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Environment

Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux

doi: 10.3791/51824 Published: September 5, 2014

Summary

Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer polype morphologie et la structure des tissus dans le coraux des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Fluorescence, le visage de bloc série, et à deux photons laser microscopie confocale à balayage ont identifié la structure lobée, murs de polype, et chromatophores estimée et la densité de zooxanthelles et des distributions.

Abstract

Une suite intégrée de techniques d'imagerie a été appliquée pour déterminer le (3D) morphologie tridimensionnelle et la structure cellulaire des tissus des polypes comprenant l'coraux constructeurs de récifs des Caraïbes Montastraea annularis et M. faveolata. Ces approches comprennent la microscopie à fluorescence (FM), le bloc de série visage imagerie (SBFI), et à deux photons laser microscopie confocale à balayage (TPLSM). SBFI fournit des images des tissus profonds après sectionnement physique; Il détaille la texture de surface de tissu et visualisation 3D pour des profondeurs du tissu de plus de 2 mm. FM complémentaire et de rendement de TPLSM images de très haute résolution de la structure cellulaire des tissus. Les résultats ont: (1) identifier les morphologies de tissus lobés non signalés précédemment sur ​​la paroi extérieure de polypes coralliens individuels et (2) a créé les premières cartes de la surface de la densité de la distribution et du tissu 3D de chromatophores et endosymbiontes dinoflagellés zooxanthelles algues comme. Pois d'absorption spectraleks de 500 nm et 675 nm, respectivement, indiquent que M. annularis et M. faveolata contient types de chlorophylle et de chromatophores similaires. Toutefois, M. annularis et M. faveolata présentent des différences significatives dans la densité et la distribution de tissu 3D de ces composants cellulaires essentiels. Cette étude portant sur les méthodes d'imagerie indique que SBFI est extrêmement utile pour l'analyse de grands échantillons mm échelle de tissus coralliens décalcifier. FM gratuit et TPLSM révèlent de subtiles changements d'échelle submillimétrique de la distribution et de la densité cellulaire dans des échantillons de tissus de corail nondecalcified. La technique permet de TPLSM: (1) préparation de l'échantillon à effraction minimale, (2) de capacité supérieure sectionnement optique, et (3) l'absorption de la lumière et de diffusion minimale, tout en permettant l'imagerie des tissus profonds.

Introduction

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Le réchauffement climatique et les changements environnementaux accompagnement affectent directement la santé et la distribution des coraux marins tropicaux 1-4. Impacts multiples sont observés, y compris le blanchiment des coraux et l'émergence de maladies infectieuses 5-6. Toutefois, une prévision plus précise de la future réponse de corail à ces menaces environnementales, il faudra qu'une "ligne de base" histologique être établi, qui définit la morphologie des tissus et de la composition de la cellule et de la distribution pour les coraux "apparemment en bonne santé". À son tour, "touchés" coraux peuvent alors être comparés quantitativement. En outre, cette référence devrait être établi pour les coraux apparemment en bonne santé dans une variété de conditions environnementales, de sorte que «réaction saine» peut également être évaluée à travers des gradients environnementaux. Comme un premier pas vers l'établissement de cette base, une étude 3D à haute résolution a été réalisée de façon apparemment tissu polype corallienmorphologie et la composition cellulaire répond à l'augmentation de la profondeur de l'eau (WD) et des baisses d'accompagnement dans la lumière du soleil irradiance. Les résultats peuvent ensuite être utilisées pour établir une compréhension mécaniste plus complet de corail adaptation, ainsi que de mieux comprendre l'évolution de corail symbiote et l'amélioration de la récolte de la lumière.

Coraux durs (Scleractinia) sont coloniales animaux marins invertébrés qui accueillent un assemblage complexe d'autres microorganismes, appelés collectivement le corail holobiont 7-10. Les recherches menées dans la présente étude cherche à utiliser une suite de technologies d'imagerie de pointe pour suivre simultanément des changements avec l'augmentation de la profondeur de l'eau dans les pigments de tissus et de zooxanthelles symbiotiques des coraux d'accueil apparemment en bonne santé. Ceci permettra d'établir le tissu cellulaire comparative "de base" nécessaire dans un gradient bathymétrique des coraux apparemment en bonne santé et agissent comme des indicateurs de corail heaLTH 10. pigments coralliens, appelées chromatophores, agissent pour absorber, de réfléchir, la diffusion, la réfraction, la diffraction, ou interférer avec le rayonnement solaire incident 11. La relation endosymbiotique zooxanthelles-chromatophores a permis la coévolution de l'optimisation lumière de récolte stratégique avantageuse et des stratégies de croissance du squelette, ainsi que la plasticité trophique (stratégies d'alimentation déplacement de va-et-vient de autotrophie à Hétérotrophie) pour l'animal corail 12.

Les Caraïbes île nation sud de Curaçao (anciennement partie des Antilles néerlandaises) se trouve à environ 65 km au nord du Venezuela au sein de l'orientation est-ouest Aruba-La Blanquilla archipel (figure 1A). Le 70 km côte sud de Curaçao contient un ancien récif corallien frangeant partie continue moderne et Miocène-Pliocène-Pléistocène-Holocène 13,14. SST moyenne annuelle sur Curaçao varie d'environ 3 ° C unenuellement, allant d'un minimum de 26 ° C à la fin de Janvier jusqu'à un maximum de 29 ° C au début de Septembre, avec une température annuelle moyenne de 27,5 ± 0,5 ° C (NOAA SST ensembles de données, 2000-2010). Le récif de corail à Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), située près de la pointe nord-ouest de Curaçao (figure 1A), a été choisi pour l'échantillonnage, car il a déjà été bien étudiée et la écosystème marin à cet endroit est baigné dans l'eau de mer non polluée frais 7,15-19. . Deux espèces de coraux scléractiniens étroitement liées, M. annularis et M faveolata, ont été choisis pour l'expérimentation et l'analyse dans cette étude parce que chaque espèce: (1) des expositions très différentes et ne se chevauchent pas distributions bathymétriques sur les voies de récif par rapport à la limite du plateau continental et la milieux sédimentaires carbonate sédimentaires associés (M. gamme annularis = 0-10 m WD, M. faveolatagamme = 10-20 m WD 20; figures 1B, 2A, et 2B); (2) est un corail cadre commun de récif constructeur tout au long de la mer des Caraïbes 21; et (3) est bien étudiée écologique, physiologique, et les relations d'évolution 22.

échantillonnage sur le terrain pour la présente étude a été réalisée en utilisant des techniques de plongée sous-marine au large de standards Playa Kalki à Curaçao. Un bathymétrique de l'eau peu profonde transect à profonde a été établi que traversait le plateau, sur le rebord du plateau, et dans les environnements récifaux antérieures en eau profonde. Apparemment, têtes de corail en bonne santé ont ensuite été identifiés pour l'échantillonnage le long de ce transect bathymétrique, y compris: (1) trois individuel ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. annularis, qui étaient tous à 5 m de profondeur d'eau (WD); et (2) trois individuels ~ 1 m de diamètre patates de corail de M. faveolata, qui étaient tous à 12 m WD. Rayonnement photosynthétiquement actif (PAR) a été mesurée comme 33-36% PAR à 5 m WD et 18-22% PAR à 10 m WD. L'échantillonnage a été effectué en Janvier lorsque la SST était de 26 ° C à des profondeurs d'eau de la 5 m et 12 m. Chacun de ces six têtes de corail a été échantillonné en triple exemplaire à des positions spatiales équivalentes (c'est à dire., Environ 45 ° de latitude nord sur chacune des six têtes de corail hémisphériques). Chaque échantillon se composait d'un diamètre de 2,5 cm corail biopsie de tissu-squelette qui a été recueilli avec un coup de poing de la voûte nettoyé. Trois biopsies de tissus-squelette de corail ont été échantillonnés sur la plongée sous-type avec des mains gantées de chacune des têtes de corail (9 de M. annularis colonies à 5 m WD et 9 de M. faveolata à 12 m WD). Immédiatement après la collecte de profondeur, chacune des carottes de biopsie a été placé dans un tube de polypropylene de 50 ml à centrifuger stérile, étanche vis-haut, et est retourné à la surface. L'eau de mer a été décantée à partir de chaque tube de centrifugeuse et chaque biopsie au trocart est ensuite immergé, stocké et transporté dans 4% de paraformaldéhyde.

23-30. La plupart de ces études utilisées microscopie optique / lumière soit avec fluorescence ou technique sur le terrain vives. Cependant, des études ont été menées à ultra-forts grossissements utilisant électronique à balayage bloc série visage imagerie dans le passé 31. Dans la présente étude, un protocole de SBFI modifié a été mis au point pour les coraux et appliqué pour la première fois. Parce que M. annularis et M. polypes coralliens faveolata sont 1-2 mm d'épaisseur, aucune des techniques de microscopie optique de routine serait capable de pénétrer toute l'épaisseur du tissu corail de polypes. Par conséquent, nous avons SBFI protocole de préparation des échantillons spécialement conçu pour les échantillons de corail. En outre, nous avons conçu sur mesure un porte-stéréoscopique, Qui est motorisé pour se déplacer dans les deux directions x et y. Cet appareil prend des images de la face du bloc de l'échantillon plutôt que de recueillir les sections à l'aide d'un microtome régulier devant le microscope. Nous avons également introduit une autre à deux photons technique de microscopie optique non linéaire à l'image les mêmes polypes coralliens dans toute l'épaisseur des tissus coralliens. Cette surmonte les limitations imposées par SBFI en termes de décalcification et la possibilité de changements dans la morphologie des tissus et le volume (rétrécissement) pouvant être induites par la préparation des échantillons (déshydratation) et les protocoles de traitement. En outre, les profils d'émission des coraux ont été résolues spectralement à identifier leurs émissions de pointe et les variations entre les chromatophores et les zooxanthelles photosynthétique. Ces résultats ont été évalués dans le contexte de la méthode utilisée et leurs avantages particuliers en ce qui concerne le temps d'acquisition, le temps d'analyse, et la capacité de résoudre des détails fins structurelles sans compromettre la strintégrité uctural du tissu corail.

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Protocol

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NOTE: Réactifs pour être préparés pour Serial Block Face imagerie des échantillons de corail

1. Preinfiltration Cire

  1. Faire fondre 3,6 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre. Mélangez bien sur une plaque chaude (60-70 ° C).
  2. Ajouter 400 mg de Soudan IV (pour minimiser la cire fond fluorescence). Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint.
  3. Ajouter 96 ml de la paraffine fondue chaude (100%) et bien mélanger.

1.2) Embedding Cire

  1. Faire fondre 7,2 g de flocons STÉARINE dans un récipient en verre et bien mélanger sur une plaque chaude (60-70 ° C).
  2. Ajouter 0,8 g du Soudan IV. Bien mélanger et attendre une solution translucide rouge est atteint.
  3. Ajouter granulés de paraffine (162 g) et mélanger jusqu'à ce que la paraffine fond complètement.
  4. Ajouter 30 g de blanc granulaire Vybar et fondre complètement dans le même bécher; Une fois fondu, mélanger.
  5. Fermer sans serrer la bouteille en verre avec un couvercle. Placer le flacon en verre à 60 ° C une convection ovfr pour garder les ingrédients dans un état liquide. Effectuer toutes les infiltrations dans ce four.
  6. Diviser le volume total de 200 ml de la cire rouge dans deux flacons en verre de 100 ml chacune. Utilisez une aliquote pour l'infiltration et l'autre pour l'incorporation finale.

1.3) incorporation Coral tissus pour Serial Block Face Imaging

  1. Laver les polypes coralliens recueillies sur le terrain (SI vidéo 1) et stockées (3-6 mois à 4-5 ° C dans du paraformaldéhyde) dans un tampon phosphate salin (3x 5 min) et détartrer lorsque vous êtes prêt à imager. Détartrer les polypes en solution Excal pendant 24 heures ou jusqu'à ce que les polypes sont totalement dépourvus de CaCO3. Incuber plusieurs polypes coralliens décalcifié comme un seul bloc dans une série 25, 50, 75, et 100% d'éthanol, suivie d'un substitut de xylène 1x à déshydrater les échantillons.
  2. Placez les polypes transformés dans un four préchauffé à 65 ° C four contenant 100% de substitut de xylène. Incuber pendant 30 min à deux reprises par Changing de solution fraîche. Orienter les polypes de telle manière que la partie supérieure des polypes orientée vers le bas et la surface supérieure est aussi plat que possible.
  3. Faire des solutions de 2: 1, 1: 1, et 1: 2 substitut de xylène et preinfiltration cire (étape 1.1) dans 50 ml tubes Falcon.
  4. Incuber polypes de corail avec ces trois concentrations croissantes de cire de preinfiltration, suivis par 3x incubation dans 100% de cire de preinfiltration pendant 30-60 minutes à chaque fois.
  5. Remarque: Selon l'épaisseur des échantillons, étapes 1.3.1-1.3.5 pourrait être augmenté avec de plus longues périodes.
  6. Déplacez les échantillons à l'intégration de la cire (voir l'étape 1.2.6) après incubation en 3x 100% cire de preinfiltration.
  7. Retirer la cire intégration après 30 min. Remplacer avec de la cire d'enrobage frais et continuer incubation pour un minimum de 4 heures à 65 ° C.

1.4) L'intégration dans Red Wax

  1. Photographier le bloc (la plaque en acier inoxydable où la cire blanche et est placé au-dessus de laquelle le sample est placé). Ceci est nécessaire parce que, une fois incorporé dans la cire, l'emplacement de l'échantillon devient invisible comme l'enrobage de cire rouge est opaque.
  2. Placez de petites gouttes de haut point de fusion de la cire autour de la nouvelle intégration moule en acier inoxydable préchauffé et laissez-le refroidir. Verser une petite quantité de cire fondue à partir de l'incorporation fraîchement second récipient comme indiqué à l'étape 1.2.6.
  3. Placez le polype vers le bas rapidement sur la cire point blanc, puis placez un porte-échantillon en plastique sur la plaque en acier inoxydable et verser de la cire plus plongement de sorte que la cire remonte à la surface du moule en plastique.
  4. Prenez toute la configuration de 65 ° C du four et laisser refroidir sur un banc ou une surface froide jusqu'à ce que la cire durcit complètement.
  5. Cela peut prendre 6 heures jusqu'au jour ou deux. Placez le bloc desséché dans un réfrigérateur à 4 ° C, à l'abri de la lumière, pour le stockage à long terme.

1.5) de sectionnement à la configuration Block Face série

  1. Trim le bloc et couper 1 um sections à l'aide d'un microtome. Ne pas recueillir les sections car elles deviendront comme de la poudre. Rappelez-vous, nous sommes imagerie que la face du bloc. L'échantillon apparaît lorsque la cire blanche commence à disparaître.
  2. Capturer des images de la face lisse du bloc qui contient l'échantillon chaque fois qu'un article est retiré. Continuez jusqu'à ce que le polype disparaît en SI Vidéo 2.
  3. Record / capture les images avec une caméra monochrome en utilisant un filtre fluorescent FITC pour ramasser l'auto-fluorescence de la chromatophores / corail polype. Image 3-4 noyaux décalcification de chaque espèce.

2. imagerie coraux de moins de deux photons microscopie de fluorescence

  1. Fixer des noyaux de polypes coralliens, contenant chacune environ 10-12 polypes environ un pouce de diamètre, à 4% de paraformaldéhyde sur le site de collecte (rivage) dès qu'ils sont récoltés sous l'eau.
  2. Conserver les échantillons à 4 ° C jusqu'à ce que l'imagerie. Noyaux lavés sont placés dans ee même solution à l'envers dans un plat à fond de verre de couverture (0,17 mm d'épaisseur).
  3. L'utilisation d'un laser à deux photons à 780 nm excitation, l'image 3-4 polypes à deux agrandissements différents (zoom numérique) en utilisant un (NA 0,3) objectif 10X. La forme de polype et la hauteur varie entre les échantillons (généralement 1-2 mm) et la profondeur d'imagerie est également limité par la distance de travail de l'objectif d'imagerie.
  4. Utilisez le mode de balayage de tuile de recueillir environ 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 carreaux) images par plan focal en xy et 50-100 des images par le biais de l'axe z à intervalle de 10 ou 20 um, totalisant environ 5.000-10.000 images / polype.
  5. Image en trois quatre zones de polypes pour représenter un noyau et des espèces coralliennes. NOTE: Image temps d'acquisition varie entre 2-5 h / zone de polype.
  6. Stocker toutes les images de format de données brutes dans le disque dur du système LSM 5 Rendu 3D d'une analyse d'images 3D et de rendu logiciel.

3. rendu 3D du volume et Visualization de SBFI et à deux photons de fluorescence spectrale des données

  1. Recadrer les données 2D afin de réduire la taille du fichier en se concentrant sur un seul polype en utilisant l'outil de recadrage carré dans le programme et le compiler comme un seul fichier TIFF (réduire la taille du fichier aussi en enregistrant le fichier au format 8 bits) dans le logiciel d'acquisition.
  2. Ouvrez les fichiers assemblés des données de SBFI (collectés à l'étape 1.5.1) ou les multiples z piles de tuiles de sections optiques de deux photons (collectés à l'étape 2.1.4) dans le programme Imaris Surpass module sous algorithme de volume.
  3. Projeter les données de SBFI rendus en 3D en utilisant une projection de l'ombre. Créer un mode isosurface où les voxels sont seuillés pour créer un motif de surface solide (SI Vidéo 3).
  4. Visualisez les projections en 3D en utilisant un algorithme coupure de plan à xy, xz et yz modes orthogonaux pour révéler la structure 3D et la forme des coraux.
  5. Animer les projections utilisant un module clé d'animation de trame dans le même programme de Imaris (SI Videos 3-7).
  6. Générer des fichiers vidéo à 5% de compression et de générer un clips en format avi en utilisant un volume (SI Vidéos 4 et 6), 3D et Isosurface modalités (SI Vidéos 5 et 7).

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Representative Results

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Un appareil de SBFI conçu sur mesure (fabriqués spécifiquement pour la présente étude; Figure 3) a produit les premières cartes détaillées 3D numériques d'élévation (MNE) de la texture de la surface extérieure et la morphologie de la M. annularis et M. polypes coralliens faveolature (figure 4 et SI Vidéos 1-2). Cela a donné des images de lobes empilés jusqu'alors inconnus de tissus de corail concentrique rayonner à l'extérieur du centre de chaque polype (figures 4B, 4D et 4E). Ces lobes sont empilés le long de la crête la plus élevée de cloisons squelettique primaire et secondaire tissu-couverte, avec les lobes radialement à l'extérieur et les plus basses altitude finalement la synthèse et la fusion avec les tissus coenosarc entre polypes. La forme de polype 3D et les lobes associés ont été bien conservés malgré l'échantillon de tissu corail avoir passé par plusieurs étapes d'infiltration à haute température et l'incorporation. Le supplén de colorant Soudan masqué avec succès comme le fond opaque, avec la couleur noire ayant contribué à maximiser le contraste de chaque échantillon et augmenter le rapport signal-sur-bruit. 3D et vues orthogonales planes montrent la distribution des composants fluorescents le long de l'axe z (figure 4B). Il y avait des avions avec des flocons de cire que parfois obscurcies polype détails de la surface, qui ont été retirés pour plus de clarté lors de la création projections. L'avantage majeur de cette technique est de révéler des détails internes d'un échantillon d'épaisseur, ce qui élimine la nécessité de prendre des sections multiples et de les aligner à un moment ultérieur. En outre, les images de cette technique sont déjà alignés lorsque collecté (figure 4A), offrant une résolution de az allant jusqu'à 1 um à partir d'une taille de jusqu'à 10 mm ou plus l'échantillon (en fonction de la distance d'entraînement totale du support de sabot dans le microtome ). Il est possible de distinguer les composants auto-fluorescence différents (en utilisant des filtres multiples) ainsi que individuzooxanthelles à plus fort grossissement, à condition que le champ réduit de vue est acceptable.

Le ApoTome sectionnement optique microscope à fluorescence a révélé la distribution des cellules de corail de tissus (zooxanthelles et chromatophores) et la structure des tissus de surface avec une résolution inférieure au millimètre. Par conséquent, le diamètre de 6-13 um zooxanthellae peut être facilement reconnu et quantifié par rapport au nombre de cellules par volume de tissu (Figure 5). L'acquisition d'image à deux canaux en utilisant la fluorescence de la chlorophylle (vert) et le mucus marqué avec WGB Alexa 647 (en rouge), qui fonctionne le mieux pour quantifier le niveau de mucus et le nombre de zooxanthelles dans un endroit donné du polype (majeur et mineur cloisons de polype peut être calculé indépendamment).

En plus de ces approches de microscope, on a également appliqué TPLSM, une technique non linéaire largement utilisé pour des échantillons biologiques d'épaisseur. Les principaux avantages de plus sur TPLSMe photons lasers à onde continue sont les suivantes: (1) excitation se produit uniquement au niveau du point de mise au point, car la puissance de l'intensité de la lumière d'excitation devient carré et la probabilité d'une molécule à absorber deux photons successifs pour exciter un électron à partir du fluorophore est limité à la profondeur de champ de l'objectif, ce qui permet un confocalité inhérente. et (2) en conséquence il n'y aura pas de perte d'un photon d'excitation tout en pénétrant plus profondément dans l'échantillon, par opposition aux lasers à photons uniques. En outre, la plupart des échantillons de tissus biologiques absorbent également la lumière visible. Comme l'excitation à deux photons est intrinsèquement longue (dans le proche infrarouge à 780 nm), l'absorption est également sensiblement réduit. D'autre part, le squelette de corail composées de carbonate de calcium absorbe à peine ou disperse la lumière à deux photons. Enfin, puisque nous étions intéressés à déterminer la répartition des objets uniquement sur la surface profilée du squelette de corail, nous avons trouvé l'imagerie profonde utilisation de cette modalité very adapté pour l'imagerie de corail.

Nous avons tenté de caractériser les signatures spectrales disponibles dans M. Annularis (figures 6-9). Nous montrons ici que dans le cadre du 780 nm excitation à deux photons, l'auto-fluorescence chromatophores a un pic autour de 500 nm, alors que la fluorescence de la chlorophylle de zooxanthelles est centrée à environ 675 nm (Figure 6). Alors que unmixing de ces données spectrales (figures 6-7) est également possible avec un algorithme de déconvolution dans le logiciel (Figure 8), car il ya une distance spectrale claire entre les deux composants, les imager simultanément en utilisant deux détecteurs à deux bandes d'émission prouvées être le plus technique de gain de temps. Cela est particulièrement vrai lorsque l'échantillon est carrelé et imagé sur toute une profondeur de 1-2 mm de tissu. Ceci élimine la nécessité pour le sectionnement physique, ce qui nécessite plusieurs milliers d'images par emplacement et de l'échantillon et des polypes. La répartition o chromatophores auto-fluorescent f est aussi distincte (figure 9) entre les deux espèces de coraux testés. Dans un cas, nous avons observé une augmentation significative de chromatophores dans l'eau peu profonde habitation corail M. annularis rapport à l'eau plus profonde M. faveolata (Figure 9 et SI Vidéos 3 et 4).

Figure 1
Figure 1: (A) Carte de Curaçao dans la mer des Caraïbes du sud, montrant l'emplacement du site d'étude à Playa Kalki sur la côte sous le vent extrême nord-ouest de l'île. (B) en coupe schématique du plateau récifal cerclées à Playa Kalki à Curaçao, montrant les distributions de profondeur d'eau de M. annularis et M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / 51824fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2 (A) in situ photo de terrain sous-marin à 12 m WD de M. faveolata à Playa Kalki, Curaçao. (B) Gros plan agrandissement de l'image dans (A) montrant les polypes coralliens individuels de M. faveolata dans des conditions d'éclairage le jour (chaque polype est d'environ 2 mm de diamètre, dont certains sont rétractés, marqués d'un *). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3 La série d'îlot instrumentation d'imagerie. (A et B) le support de microscope personnalisé conçu, maintient le microscope Stereolumar à 180 ° en regard de la face du bloc de l'échantillon placé dans le microtome. Lorsque chaque section a été supprimée, l'image du visage de bloc a été capturé par l'objectif et les données 2D a été numériquement stocké. Ceci a été réalisé jusqu'à ce que l'échantillon a disparu dans le bloc. Le microscope est déplacé dans la direction x et y en utilisant une tige filetée motorisé et z, l'ajustement est fait pour concentrer l'échantillon. Il est important de noter que lorsque chaque 1 um échantillon est sectionné, le bloc se déplace 1 um à terme, afin de recentrer la portée n'est pas nécessaire. XYMOT, personnalisé construit platine motorisée xy translationnelle; FLS, source de lumière de fluorescence; MT, microtome; MIC, Stéréomicroscope; CAM, Axiocam caméra monochrome; BH, bloc titulaire; BF, Bloc visage del'échantillon; FLL, Fluorescent spot d'excitation sur la face du bloc; OBJ, objectif de microscope; HIP, panneau d'interface humaine. Une image à la dimension de 1388 x 1040 pixels horizontaux verticaux en mode monochrome a été recueilli à un pixel xy (unique) résolution de 1,25 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 bloc de série visage imagerie des coraux M. annularis et M. faveolata recueillies auprès de Playa Kalki, Curaçao. données (A) de l'ensemble d'échantillons galerie montrant environ 800 images d'images 2D individuels obtenus à partir d'un polype à 1 um résolution en z. (B) Dans un autre échantillon de corail, le sectionnement est allé bien au-delà de 2,000 um à z. L'image montre plusieurs polypes et la compilation de toutes les tranches 2D pour un volume 3D sous projection de l'ombre en utilisant l'algorithme de visualisation de volume Imaris. Projection (C) Orthogonal montrant une vue xz de l'échantillon (B), on peut voir toute la profondeur de l'échantillon de plus de 2 mm et les flèches indiquent les lignes noires où les tranches 2D ont été retirés en raison de la mauvaise qualité; cette image est de M. annularis. Volume 3D (D), le rendu isosurface (E) et la visualisation des données de SbA. (D) des polypes de corail multiples montrant la morphologie des polypes en coupe longitudinale sur le côté et le volume 3D (projection d'ombre) d'un seul polype dans le milieu. Sectionnement et la visualisation à n'importe quel angle est possible en 3D (voir SI vidéo). E. Comme voxels sont floues en 3D (D), la surface rendue isosurface 3D montre le contour de la surface des polypes de corail et leur contexteaccord avec les polypes adjacents (voir SI vidéo). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5 microscopie de fluorescence des polypes de corail. (A) de la section transversale d'un polype décalcifiée de M. faveolata présentant zooxanthelles à la chlorophylle autofluorescence sous une lumière bleue (en vert) et des poches muqueuses marqués avec le germe de blé agglutinine (en rouge) en image sous la lumière rouge. L'image est automatiquement carrelée en deux canaux et cousu et aligné à l'aide du logiciel de l'appareil. (B) L'élargissement de la zone indiquée en (A), montrant zooxanthelles individuelle (chacun des cercles verts, environ 6-8 m de diamètre en vert) et la couche de mucus de surface (rouge), et la fusion des deux canaux. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
La figure 6 deux photons caractérisation spectrale de fluorescence de coraux. Utilisation du détecteur spectral du système LSM 710, des signaux de fluorescence de l'ensemble du spectre visible (419-722 nm) a été analysé sur une profondeur d'environ 190 um. L'image montre l'intervalle de profondeur à 5 um dans l'axe x de la pile z et l'axe y est la longueur d'onde de 419 à 722 nm acquis à intervalle de 10 nm (au total près de 1154 images ont montré). On peut voir les deux composantes spectrales, l'un centré à 500 nm et la seconde à 650 nm. Une exci laser à deux photonsmise en longueur d'onde de 780 nm a été utilisée pour obtenir des profils d'émission. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Caractérisation des deux composantes spectrales. (A) le profil spectral du fond (bleue), auto-fluorescence à partir de chromatophores (vert) et la fluorescence de la chlorophylle (rouge) est excité par l'excitation à deux photons de longueur d'onde laser de 780 nm laser. Les spectres dérivés représenté sur le côté droit des données spectrales multicolores superposées et pseudo-couleur en fonction du profil d'émission. (B) Les compartiments spectraux individuels où les signaux sont prélevés à intervalles de 10 nm pour obtenir le spectre de l'image et en (A). Remarque que les deux composantes distinctes, l'une centrée à environ 500 nm (chromatophores autofluorescence) et l'autre plus de 675 nm (fluorescence de la chlorophylle). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8: Les mêmes images dans les figures 7A et 7B, les données spectrales non mélangées à l'aide du logiciel et leur pics d'émission correspondant / spectres. Dans les deux M. annularis et M. faveolata, les composantes spectrales sont très semblables, bien que les pics d'émission. La différence importante, cependant, est due à l'emplacement de ces composantes spectrales et de leur abondance (voir figure 9).ghres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 9
Figure 9 à deux photons de fluorescence images 3D de polypes de corail de M. annularis (AD) et M. faveolata (EH). (A et E) ont été imagées sans séparation spectrale des composants en utilisant une excitation à 780 nm du laser à deux photons, avec le signal optique recueilli 450 à 700 nm. (B et F) ont été recueillies avec le même excitation (780 nm), mais deux détecteurs PMT ont été utilisés simultanément pour collecter les données à partir de deux composantes à savoir., Un 500-550 nm (vert-chromatophores autofluorescence) et l'autre de 650 720 nm (rouge-fluorescence de la chlorophylle). (C et G) sont des images de profondeur codé(B et F), le rouge est moins profond et le bleu est composants les plus profondes en 2D. (D et H) sont des images yz de coupe par (B et F), respectivement, montrant la fluorescence vient seulement de la surface du corail et le squelette n'a pas de fluorescence à 780 nm excitation. Notez la différence substantielle de la teneur en chromatophores entre les deux coraux. Le M. habitat annularis (0-10 m DEO) est moins profond que le M. habitat faveolata (10-20 m de DEO). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 10
Figure 10: Les Powers of Ten structure spatiale hiérarchique des études of écosystèmes des récifs coralliens. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure S1
SI Figure coups 1. d'écran montrant les étapes (AI) impliqués dans la création de volume 3D et isosurface rendu de soit les données de SBFI ou la microscopie 2Photon l'aide du logiciel d'analyse d'image (voir tableau des matériaux). (A) les tranches 2D de la première données en mode de coupe montrant un seul plan; (B) de volume 3D de toutes les tranches 2D; (C) l'assistant de création de isosurface avec une région d'intérêt (ROI) sélectionné; (D) un algorithme à une soustraction d'arrière-plan sélectionnée; (E) d'une valeur de seuil appliquée à ramasser les pixels qui reprét les données; (F) les points germes centre de la surface; (G) sur la base d'un filtre de volume est appliqué pour éliminer les débris de volume plus faible et le bruit; (H) la 3D finale isosurface rendu; (I) de l'assistant clé d'animation de cadre pour créer les films comme dans les vidéos SI. Les images définitifs sont présentés dans les deux volumes et isosurfaces modalités dans les Vidéos SI 3-7. Le protocole couvre les étapes 3.1.3-3.1.5 ces procédures. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Matériel / Equipement Entreprise Catalogue / Numéro de modèle Commentaires / Description
Tissu Coral Squelette Aucun Aucun 2,5 cm BIOPsy de l'habitat naturel
Arche de perforation carottage périphérique CS Osborne et Société N ° 149 Pour la collecte de biopsie Coral
Paraformaldéhyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% de pré-dilué
Histoclear / Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Autre non-toxique pour les Xylène, déshydratation et Deparafinization
Xylène et l'éthanol Fisher Scientific Fisher Scientific Déshydration
Paraffine Richard Allen scientifique Type H REF 8338 solution d'infiltration
Vybar Le fabricant de bougie Aucun Composant de cire rouge
Stéarine Le fabricant de bougie Aucun Composant de cire rouge
Soudan IV Fisher Chemical S667-25 Fond rouge cire Opaque
Germe de blé agglutinine (WGA) Life Technologies W32466 Pour le marquage Coral mucus
Prolonger or Life Technologies P36095 Anti-fade milieu de montage
Fluoro-vaisselle World Precision Instruments FD-35-100 Pour l'imagerie à deux photons
XY moteur, le pilote et le contrôleur Lin génie 211-13-01R0, R325, R256-RO Mouvement de translation XY
Plaque chauffante Corning DC-220 Melting toute trace de cire
Four à convection Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Processeur de tissus Leica ASP 300
Microtome Leica RM2055 Couteaux jetables
Microscope stéréo Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objectif
Microscope à fluorescence avec ApoTome Carl Zeiss Axiovert 200 M, ApoTome Système I Imagerie section mince d'un polype: les zooxanthelles
Caméra Axiocam Carl Zeiss MRm caméra monochrome 1388x1040 pixels
Logiciel de Axiovision Carl Zeiss Version 4.8 programme d'acquisition d'image
Deux-Photon Laser Spectraphysics Maitai EHP, laser pulsé (70 fs) Avec le module DeepSee
Microscope à balayage laser Carl Zeiss LSM 710 avec détecteur spectral 34canal de détection PMT
Zen Software Carl Zeiss 2010 ci-dessus ou pour deux photons et d'acquisition d'image spectrale
Imaris Software Suite Bitplane, Inc., Version 7.0 ou supérieure Volume 3D, rendu Iso-surface, Visualisation

Tableau 1: Principaux matériaux, équipements, microscopes et logiciels utilisés dans cette étude.

SI Vidéo 1. In situ vidéo sous-marine sur le terrain montrant l'habitat de corail à 12 m WD de M. faveolata à Playa Kalki, Curaçao.

SI la vidéo 2. individuelle 2D images de visage de bloc série de rendu de l'image en 3D montre la Figure 4E.

SI Vidéo 3. l'image du visage Isosurface rendu 3D de bloc série présentée à la figure 4E et SI vidéo 1 montrant la topographie du polype.

SI vidéo 4. d'image de microscopie de volume 3D rendu données brutes à deux photons du polype corallien M. faveolata. L'excitation est de 780 nm et l'émission captée en même temps à deux largeurs de bande pour zooxanthellae (pseudo-couleur rouge, de 600 à 700 nm) et chromatophores (pseudo-couleur verte, de 500 à 550 nm).

SI Vidéo 5. volume 3D rendu dans Isosurface-taches image de microscopie à deux photons du polype corallien M.faveolata. L'excitation est de 780 nm et l'émission captée en même temps à deux largeurs de bande pour zooxanthellae (pseudo-couleur rouge, de 600 à 700 nm) et chromatophores (pseudo-couleur verte, de 500 à 550 nm).

SI Vidéo 6. d'image de microscopie de volume 3D rendu données brutes à deux photons du polype corallien M. annularis. L'excitation est de 780 nm et l'émission captée en même temps à deux largeurs de bande pour zooxanthellae (pseudo-couleur rouge, de 600 à 700 nm) et chromatophores (pseudo-couleur verte, de 500 à 550 nm).

SI Vidéo 7. Isosurface-Les taches volume 3D rendus image de microscopie à deux photons du polype corallien M. annularis. L'excitation est de 780 nm et l'émission captée en même temps à deux largeurs de bande pour zooxanthellae (psEudes de couleur rouge, 600-700 nm) et chromatophores (pseudo-couleur verte, 500-550 nm).

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Discussion

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Recherche sur les récifs de corail est un effort de recherche hautement interdisciplinaire, comprenant l'analyse de la simultanée physiques, chimiques, et des phénomènes biologiques qui opèrent dans le milieu marin. L'étude des écosystèmes de récifs coralliens complexes est donc préférable terminé dans un "Powers of Ten" cadre contextuel (Figure 10). Cette compilation graphique montre que l'écosystème corallien couvre un large éventail de dimensions spatiales (10 -9 à 10 5 m). En outre, cet exercice montre que géobiologique analyse à une échelle de longueur intermédiaire de 1 mm à 1 cm sont le pont nécessaire de combiner le terrain et des analyses de laboratoire. Ce Powers of Ten cadre est le contexte pour les expériences, les analyses, la modélisation et la synthèse de la physique, de la chimie, et les paramètres biologiques qui contrôlent Curaçao écosystèmes de récifs coralliens.

La présente étude est la première à appliquer le joint de suite entièrement intégréef FM, SBFI et techniques CLSM pour suivre la réponse de coraux apparemment en bonne santé à l'augmentation de la profondeur de l'eau. Outils de microscopie optique disponibles à l'image tout le tissu ou des échantillons biologiques épais ont été limités en raison d'une variété de contraintes optiques posés par les échantillons eux-mêmes, qui comprennent l'absorption, la diffusion, et d'autres phénomènes. En l'espace de la dernière décennie, la microscopie électronique à balayage a été utilisée à SBFI résolution ultra-élevée 31 ainsi que l'imagerie microscopique en utilisant la lumière sur l'ensemble du champ de formation d'image sur la base SBFI plusieurs échantillons biologiques. Cela a inclus des analyses de tout à partir du cerveau vers les tissus cardiaques entiers et même des échantillons contenant des os qui ont été rectifié, poli, étiquetés, et imagée en même temps après chaque section a été faite 23-29. Récemment, la microscopie confocale de fluorescence et ont été utilisés pour révéler les contours, la forme et la distribution de protéines et de pigments dans des échantillons biologiques 32-33. Cependant, la structure 3D des différents polypes coralliens had pas encore été résolu. La condition préalable pour SBFI avec des échantillons de corail est décalcification, comme le carbonate de calcium doit être enlevé avant le rendu des échantillons qui se prêtent à l'infiltration et la coupe à l'aide d'un microtome ordinaire.

C'est là que deux photons de fluorescence au microscope devient indispensable pour l'analyse de tissus biologiques en raison de ses propres phénomènes d'excitation à deux photons. Cela a conduit à longue profondeur de pénétration 33-34 des tissus coralliens dans la présente étude, où l'étape de décalcification a effectivement été éliminé à cause du non-linéaire excitation à deux photons phénomènes 34. En outre, le module de pré-compensation avec le laser à deux photons prévu beaucoup plus courte largeur d'impulsion, ce qui améliore en outre la profondeur de pénétration. Du côté de l'échantillon, puisque le carbonate de calcium n'absorbe pas la lumière dans le proche infrarouge à 780 nm, la profondeur de pénétration est limitée généralement par la distance de travail de l'objectif. Encore un autre inconvénient of décalcification et la suppression de squelette de corail est la perte de l'intégrité structurelle du tissu corallien, ce qui rend les estimations de volume des tissus encore plus difficile après que l'échantillon a traversé plusieurs déshydratation et réhydratation étapes et l'intégration dans la cire sans eau. Ceci souligne l'importance de déterminer les volumes de tissus coralliens avant et après le traitement.

La caractérisation confocale de protéines fluorescentes de corail a été complété pour les coraux Grande barrière de corail et les propriétés spectrales de protection ont été corrélées avec la profondeur de l'habitat des coraux 32. Cependant, dans la présente étude, nous avons démontré pour la première fois en utilisant un microscope à deux photons qu'il existe une réduction substantielle des chromatophores partout dans le corail d'eau profonde dans les tissus à l'exception de la bouche. En outre, les changements distincts dans la distribution des zooxanthelles par rapport aux chromatophores a été observée dans les transects de profondeur dans M. annularis, where les tissus coralliens en eau peu profonde sont complètement recouverts de chromatophores. Avec la résolution prévue par l'imagerie à fort grossissement (figures 8C et 8D), nous pouvons maintenant quantifier avec précision la superficie et le volume occupé par les zooxanthelles, et leurs ratios de densité de tissu peut être déterminée par rapport à d'autres composants cellulaires. Pris ensemble, l'intégration des SBFI et fluorescence à deux photons imagerie spectrale dans la présente étude ont donné de nouvelles idées d'une importance vitale dans la morphologie et la structure des tissus coralliens. Ces données aideront à quantifier les différents composants du tissu corallien, soit au niveau de polype individuel ou au niveau contextuel de interaction entre polypes coloniaux sur une tête de corail entier. Ce contexte va maintenant permettre la réponse adaptative de la holobiont corail à des changements dans la profondeur de l'eau de niveau de la mer et l'irradiance à quantitative suivi et prédit.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coral Tissue Skeleton 2.5 cm Biopsy from natural habitat
Arch Punch Coring Device C.S. Osborne and Company No. 149 For Coral biopsy collection
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences RT 15700 16% Pre-diluted
Histoclear/Safeclear II Electron Microscopy Sciences RT 64111-04 Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization
Xylene and Ethanol Fisher Scientific Dehydration
Paraffin Wax Richard Allen Scientific Type H REF 8338 Infiltration solution
Vybar The Candle Maker Component of Red Wax
Stearin The Candle Maker Component of Red Wax
Sudan IV Fisher Chemical S667-25 Red Wax-Opaque background
Wheat Germ Agglutinin (WGA) Life Technologies W32466 For labeling  Coral Mucus
Prolong Gold Life Technologies P36095 Anti-fade mounting media
Fluoro Dish World Precision Instruments FD-35-100 For two-photon imaging
XY Motor, Driver and Controller Lin Engineering 211-13-01R0, R325, R256-RO XY Translational Movement
Hot Plate Corning DC-220 Melting all wax
Convection Oven Yamato DX-600 Infiltration and Embedding
Tissue Processor Leica ASP 300 Dehydration, Infiltration
Microtome Leica RM2055 Disposable knifes
Stereo Microscope Carl Zeiss Stereolumar V 12 1.5x (30 mm WD) Objective
Fluorescence Microscope with ApoTome Carl Zeiss Axiovert M 200, ApoTome I System Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae
Axiocam camera Carl Zeiss MRm Monochrome camera 1388x1040 pixels
Axiovision Software Carl Zeiss Version 4.8 Image acquisition program
Two-Photon Laser Spectraphysics Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) With DeepSee module
Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM 710 with Spectral Detector 34 channel PMT detection
Zen Software Carl Zeiss 2010 or above for two-photon and spectral image acquisition
Imaris Suite Software Bitplane, Inc., Version 7.0 or above 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization

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References

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Multimodales méthodes optiques Microscopie Reveal Polyp tissus Morphologie et structure dans Caribbean Reef construction Coraux
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Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).More

Sivaguru, M., Fried, G. A., Miller, C. A. H., Fouke, B. W. Multimodal Optical Microscopy Methods Reveal Polyp Tissue Morphology and Structure in Caribbean Reef Building Corals. J. Vis. Exp. (91), e51824, doi:10.3791/51824 (2014).

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