret). Dette er nødvendigt, fordi når indlejret i voks, vil placeringen af prøven blive usynlig som indlejring røde voks er uigennemsigtigt.
- Placer små dråber af højt smeltepunkt voks omkring den nye forvarmede rustfrit stål indlejring mug og lad det køle af. Hæld en lille mængde frisk smeltet indlejring voks fra anden beholder som angivet i trin 1.2.6.
- Placer koraller polyp nedad hurtigt over den hvide voks prik, og derefter placere en plastik prøve holder på bakke af rustfrit stål og hæld mere indlejring voks, så voks kommer op til overfladen af plast støber.
- Tag hele opsætningen ud af 65 ° C varm ovn og lad det køle af på en bænk eller en kølig overflade, indtil voksen helt hærder.
- Dette kan tage 6 timer op til dag eller to. Placer blokken tørret i et køleskab ved 4 ° C, beskyttet mod lys, til langtidsopbevaring.
1.5) Skæring ved seriebloknummeret Face opsætning
- Trim blokken og skære 1 um snit ved hjælp af en mikrotom. Indsamler ikke afsnittene, da de vil blive som pulver. Husk, vi er billeddannelse kun blokken ansigt. Prøven vises, når den hvide voks begynder at forsvinde.
- Tage billeder af den glatte blok ansigt, som indeholder prøven, hver gang et afsnit er fjernet. Fortsæt, indtil koraller polyp forsvinder som i SI Video 2.
- Optag / Optag billeder med et monokromt kamera ved hjælp af et FITC fluorescerende filter til at afhente auto-fluorescens af chromatophores / koral polyp. Billede 3-4 kalkfattige kerner fra hver art.
2. Imaging Koraller under to-foton fluorescensmikroskopi
- Fix koraller polyp kerner, der hver indeholder omkring 10-12 polypper omkring en tomme i diameter, i 4% paraformaldehyd på stedet for samling (over havet kysten), så snart de er høstet under vand.
- Opbevare prøver ved 4 ° C indtil billeddannelse. Vaskede kerner er placeret i the samme løsning på hovedet i et dæksel glasbund skål (0,17 mm tyk).
- Ved hjælp af en to foton laser på 780 nm excitation, billede 3-4 polypper ved to forskellige forstørrelser (digital zoom) ved hjælp af en 10X (0,3 NA) mål. Koral polyp form og højde varierer mellem prøverne (normalt 1-2 mm), og billeddannende dybde begrænses også af den billeddannende mål arbejdstid afstand.
- Brug flisen scanning til at indsamle ca 25-100 (5 x 5 eller 10 x 10 fliser) billeder pr fokalplan i xy og 50-100 billeder via z-aksen ved 10 eller 20 pm interval, i alt omkring 5.000-10.000 billeder / koral polyp.
- Billede 3-4 polyp områder til at repræsentere en kerne og koraller arter. BEMÆRK: Billede erhvervelse tid varierer mellem 2-5 timer / polyp område.
- Opbevar alle billeder i rå dataformat i systemets harddisk som LSM 5. Render 3D i et 3D-billede analyse og rendering software.
3. 3D Volume Rendering og Visualization af SBFI og to-foton Spectral fluorescensdata
- Beskære 2D-data for at reducere filstørrelsen ved at fokusere på en enkelt polyp i den firkantede beskæringsværktøjet i programmet og kompilere som en enkelt TIFF-fil (reducere filstørrelsen også ved at gemme filen i 8 bit-format) i købet softwaren.
- Åbn de forsamlede filer af SBFI data (indsamlet i trin 1.5.1) eller flisebelagte flere z-stakke af to foton optiske sektioner (opsamlet i trin 2.1.4) i programmet Imaris Surpass modul under volumen algoritme.
- Projicere SBFI data gengives i 3D ved hjælp af en skygge projektion. Opret en isosurface mode, hvor de voxel er tærsklingsbehandles at skabe en fast overflade mønster (SI Video 3).
- Visualiser 3D fremskrivninger ved hjælp af en klipning fly algoritme på xy, xz, og YZ ortogonale tilstande at afsløre 3D struktur og form af koraller.
- Animere fremskrivninger hjælp af en nøgle frame animation modul i samme Imaris programmet (SI Videos 3-7).
- Generer videofiler ved 5% kompression og generere en filmklip i avi-format ved hjælp af volumen (SI Videoer 4 og 6), 3D og Isosurface modaliteter (SI Videoer 5 og 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En specialdesignet SBFI apparat (fremstillet specielt til denne undersøgelse, figur 3) producerede den første detaljerede 3D digitale højdekort (Demokrater) af den ydre overflade tekstur og morfologi M. annularis og M. faveolature koralpolypper (Figur 4 og SI Videoer 1-2). Dette gav billeder af ikke tidligere beskrevet stablet lapper af koraller væv koncentrisk stråler udad fra midten af hver polyp (figur 4B, 4D og 4E). Disse lapper er stablet langs den øverste kant af vævs-dækket primære og sekundære skelet septa, med radialt yderste og nederste elevation lapper sidst syntese og fusionere med coenosarc væv mellem polypper. 3D polyp form og de tilknyttede lapper blev godt bevaret trods koral vævsprøve have været igennem flere trin af høj temperatur infiltration og forankring. Den Addition Sudan farvestof succes maskeres baggrunden som uigennemsigtige, med den sorte farve have hjulpet til at maksimere kontrasten af hver prøve og øge signal-støj-forholdet. 3D og ortogonale planbilleder viste fordelingen af fluorescerende komponenter langs z-aksen (figur 4B). Der var fly med voks flager, der til tider tilsløret polyp overflade detaljer, som blev fjernet for overskuelighedens skyld, når du opretter fremskrivninger. Den største fordel ved denne teknik er at afsløre interne oplysninger om enhver tyk prøve, hvilket eliminerer behovet for at tage flere sektioner og tilpasse dem på et senere tidspunkt. Endvidere er billederne i denne teknik allerede tilpassede når opsamlet (figur 4A), der giver az opløsning på op til 1 um fra en stikprøve på op til 10 mm eller derover (afhængigt af den totale kørsel afstand af blokken indehaveren i mikrotomet ). Det er muligt at skelne forskellige auto-fluorescerende komponenter (ved hjælp af flere filtre) samt individuellezooxanthellae ved højere forstørrelse, forudsat at den reducerede synsfelt er acceptabel.
Den ApoTome optiske sektionering fluorescens mikroskop afslørede fordelingen af koraller væv celler (zooxanthellae og chromatophores) og overflade væv struktur på en submillimeter opløsning. Derfor kunne 6-13 um diameter zooxanthellae let genkendes og kvantificeres med hensyn til antallet af celler pr vævsvolumen (figur 5). Den dobbelte kanal billedoptagelse ved hjælp af klorofylfluorescens (grøn) og slim mærket med WGB Alexa 647 (vist i rødt), fungerede bedst at kvantificere niveauet af slim og antallet af zooxanthellae inden for en given placering af polyp (større og mindre septa af polyp kunne beregnes uafhængigt).
Ud over disse mikroskop fremgangsmåder, har vi også anvendt TPLSM, en ikke-lineær teknik i vid udstrækning anvendes til tykke biologiske prøver. De store fordele ved TPLSM end påe-foton kontinuerlig lasere er, at: (1) excitation kun optræder fokuspunktet fordi strømmen af Excitationslysintensitet bliver kvadreret og chancen for et molekyle til at absorbere to på hinanden følgende fotoner til at excitere en elektron fra fluoroforen er begrænset til dybdeskarpheden af målet, hvilket giver en iboende confocality. og (2) som en konsekvens vil der ikke være tab af et anslag foton mens trænge dybere ind i prøven, i modsætning til enkelt foton lasere. Desuden fleste biologiske vævsprøver også absorbere synligt lys. Da de to-foton excitation er i sagens natur lang (i nær infrarød på 780 nm) er absorptionen også væsentligt minimeret. På den anden side, koral skelet består af calciumcarbonat næppe absorberer eller spreder to-foton lys. Endelig da vi var interesseret i at bestemme fordelingen af objekter kun på den profilerede overflade af koraller skelet, fandt vi dybere billeddannelse ved hjælp af denne modalitet very er egnet til koral billeddannelse.
Vi har forsøgt at karakterisere de tilgængelige spektrale signaturer i M. annularis (figur 6-9). Her viser vi, at under 780 nm to-foton excitering af chromatophore autofluorescens har en top omkring 500 nm, mens klorofylfluorescens fra zooxanthellae er centreret ved cirka 675 nm (figur 6). Mens unmixing af denne spektrale data (figur 6-7) er også mulig med en unmixing algoritme i softwaren (figur 8), idet der er en klar spektral afstand mellem de to komponenter, billeddannelse dem samtidigt under anvendelse af to detektorer på to emissionsbånd bevise at være mest tidsbesparelse teknik. Dette gælder især, når prøven er flisebelagt og filmede over en hel 1-2 mm dybde af væv. Dette eliminerer behovet for fysisk sektionering, som kræver flere tusinde billeder pr placering og prøve og polyp. Fordelingen o f auto-fluorescerende chromatophores er også tydelig (figur 9) blandt de to koraller testede arter. I et tilfælde observerede vi en betydelig stigning i chromatophores i lavvandede vand bolig koral M. annularis forhold til dybere vand M. faveolata (figur 9 og SI Videoer 3 og 4).
Figur 1. (A) Kort over Curaçao i det sydlige Caribiske Hav, der viser placeringen af undersøgelsen websted på Playa Kalki længst nordvestlige læ kyst af øen. (B) Skematisk tværsnit af rev-kantede hylde ved Playa Kalki på Curacao, viser vanddybden distributioner af M. annularis og M. faveolata. Iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. (A) In situ undervands felt fotografi på 12 m WD M. faveolata ved Playa Kalki, Curaçao. (B) Luk op udvidelse af billedet i (A), der viser de enkelte koralpolypper M. faveolata i dagtimerne lysforhold (hver polyp er cirka 2 mm i diameter, hvoraf nogle er trukket tilbage, angivet ved *). Klik her for at se en større version af dette tal.
5in "src =" / filer / ftp_upload / 51824 / 51824fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Den serielle blok-ansigt billeddannelse instrumentering. (A og B) specialdesignet mikroskop Indehaveren, holder Stereolumar mikroskop ved 180 ° overfor blok ansigt af prøven anbringes i mikrotomen. Når hver sektion blev fjernet, blev billedet blokken ansigt fanget med målet og de 2D data digitalt lagret. Dette blev gjort indtil prøven forsvandt i blokken. Mikroskopet bevæges i x og y-retning ved hjælp af en motoriseret bly skruen og z, er justering af fokus prøven. Det er vigtigt at bemærke, at når hver 1 um prøve snit, de blokflytninger 1 um fremad, så koncentrere af anvendelsesområdet er ikke nødvendig. XYMOT, Specialbygget xy translationel motoriseret fase; FLS Fluorescens lyskilde; MT, Microtome; MIC Stereomikroskop; CAM, Axiocam monokrom kamera; BH, Block indehaver; BF, Block ansigtprøven; FLL, fluorescerende lys excitation plet på blokken ansigt; OBJ, Mikroskop mål; HIP, Human grænseflade panel. Et billede på dimensionen af 1.388 vandrette x 1.040 lodrette pixel i monokromtilstand blev opsamlet på en XY pixel (single) opløsning på 1,25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. seriebloknummer ansigt billeddannelse af koraller M. annularis og M. faveolata indsamlet fra Playa Kalki, Curaçao. (A) Prøve datasæt galleri viser omkring 800 billeder af individuelle 2D-billeder opnået fra en polyp på 1 um opløsning i z. (B) I en anden koral prøve den sektionering gik langt over 2,000 um i z. Billedet viser flere polypper og samling af alle 2D skiver til en 3D-volumen under skygge projektion ved hjælp af Imaris volumen visualisering algoritme. (C) ortogonal projektion viser en xz visning af prøven i (B), kan man se hele dybden af prøven over 2 mm, og pilene angiver de sorte linjer, hvor 2D skiver blev fjernet på grund af dårlig kvalitet; dette billede er fra M. annularis. 3D volumen (D), Isosurface rendering (E) og visualisering af SBFI data. (D) Flere koralpolypper viser polyp morfologi i længdesnit på siden og 3D volumenet (skygge projektion) af en enkelt polyp i midten. Sektionering og visualisering i enhver vinkel er muligt i 3D (se SI-video). E. Da voxel er slørede i 3D (D), 3D Isosurface afsmeltet overflade viser konturen af koraller polyp overflade og deres kontekstuellearrangement med tilstødende polypper (se SI video). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Fluorescensmikroskopi af koralpolypper. (A) Tværsnit af en afkalket polyp M. faveolata udstiller zooxanthellae med klorofyl autofluorescens under blå lys (vist med grønt) og mucosale lommer mærket med hvedekimagglutinin (vist i rødt) som afbildet under rødt lys. Billedet bliver automatisk flisebelagt i to kanaler og syet og tilpasset ved hjælp af instrumentets software. (B) Udvidelse af æsken vist i (A), der viser de enkelte zooxanthellae (hver grønne cirkler, indbyrdesende 6-8 um i diameter i grøn) og overfladen slim lag (rød), og sammenfletningen af de to kanaler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. To-foton spektral karakterisering af fluorescens fra koraller. Hjælp af spektrale detektor LSM 710-systemet blev fluorescenssignaler fra hele det synlige spektrum (419-722 nm) scannes over en dybde på omkring 190 um. Billedet viser dybden interval 5 um i x-aksen for Z stakken og y-aksen er bølgelængden 419-722 nm erhvervet til 10 nm-interval (i alt omkring 1.154 billeder viste). Man kan se de to spektrale komponenter, hvoraf den ene er centreret ved 500 nm og den anden ved 650 nm. En to-foton laser exciførelsen bølgelængde på 780 nm blev brugt til at opnå de emissionsprofiler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7. Karakterisering af de to spektrale komponenter. (A) Den spektrale profil baggrund (blå), autofluorescens fra chromatophores (grøn) og klorofylfluorescens (rød) ophidset ved to foton laserexcitation bølgelængde på 780 nm laser. Spektre, fremstillet vist i højre side af flerfarvet spektrale data overlejret og pseudo-farvet efter emissionen profilen. (B) De enkelte spektrale placeringer, hvor signalerne er indsamlet på 10 nm interval at udlede spektre og billedet i (A). Bemærk at de to adskilte dele, den ene centreret ved cirka 500 nm (chromatophore autofluorescens), og den anden over 675 nm (klorofyl fluorescens). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8. De samme billeder i 7A og 7B, spektrale data ublandet ved hjælp af softwaren, og deres tilsvarende emission toppe / spektre. I både M. annularis og M. faveolata de spektrale komponenter er meget ens, samt deres emissionsniveauer toppe. Den væsentlige forskel er imidlertid, på grund af placeringen af disse spektrale komponenter og deres overflod (se figur 9).ghres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. to-foton fluorescens 3D-billeder af koralpolypper fra M. annularis (AD) og M. faveolata (EH). (A og E) blev afbildet uden spektral adskillelse af komponenter ved hjælp af 780 nm excitation af to-foton-laser, med det optiske signal opsamlet 450-700 nm. (B og F) blev opsamlet med samme excitation (780 nm), men to PMT detektorer blev anvendt samtidigt at indsamle data fra to komponenter dvs., En 500-550 nm (grøn-chromatophore autofluorescens) og den anden 650 720 nm (rød-klorofyl fluorescens). (C og G), er dybde kodede billeder af(B og F), rød er lavest og blå er dybeste komponenter i 2D. (D og H) er YZ billeder af skære igennem (B og F) henholdsvis viser fluorescens kun kommer fra overfladen af koraller og skelettet har ikke nogen fluorescens ved 780 nm excitation. Bemærk den væsentlige forskel i chromatophore indhold mellem de to koraller. M. annularis levested (0-10 m WD) er lavvandede end M. faveolata levested (10-20 m WD). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10. Beføjelser Ti hierarkisk rumlig struktur studier of koralrev økosystemer. Klik her for at se en større version af dette tal.
SI Figur 1. Skærmbilleder, der viser trin (AI), der er involveret i skabelsen af 3D volumen og isosurface rendering fra enten SBFI data eller 2Photon mikroskopi ved hjælp af billedanalyse software (se Materialer tabel). (A) 2D skiver af rå data i skive tilstand viser et enkelt plan; (B) 3D volumen af alle de 2D skiver; (C) isosurface guiden til oprettelse med et område af interesse (ROI) valgt; (D) en algoritme med en baggrund subtraktion valgt; (E) en tærskelværdi påføres afhente pixels, som repræsent oplysningerne; (F) center kimpunkter af overfladen; (G) en volumen-filter anvendes til at fjerne mindre volumen af affald og støj; (H) den endelige 3D afsmeltet isosurface; (I) keyframe animation guiden til at oprette film, som i SI videoer. De endelige gengivne billeder er vist i både i volumen og isosurface modaliteter i SI Videoer 3-7. Protokollen trin 3.1.3-3.1.5 dækker disse procedurer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Materiale / udstyr | Virksomhed | Katalog / Modelnummer | Kommentarer / Beskrivelse |
| Coral Tissue Skeleton | Ingen | Ingen | 2,5 cm BioPsy fra naturlige habitat |
| Arch Punch Serviceringe Device | CS Osborne og Company | Nej 149 | For Coral biopsi samling |
| Paraformaldehyd | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-fortyndet |
| Histoclear / Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic suppleant for xylen, dehydrering og Deparafinization |
| Xylen og Ethanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Dehydrering |
| Paraffin | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration løsning |
| Vybar | The Candle Maker | Ingen | Del af Red Wax |
| Stearin | The Candle Maker | Ingen | Del af Red Wax |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Rød Voks uigennemsigtig baggrund |
| Hvedekimagglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | Til mærkning Coral slim |
| Forlæng Guld | Life Technologies | P36095 | Anti-fade montering medier |
| Fluor Dish | Verden Precision Instruments | FD-35-100 | For to-foton billedbehandling |
| XY Motor Driver og controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY forskydningsbevægelse |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting al voks |
| Varmluft ovn | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | |
| Mikrotomet | Leica | RM2055 | Engangs knive |
| Stereomikroskop | Carl Zeiss- | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Mål |
| Fluorescensmikroskop med ApoTome | Carl Zeiss- | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging tynd sektion af en polyp: zooxanthellae |
| Axiocam kamera | Carl Zeiss- | MRM | Monokrom kamera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss- | Version 4.8 | Billede erhvervelse program |
| To-foton laser | Spectraphysics | Maitai EHP pulseret laser (70 fs) | Med DeepSee modul |
| Laserscanningmikroskop | Carl Zeiss- | LSM 710 med Spectral Detector | 34kanal PMT afsløring |
| Zen Software | Carl Zeiss- | 2010 eller derover | for to-foton og image erhvervelse spektrale |
| Imaris Suite-softwaren | Bitplane, Inc. | Version 7.0 eller nyere | 3D Volume, Iso-overfladegengivelse, Visualisering |
Tabel 1. De vigtigste materialer, udstyr, mikroskoper, og software, der anvendes i denne undersøgelse.
SI Video 1. In situ undervands felt video, der viser koraller levested på 12 m WD M. faveolata ved Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. Individuel 2D seriebloknummer ansigtsbilleder af 3D afsmeltet billede vist i Figur 4E.
SI Video 3. Isosurface 3D afsmeltet billede seriebloknummer ansigt vist i figur 4E og SI video 1 viser topografien af koraller polyp.
SI Video 4. 3D volumengengivet rådata to-foton mikroskopi billede af koraller polyp M. faveolata. Excitation er 780 nm og emission fanget samtidigt på to båndbredder til zooxanthellae (pseudo-farvet rød, 600-700 nm), og chromatophores (pseudo-farvet grønne, 500-550 nm).
SI Video 5. 3D volumen afsagt i Isosurface-spots to-foton mikroskopi billede af koraller polyp M.faveolata. Excitation er 780 nm og emission fanget samtidigt på to båndbredder til zooxanthellae (pseudo-farvet rød, 600-700 nm), og chromatophores (pseudo-farvet grønne, 500-550 nm).
SI Video 6. 3D volumengengivet rådata to-foton mikroskopi billede af koraller polyp M. annularis. Excitation er 780 nm og emission fanget samtidigt på to båndbredder til zooxanthellae (pseudo-farvet rød, 600-700 nm), og chromatophores (pseudo-farvet grønne, 500-550 nm).
SI Video 7. 3D volumen afsmeltet Isosurface-spots to-foton mikroskopi billede af koraller polyp M. annularis. Excitation er 780 nm og emission fanget samtidigt på to båndbredder til zooxanthellae (psEUDO-farvet rød, 600-700 nm), og chromatophores (pseudo-farvet grøn, 500-550 nm).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Koralrev forskning er en meget tværfaglig forskningsindsats, der omfatter analyse af den samtidige fysiske, kemiske og biologiske fænomener, der opererer i havmiljøet. Studiet af komplekse koralrev økosystemer er derfor bedst afsluttes inden for en "Powers of Ten 'kontekstuelle ramme (Figur 10). Denne grafiske samling illustrerer, at koraller økosystem dækker en bred vifte af rumlige dimensioner (10 -9 til 10 5 m). Desuden er denne øvelse illustrerer, at geobiological analyser på et mellemliggende længde-skala fra 1 mm-1 cm er broen er nødvendig for at kombinere felt og laboratorieanalyser. Denne Beføjelser Ti rammer er baggrunden for de eksperimenter, analyser, modellering, og syntese af de fysiske, kemiske og biologiske parametre, der styrer Curaçao koralrev økosystemer.
Nærværende undersøgelse er den første til at anvende fuldt integreret suite of FM, SBFI og CLSM teknikker til at spore svar på tilsyneladende raske koraller stigende vanddybde. Lysmikroskopi værktøjer til rådighed for billedet hele væv eller tykke biologiske prøver er blevet begrænset på grund af en række forskellige optiske begrænsninger, som prøver selv, som omfatter absorption, spredning og andre fænomener. Inden for blot det sidste årti, blev SBFI scanningselektronmikroskopi bruges ved ultra-høje resolutioner 31 samt lysmikroskopisk billeddannelse ved hjælp af bredt felt baseret SBFI billeddannelse af flere biologiske prøver. Dette har omfattet analyser af alt fra hjerne til hele hjerte væv og endda prøver indeholdende knogler, der blev formalet, poleret, mærkede, og afbildet på samme tid efter hvert afsnit blev foretaget 23-29. For nylig blev fluorescens og konfokal mikroskopi anvendes til at afsløre de konturer, form og fordeling af proteiner og pigmenter i biologiske prøver 32-33. Men 3D-strukturen af individuelle koralpolypper had ikke tidligere er blevet løst. Forudsætningen for SBFI med koral prøver afkalkning, da calciumcarbonat skal fjernes, før at gøre prøverne modtagelige for infiltration og sektionering hjælp af en almindelig mikrotom.
Dette er, hvor to-foton fluorescens mikroskopi uundværlig til analyse af biologiske væv på grund af dens unikke to-foton excitation fænomener. Dette førte til udvidet dybde penetration 33-34 af koraller væv i nærværende undersøgelse, hvor afkalkning skridt blev effektivt elimineret på grund af den ikke-lineære to-foton excitation fænomener 34. Desuden precompensation modulet med to-foton laser billede meget kortere impulsbredde, som desuden forbedret indtrængningsdybde. På prøven side, da calciumcarbonat ikke absorberer det nærinfrarøde lys ved 780 nm, er dybde penetration begrænses typisk af arbejdsgruppen afstand af målet. Endnu en anden ulempe of afkalkning og fjernelse af skelet koraller er tabet af strukturel integritet af koraller væv, hvilket gør vævet volumenvurderinger endnu hårdere efter at prøven er gået gennem flere dehydrering og rehydrering trin og indstøbning i vand-fri voks. Dette understreger betydningen af, at koraller væv mængder både før og efter behandlingen.
Konfokal karakterisering af fluorescerende proteiner af koraller er blevet afsluttet for Great Barrier Reef koraller og de beskyttende spektrale egenskaber er blevet korreleret med dybde af koraller levested 32. Men i den foreliggende undersøgelse viser vi for første gang under anvendelse af to-foton mikroskopi, at der er en væsentlig reduktion af chromatophores overalt på dybt vand koral undtagen i munden væv. Desuden har de forskellige ændringer i fordelingen af zooxanthellae med hensyn til chromatophores blevet observeret tværs dybde transekter i M. annularis, Where de lavvandede koral væv er helt dækket med chromatophores. Med den resolution, som den høje forstørrelse imaging (figur 8C og 8D), kan vi nu præcist tal på areal og volumen taget op af zooxanthellae og deres vævstæthed nøgletal kan bestemmes med hensyn til andre cellulære komponenter. Tilsammen har integrationen af SBFI og to-foton fluorescens spektral billeddannelse i nærværende undersøgelse gav livsvigtige nye indsigter i morfologi og struktur koraller væv. Disse data vil bidrage til at kvantificere de enkelte komponenter af koraller væv, enten på enkelte polyp niveau eller på det kontekstuelle niveau af samspil mellem koloniale polypper på en hel koral hovedet. Denne sammenhæng vil nu tillade adaptiv respons af koraller holobiont til ændringer i havniveauet vanddybde og indstråling skal kvantitativ spores og forudsagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
- Climate Change 2013: The Physical Science Basis. Contribution of Working Group I to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. Stocker, T. F., Qin, D., Plattner, G. -K., Tignor, M., Allen, S. K., Boschung, J., Nauels, A., Xia, Y., Bex, V., Midgley, P. M. , Cambridge University Press. 1535 (2013).
- Buddemeir, R. W., Kleypas, J. A., Aronson, R. B. Coral Reefs & Global Climate Change: Potential Contributions of Climate Change to Stresses on Coral Reef Ecosystems). 46, Pew Center on Global Climate Change. (2004).
- Wilkinson, C. Status of coral reefs of the world. , Australian Institute of Marine Science. Townsville. 1-2 (2004).
- Lough, J. M. Climate records from corals. WIREs Clim. Chang. 1, 318-331 (2010).
- Harvell, C. D., et al. Tropical Archaea: diversity associated with the surface microlayer of corals. Mar. Ecol. Prog. Ser. 273, 81-88 (2004).
- Coral Health and Disease. Rosenberg, E., Loya, Y. , Springer. (2004).
- Rohwer, F., Breitbart, M., Jara, J., Azam, F., Knowlton, N. Diversity of bacteria associated with the Caribbean coral Montastrea franksi. Coral Reefs. 20, 85-91 (2001).
- Frias-Lopez, J., Zerkle, A. L., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Partitioning of bacterial communities between seawater and healthy, black band diseased, and dead coral surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 68, 2214-2228 (2002).
- Stanley, G. D. Jr The evolution of modern corals and their early history. Earth Sci. Rev. 60, 195-225 (2003).
- Piggot, A. M., Fouke, B. W., Sivaguru, M., Sanford, R., Gaskins, H. R. Change in zooxanthellae and mucocyte tissue density as an adaptive response to environmental stress by the coral Montastraea annularis. Mar. Biol. 156, 2379-2389 (2009).
- Stanley, G. D. Jr Photosymbiosis and the evolution of modern coral reefs. Evolution. 1, 3 (2006).
- Gordon, B. R., Leggat, W. Symbiodinium—Invertebrate Symbioses and the Role of Metabolomics. Mar. Drugs. 8, 2546-2568 (2010).
- Schlichter, D., Weber, W., Fricke, H. W. A chromatophore system in the hermatypic, deep-water coral Leptoseris fragilis (Anthozoa: Hexacorallia). Marine Biology. 89, 143-147 (1994).
- Fouke, B. W., Meyers, W. J., Hanson, G. N., Beets, C. J. Chronostratigraphy and dolomitization of the Seroe Domi Formation, Curacao, Netherlands Antilles. Facies. 35, 293-320 (1996).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Jin, Q., Fouke, B. W. Cyanobacteria associated with coral black band disease in Caribbean and Indo-Pacific reefs. Appl. Environ. Microbiol. 69, 2409-2413 (2003).
- Frias-Lopez, J., Klaus, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. The bacterial community associated with black band disease in corals. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5055-5062 (2004).
- Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Fouke, B. W. Identification of differential gene expression in bacteria associated with coral black band disease using RNA-arbitrarily primed PCR. Appl. Environ. Microbiol. 70, 3687-3694 (2004).
- Klaus, J. S., Frias-Lopez, J., Bonheyo, G. T., Heikoop, J. M., Fouke, B. W. Bacterial communities inhabiting the healthy tissues of two Caribbean reef corals: interspecific and spatial variation. Coral Reefs. 24, 129-137 (2005).
- Klaus, J., Janse, I., Sandford, R., Fouke, B. W. Coral microbial communities, zooxanthellae, and mucus along gradients of seawater depth and coastal pollution. Environ. Microbiol. 9, 1291-1305 (2007).
- van Duyl, F. C. Atlas of the living reefs of Curacao and Bonaire (Netherlands Antilles). , Diss. Vrije Universiteit. Amsterdam. (1985).
- Carricart-Ganivet, J. P. Sea surface temperature and the growth of the West Atlantic reef building coral Montastraea annularis. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 302, 249-260 (2004).
- Barnes, D. J., Lough, J. M. Coral skeletons: Storage and recovery of environmental information. Global Chang. Biol. 2, 569-582 (1996).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 6, 069591 (2012).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 573-578 (2011).
- Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb. Protoc. 6, 069575 (2012).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Res. C: Embryo Today: Rev. 72, 213-223 (2004).
- Slyfield, C. R., et al. Three-dimensional surface texture visualization of bone tissue through epifluorescence-based serial block face imaging. J. Microsc. 236, 52-59 (2009).
- Weninger, W., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nat. Genet. 30, 59-65 (2001).
- Weninger, W., Mohun, T. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Reporter Genes. , Humana Press. 35-46 (2007).
- Gerneke, D. A., et al. Surface imaging microscopy using an ultramiller for large volume 3D reconstruction of wax-and resin-embedded tissues. Microsc. Res. Tech. 70, 886-894 (2007).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Salih, A., Larkum, A., Cox, G., Kühl, M., Hoegh-Guldberg, O. Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature. 408, 850-853 (2000).
- Sivaguru, M., Mander, L., Fried, G., Punyasena, S. W. Capturing the surface texture and shape of pollen: A comparison of microscopy techniques. PloS one. 7 (6), (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat. Methods. 2, 932-940 (2005).
