Summary
Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia do pólipo e estrutura do tecido no corais do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Fluorescência, rosto bloco de série, e microscopia de varredura a laser confocal de dois fótons identificaram estrutura lobate, paredes de pólipos, e chromatophore estimado e densidades zooxanthellae e distribuições.
Abstract
Um conjunto integrado de técnicas de imagem foi aplicada para determinar a morfologia tridimensional (3D) e estrutura celular dos tecidos dos pólipos que compreende os corais construtores de recifes do Caribe Montastraea annularis e M. faveolata. Estas abordagens incluem a microscopia de fluorescência (FM), bloco de série rosto de imagem (SBFI), e microscopia de dois fótons de varredura a laser confocal (TPLSM). SBFI fornece imagens de tecidos profundos após a secção física; detalha o tecido da superfície de textura e visualização 3D em profundidades de tecido de mais de 2 mm. FM Complementar e rendimento TPLSM imagens de resolução ultra-alta de tecido estrutura celular. Os resultados: (1) identificar previamente não declarada morfologias tecido lobulados na parede externa de pólipos de corais individuais e (2) criou os primeiros mapas de superfície da distribuição 3D e tecido densidade de cromatóforos e endossimbiontes dinoflagellate zooxanthellae algas-like. Spectral ervilha absorçãoks de 500 nm e 675 nm, respectivamente, sugerem que M. annularis e M. faveolata conter tipos semelhantes de clorofila e cromatóforos. No entanto, M. annularis e M. faveolata apresentam diferenças significativas na densidade do tecido e 3D distribuição destes componentes celulares principais. Este estudo sobre métodos de imagem indica que SBFI é extremamente útil para a análise de amostras de grandes mm escala de tecidos corais descalcificadas. FM e TPLSM cortesia revelar mudanças de escala submillimeter sutis na distribuição celular e densidade em amostras de tecido coral nondecalcified. A técnica TPLSM proporciona: (1) preparação minimamente invasivo da amostra, (2) capacidade de corte óptico superior, e (3) a absorção de luz e dispersão mínima, enquanto continua a permitir imagiologia dos tecidos profundos.
Introduction
O aquecimento global e as mudanças ambientais que o acompanha estão afetando diretamente a saúde e distribuição de corais marinhos tropicais 1-4. Múltiplos impactos estão sendo observados, incluindo branqueamento de corais e do surgimento de doenças infecciosas 5-6. No entanto, a previsão mais precisa do futuro resposta coral a estas ameaças ambientais, é necessário que a "linha de base" histológico ser estabelecida, que define a morfologia do tecido e composição celular e distribuição de corais "aparentemente saudáveis". Por sua vez, "impactado" corais podem então ser comparados quantitativamente. Além disso, deve ser estabelecido essa linha de base para os corais aparentemente saudáveis sob uma variedade de condições ambientais, de modo que "a resposta saudável" também pode ser medido através de gradientes ambientais. Como passo inicial para estabelecer essa linha de base, um estudo 3D de alta resolução foi realizado de forma aparentemente saudável coral tecido pólipomorfologia e composição celular responde ao aumento da profundidade da água (WD), e diminuição de acompanhamento na luz solar irradiância. Os resultados podem então ser usados para estabelecer um entendimento mecanicista mais abrangente de adaptação coral, bem como para obter insights sobre a evolução coral-simbionte ea melhoria da coleta de luz.
Corais duros (Scleractinia) são animais invertebrados marinhos coloniais que abrigam um complexo conjunto de outros microrganismos, colectivamente referidos como o coral holobiont 7-10. A pesquisa realizada no presente estudo procura usar um conjunto de tecnologias de imagem de última geração para monitorar simultaneamente alterações com o aumento da profundidade da água nos tecidos e pigmentos zooxantelas simbióticas de corais hospedeiros aparentemente saudáveis. Isto irá estabelecer o tecido celular comparativa "linha de base" necessária através de um gradiente batimétrico para corais aparentemente saudáveis e funcionam como indicadores de coral health 10. Pigmentos Coral, chamados cromatóforos, agir no sentido de absorver, refletir, dispersão, refração, difração, ou de outra forma interferir com a radiação solar incidente 11. A relação endosymbiotic zooxantelas-chromatophore permitiu a co-evolução de otimização decolheita estrategicamente vantajoso e estratégias de crescimento do esqueleto, bem como plasticidade trófica (estratégias de alimentação deslocando para trás e para a frente de autotrofia para heterotrofia) para o animal coral 12.
A ilha caribenha de Curaçao sul (que fazia parte das Antilhas Holandesas) fica a cerca de 65 km ao norte da Venezuela dentro da tensão leste-oeste Aruba-La Blanquilla arquipélago (Figura 1A). A costa 70 quilômetros de comprimento sul de Curaçao contém um contínuo moderno e Mioceno-Plioceno-Pleistoceno-Holoceno antigo franjas recife de coral trato 13,14. SST média anual em Curaçao varia aproximadamente de 3 ° C anually, variando de um mínimo de 26 ° C no final de janeiro para um máximo de 29 ° C no início de setembro, com uma temperatura média anual de 27,5 ± 0,5 º C (NOAA SST conjuntos de dados, 2000-2010). O recife de coral em Playa Kalki (12 ° 22'31.63 "N, 69 ° 09'29.62" W), encontrando-se perto da ponta noroeste da Curaçao (Figura 1A), foi escolhida por amostragem, porque tem sido previamente bem estudado eo ecossistema marinho neste local é banhado em fresco nonpolluted 7,15-19 água do mar. . Duas espécies de coral escleractíneos intimamente relacionados, M. annularis e M faveolata, foram escolhidos para a experimentação e análise neste estudo, pois cada espécie: (1) as distribuições batimétricas exposições distintas e não sobrepostas sobre o trato recife no que diz respeito à quebra da plataforma e do ambientes de sedimentação de carbonato sedimentares associados (intervalo annularis M. = 0-10 m WD; M. faveolatagama = 10-20 m WD 20; Figuras 1B, 2A, e 2B); (2) é um coral comum construtor quadro recife ao longo do Mar do Caribe 21; e (3) tem bem estudado ecológica, fisiológica e relações evolutivas 22.
Amostragem de campo para o presente estudo foi realizado utilizando técnicas de mergulho com cilindro padrão no mar de Playa Kalki em Curaçao. A batimétrica água rasa transecto-a-fundo foi estabelecido que correu pela prateleira, sobre a quebra da plataforma, e nos ambientes profundos recifes tona de água. Aparentemente corais saudáveis foram identificados por amostragem ao longo do transecto batimétrico, incluindo: (1) três indivíduo ~ 1 m corais diâmetro de M. annularis, todos os quais foram a 5 m de profundidade de água (WD); e (2) três individuais ~ 1 m corais diâmetro de M. faveolata, todos os quais foram a 12 m WD. Radiação fotossinteticamente ativa (PAR) foi medido como 33-36% PAR a 5 m WD e 18-22% PAR 10 m WD. A amostragem foi realizada em janeiro, quando o SST foi de 26 ° C, nas profundidades de água de ambos os 5 m e 12 m. Cada uma dessas seis cabeças de coral foi coletada em triplicata em posições espaciais equivalentes (ie., Cerca de 45 ° N de latitude em cada um dos seis cabeças de coral hemisféricas). Cada amostra individual consistia em um 2,5 cm de diâmetro coral núcleo biópsia de tecido-esqueleto que foi coletado com arco soco limpo. Três biópsias de tecidos-esqueleto de coral foram amostrados em SCUBA padrão com as mãos enluvadas de cada uma das cabeças de coral (9 de M. annularis colônias em 5 m WD e 9 de M. faveolata a 12 m WD). Imediatamente após a recolha em profundidade, cada amostra de biópsia do núcleo foi colocado num tubo de centrífuga de 50 ml de polipropileno estéril, selado com tampa de rosca, e retornado para a superfície. A água do mar foi decantado a partir de cada tubo de centrifugação e cada biópsia foi então imerso, armazenados e transportados em paraformaldeído a 4%.
23-30. A maioria destes estudos utilizaram microscopia óptica / light ou com fluorescência ou técnicas de campo brilhantes. No entanto, estudos têm sido realizados no ultra-grandes ampliações utilizando eletrônica de varredura bloco de série rosto de imagem no passado 31. No presente estudo, um protocolo modificado SBFI foi desenvolvido e aplicado para a corais, pela primeira vez. Porque M. annularis e M. corais faveolata são de 1-2 mm de espessura, nenhuma das técnicas de microscopia de luz de rotina seria capaz de penetrar em toda a espessura do tecido de coral pólipo. Portanto, temos SBFI protocolo de preparação da amostra projetado especificamente para amostras de coral. Além disso, temos projetado um suporte estereoscópico, Que tem um motor para mover em ambas as direcções x e y. Este aparelho tem as imagens da face do bloco de amostra, em vez de recolher as secções utilizando um micrótomo regular em frente do microscópio. Nós também introduzido um outro de dois fotões técnica de microscopia óptica não-linear de imagem das mesmas os pólipos em toda a espessura dos tecidos de coral. Isto ultrapassa as limitações impostas pela SBFI em termos de descalcificação e a possibilidade de alterações na morfologia do tecido e volume (encolhimento) que podem ser induzidas, por uma preparação de amostra (desidratação) e protocolos de processamento. Além disso, os perfis de emissão dos corais foram espectralmente resolvido para identificar as suas emissões de pico e variações entre os cromatóforos e as zooxantelas fotossintética. Estes resultados foram avaliados no contexto do método utilizado e as suas vantagens em relação a cada tempo de aquisição, a análise do tempo, e a capacidade de resolver os detalhes estruturais finos sem comprometer structural integridade do tecido de coral.
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Protocol
NOTA: Reagentes para estar preparado para Face Serial Bloco de imagens de amostras de coral
1. Preinfiltration Wax
- Melt 3,6 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro. Misture bem em uma placa quente (60-70 ° C).
- Adicionar 400 mg de Sudan IV (para minimizar cera fluorescência de fundo). Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado.
- Adicionar 96 ml de parafina fundida a quente (100%) e misturar bem.
1.2) Embedding Wax
- Melt 7,2 g de flocos de estearina de uma proveta de vidro e misturar bem em uma placa quente (60-70 ° C).
- Adicionar 0,8 g de Sudan IV. Misturar bem e esperar até que uma solução de vermelho translúcido é alcançado.
- Adicionar grânulos de parafina (162 g) e misture até parafina derrete completamente.
- Adicionar 30 g de branco granular Vybar e derreter completamente no mesmo copo; uma vez derretido, misturar.
- Genericamente fechar o frasco de vidro com tampa. Coloque a garrafa de vidro em um 60 ° C convecção oven para manter os ingredientes no estado líquido. Realizar todas as infiltrações neste forno.
- Dividir o volume total de 200 mL a cera vermelha em duas garrafas de vidro de 100 ml cada. Use uma alíquota para a infiltração e o outro para a incorporação final.
1.3) Incorporação de Coral Os tecidos para o Bloco de série cara Imagem
- Lave os pólipos de coral coletadas em campo (SI vídeo 1) e armazenados (3-6 meses em 4-5 ° C em paraformaldeído) em tampão fosfato (3x 5 min) e descalcificação quando estiver pronto para ser trabalhada. Descalcificação dos pólipos em solução Excal por 24 horas ou até que os pólipos são totalmente desprovidos de CaCO3. Incubar vários corais descalcificadas como um único bloco de uma série 25, 50, 75, e 100% de etanol, seguido por 1x substituto de xileno para desidratar as amostras.
- Coloque os pólipos processados em forno pré-aquecido a 65 ° C, contendo 100% substituto xileno. Incubar durante 30 minutos duas vezes por Changing a solução fresca. Orientar os pólipos de tal maneira que a parte superior dos pólipos está voltado para baixo e a superfície superior é tão plana quanto possível.
- Adicione soluções de 2: 1, 1: 1 e 1: 2 e xileno substituto de cera preinfiltration (passo 1.1) em 50 mL de tubos Falcon.
- Incubar os pólipos com estes três concentrações crescentes de cera preinfiltration, seguido por incubação em 3x 100% preinfiltration cera durante 30-60 min de cada vez.
- Nota: Dependendo da espessura das amostras, os passos 1.3.1-1.3.5 pode ser aumentado com períodos mais longos de tempo.
- Mova as amostras para a incorporação de cera (veja o passo 1.2.6) após incubação 3x em 100% preinfiltration cera.
- Remover a cera incorporação após 30 min. Substituir com cera incorporação fresca e continuar a incubação durante um período mínimo de 4 horas a 65 ° C.
1.4) Incorporação em Red Wax
- Fotografe o bloco (a bandeja de aço inoxidável onde a cera branca é colocado e em cima do que o sample é colocado). Isto é necessário porque uma vez incorporado na cera, o local da amostra irá tornar-se invisível, como a cera é a incorporação de vermelho opaco.
- Coloque pequenas gotas de cera ponto alto ponto de fusão em torno do novo aço inoxidável pré-aquecido molde a incorporação e deixe-o esfriar. Despeje uma pequena quantidade de cera derretida de embutir recém segundo recipiente como indicado no passo 1.2.6.
- Posicionar o pólipo coral voltado para baixo rapidamente através da cera de ponto branco, em seguida, colocar num suporte de amostras de plástico no tabuleiro de aço inoxidável e despeje cera mais de incorporação de modo a que a cera vem para a superfície do molde de plástico.
- Leve toda a configuração de 65 ° C forno e deixe esfriar em um banco ou uma superfície fria até que a cera endurece completamente.
- Isto pode demorar até 6 horas ou dois dias. Colocar o bloco dessecada no frigorífico a 4 ° C, protegida da luz, para o armazenamento a longo prazo.
1.5) Seccionamento da série de configuração do bloco de Rosto
- Trim o bloco e cortada 1 mM seções usando um micrótomo. Não coletar as seções como eles vão se tornar como pó. Lembre-se, nós estamos imaginando apenas o rosto bloco. A amostra é exibida quando a cera branca começa a desaparecer.
- Captar imagens da face do bloco liso que contém a amostra de cada vez que uma secção é removida. Continue até que o pólipo coral desaparece como em SI Video 2.
- Record / capturar as imagens com uma câmera monocromática utilizando um filtro fluorescente FITC para pegar a auto-fluorescência do cromatóforos / coral pólipo. Imagem 3-4 núcleos descalcificados de cada espécie.
2. de imagem Corais Sob Dois fótons de microscopia de fluorescência
- Corrigir núcleos de pólipos de coral, cada um contendo cerca de 10-12 pólipos cerca de uma polegada de diâmetro, em paraformaldeído a 4% no local de coleta (beira-mar), assim que eles são colhidos sob a água.
- Manter as amostras a 4 ° C até à imagiologia. Núcleos lavados são colocados em poe mesma solução de cabeça para baixo em um prato fundo de vidro da tampa (0.17 mm de espessura).
- Usando um laser de dois fótons em 780 nm de excitação, imagem 3-4 pólipos em duas ampliações diferentes (zoom digital) com um (NA 0.3) objetiva de 10X. A forma pólipo coral ea altura varia entre as amostras (geralmente 1-2 mm) e profundidade de imagem também é limitada pela distância de trabalho do objetivo da imagem.
- Use o modo de digitalização telha de recolher cerca de 25-100 (5 x 5 ou 10 x 10 telhas) imagens por plano focal em xy e 50-100 imagens através do eixo z no intervalo de 10 ou 20 um, totalizando cerca de 5.000-10.000 images / pólipo coral.
- Imagem 3-4 áreas de pólipos para representar um núcleo e coral espécie. NOTA: A imagem tempo de aquisição varia entre 2-5 horas / área de pólipo.
- Armazenar todas as imagens no formato de dados brutos no disco rígido do sistema como LSM 5 de renderização 3D em uma análise de imagens 3D e software de renderização.
Volume Rendering 3 3D e Visualization de SBFI e de dois fótons de fluorescência espectral de dados
- Cortar os dados 2D para reduzir o tamanho do arquivo, concentrando-se em um único pólipo usando a ferramenta de corte quadrado no programa e compilar em um único arquivo TIFF (reduzir o tamanho do arquivo também por salvar o arquivo no formato de 8 bits) no software de aquisição.
- Abra os arquivos montados dos dados SBFI (recolhidas no passo 1.5.1) ou os azulejos vários z pilhas de secções ópticas de dois fótons (recolhidas no passo 2.1.4) no programa Imaris Ultrapasse módulo sob algoritmo volume.
- Projetar os dados SBFI prestados em 3D usando uma projeção de sombra. Criar um modo isosuperfície onde os voxeis são limiarizados para criar um padrão de superfície sólida (SI vídeo 3).
- Visualize as projeções em 3D usando um algoritmo de plano de corte em xy, xz e modos ortogonais yz para revelar estrutura 3D e forma dos corais.
- Animar as projeções usando um módulo de chave quadro de animação no mesmo programa Imaris (SI Videos 3-7).
- Gerar arquivos de vídeo em 5% de compressão e gerar um clips de vídeo em formato AVI com volumes (SI Vídeos 4 e 6), 3D e isosuperfície modalidades (SI Vídeos 5 e 7).
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Representative Results
Um aparelho de SBFI personalizados (fabricado especificamente para o presente estudo, a Figura 3) produziu os primeiros detalhadas em 3D de mapas digitais de elevação (MDEs) da textura da superfície exterior e morfologia do M. annularis e M. pólipos de coral faveolature (Figura 4 e SI Vídeos 1-2). Isto produziu imagens de lóbulos empilhados previamente undescribed de tecido de coral concentricamente irradiando para fora a partir do centro de cada uma (4B Figuras, 4D, 4E e) pólipos. Esses lobos são empilhados ao longo do cume mais alto da cobertura de tecido septos esquelético primário e secundário, com as radialmente externa e ínfimos lobos elevação eventualmente sintetizando e fundindo-se com tecidos coenosarc entre pólipos. A forma pólipo 3D e os lóbulos associados estavam bem preservados, apesar da amostra de tecido coral tendo passado por várias etapas de infiltração de alta temperatura e incorporação. O adicion de corante Sudan mascarada com sucesso como o fundo opaco, com a cor preta ter ajudado a maximizar o contraste de cada amostra e aumentar a relação sinal-para-ruído. 3D e vistas ortogonais plano mostraram a distribuição dos componentes fluorescentes ao longo do eixo z (Figura 4B). Havia aviões com flocos de cera que, por vezes obscurecidas detalhes da superfície do pólipo, que foram removidos para maior clareza ao criar projeções. A principal vantagem desta técnica é em revelar detalhes internos de qualquer amostra de espessura, eliminando assim a necessidade de tomar várias secções e alinhá-los num momento mais tarde. Além disso, as imagens nesta técnica já estão alinhados quando recolhidos (Figura 4A), que proporciona uma resolução de az-se a 1 um de um tamanho de amostra de até 10 mm ou mais (dependendo da distância total da unidade de suporte de bloco no micrótomo ). É possível discriminar diferentes componentes auto-fluorescente (usando vários filtros), bem como indivíduoZooxanthellae em maior ampliação, desde que o campo de visão reduzida é aceitável.
O ApoTome seccionamento óptico microscópio de fluorescência revelaram a distribuição de corais células tecidos (zooxanthellae e cromatóforos) e estrutura de tecido da superfície em uma resolução submillimeter. Assim, o diâmetro de 6-13 uM Zooxanthellae poderia ser facilmente reconhecido e quantificado em relação ao número de células por volume de tecido (Figura 5). A aquisição de imagem dupla canal usando a fluorescência da clorofila (verde) eo muco marcado com WGB Alexa 647 (mostrado em vermelho), melhor trabalhado para quantificar o nível de muco eo número de zooxantelas dentro de um determinado local do pólipo (maior e menor septos de pólipo pode ser calculado de forma independente).
Em adição a estas abordagens microscópio, temos também aplicado TPLSM, uma técnica largamente utilizada não linear para amostras biológicas de espessura. As principais vantagens do TPLSM mais sobree-fotão lasers de onda contínua que são: (1) de excitação ocorre apenas no ponto de focagem, porque o poder de a intensidade da luz de excitação torna-se ao quadrado e a possibilidade de uma molécula para absorver dois fotões consecutivos para excitar um electrão do fluoróforo é limitado a profundidade de campo da objectiva, proporcionando assim uma confocalidade inerente. e (2) como conseqüência, não haverá perda de um fóton de excitação enquanto penetrando mais profundamente na amostra, ao contrário de lasers de fótons individuais. Além disso, a maioria das amostras de tecido biológicos, absorvem luz visível. Uma vez que a excitação de dois fótons é inerentemente tempo (em infravermelho próximo a 780 nm), a absorção é também substancialmente minimizados. Por outro lado, o esqueleto de coral composto de carbonato de cálcio apenas absorve ou dispersa a luz de dois fotões. Finalmente, uma vez que estávamos interessados em determinar a distribuição de objetos apenas na superfície contornos do esqueleto de coral, encontramos imagens mais profunda utilizando esta modalidade very adequado para coral de imagem.
Nós tentamos caracterizar as assinaturas espectrais disponíveis em M. anular (Figuras 6-9). Aqui mostramos que, sob a 780 nm de excitação de dois fotões, cromatóforo auto-fluorescência tem um pico a cerca de 500 nm, enquanto que a fluorescência da clorofila de Zooxanthellae está centrada a cerca de 675 nm (Figura 6). Enquanto esta desmistura de dados espectrais (Figuras 6-7) também é possível, com um algoritmo de desmistura no software (Figura 8), uma vez que existe uma clara distância espectral entre os dois componentes, utilizando imagiologia los simultaneamente dois detectores em duas bandas de emissão provadas para ser mais técnica de economia de tempo. Isto é especialmente verdadeiro quando a amostra é de azulejo e trabalhada ao longo de toda uma profundidade de 1-2 mm de tecido. Isto elimina a necessidade de corte físico, o que requer vários milhares de imagens por localização e da amostra e dos pólipos. A distribuição o f chromatophores auto-fluorescente é também distinta (figura 9) entre as duas espécies de coral testados. Em um caso, observou-se um aumento significativo de cromatóforos na água mais rasa habitação coral M. annularis comparação com águas mais profundas M. faveolata (Figura 9 e SI vídeos 3 e 4).
Figura 1 (A) Mapa de Curaçao no sul do Mar do Caribe, mostrando a localização da área de estudo em Playa Kalki na costa sotavento distante noroeste da ilha. (B) Corte esquemático da prateleira recife de aros em Playa Kalki em Curaçao, mostrando as distribuições de profundidade de água de M. annularis e M. faveolata. iles / ftp_upload / 51824 / "target =" _blank 51824fig1highres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 2 (A) in situ fotografia campo subaquáticos de 12 m WD de M. faveolata em Playa Kalki, Curaçao. (B) Feche acima da ampliação da imagem em (A) mostrando os pólipos de coral individuais de M. faveolata em condições de iluminação durante o dia (cada pólipo é de aproximadamente 2 mm de diâmetro, alguns dos quais estão retraídos, denotado por *). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3 O bloco-face instrumentação imagens em série. (A e B) O titular microscópio projetado, detém o microscópio Stereolumar a 180 ° de frente para a face do bloco da amostra colocada no micrótomo. Quando cada secção foi removida, a imagem da face do bloco foi capturado com o objectivo e os dados foram armazenados digitalmente 2D. Isso foi feito até que a amostra desapareceu no bloco. O microscópio é movido na direção x e y usando um parafuso de avanço motorizado eo z, ajuste é feito para focar a amostra. É importante notar que, quando cada amostra é de 1 um corte, o bloco se desloca para a frente, de 1 um modo de reorientar o âmbito de aplicação não é necessário. XYMOT, Custom built xy estágio motorizado translacional; FLS, fonte de luz de fluorescência; MT, Micrótomo; MIC, Stereomicroscope; CAM, câmera monocromática Axiocam; BH, titular do bloco; BF, Bloco face dada amostra; FLL, Fluorescente ponto de luz de excitação no rosto bloco; OBJ, objetiva do microscópio; HIP, painel de interface humana. Uma imagem com a dimensão de 1.388 x 1.040 pixels verticais horizontais em modo monocromático foi coletado em um pixel xy resolução (single) de 1,25 m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. bloco de série cara de imagem dos corais M. annularis e M. faveolata coletadas de Playa Kalki, Curaçao. dados (A) da amostra definida galeria mostrando cerca de 800 imagens de imagens individuais 2D obtidos a partir de um pólipo em resolução de 1 mícron em z. (B) Em outra amostra de coral, o corte foi bem mais de 2,000 M em z. A imagem está mostrando pólipos múltiplos e compilação de todas as fatias em 2D em um volume 3D de projeção da sombra usando o algoritmo de visualização volumétrica Imaris. Projeção (C) Orthogonal mostrando uma visão xz da amostra em (B), pode-se ver toda a profundidade da amostra com mais de 2 mm e as setas indicam as linhas pretas em fatias 2D foram removidos devido à má qualidade; Esta imagem é da M. annularis. Volume 3D (D), isosuperfície renderização (E) e visualização dos dados SBFI. (D) múltiplos pólipos de coral que mostram a morfologia de pólipos em corte longitudinal do lado e o volume 3D (projecção de sombra) de um único pólipo no meio. Seccionamento e visualização em qualquer ângulo é possível em 3D (veja o vídeo SI). E. Desde voxels são nebulosos em 3D (D), a superfície isosuperfície rendido 3D mostra o contorno da superfície do pólipo coral e sua contextualarranjo com pólipos adjacentes (ver vídeo SI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura microscopia de fluorescência 5 de pólipos de coral. (A) Seção transversal de um pólipo descalcificadas de M. faveolata exibindo zooxantelas com autofluorescência da clorofila sob luz azul (em verde) e bolsos mucosas marcados com aglutinina de germe de trigo (mostrado em vermelho) como fotografados sob luz vermelha. A imagem é automaticamente azulejos em dois canais e costuradas e alinhadas usando o software do aparelho. (B) alargamento da caixa mostrado em (A), que mostra Zooxanthellae individuais (cada círculos verdes, aproximadamente 6-8 m de diâmetro em verde) ea camada de muco da superfície (vermelho), ea fusão dos dois canais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 em dois fotões caracterização espectral de fluorescência a partir de corais. Usando o detector espectral do sistema LSM 710, os sinais de fluorescência de todo o espectro visível (419-722 nm), foram verificados mais de uma profundidade de cerca de 190 ^ m. A imagem mostra o intervalo de profundidade 5 mm no eixo x para a pilha e z o eixo y é o comprimento de onda 419-722 nm adquirido em intervalos de 10 nm (um total de cerca de 1154 imagens mostraram). Pode-se ver os dois componentes espectrais, uma centrada em 500 nm eo segundo a 650 nm. A dois fótons do laser excicomprimento de onda de 780 nm ção foi utilizada para obter os perfis de emissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 Caracterização dos dois componentes espectrais. (A) O perfil espectral de fundo (azul), a autofluorescência das chromatophores (verde) e de fluorescência da clorofila (vermelho) excitado pela dois fotões de excitação de laser de comprimento de onda do laser de 780 nm. Os espectros derivada mostrada no lado direito dos dados espectrais multicolor sobrepostas e pseudo-colorida de acordo com o perfil de emissão. (B) As caixas espectrais individuais, onde os sinais são recebidos no intervalo de 10 nm, para derivar os espectros e a imagem em (A). Nota que os dois componentes distintos, um centrado em cerca de 500 nm (chromatophore autofluorescência) eo outro sobre 675 nm (fluorescência da clorofila). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 Os mesmos imagens nas Figuras 7A e 7B, os dados espectrais não misturados utilizando o software e os seus correspondentes picos de emissão / espectros. Em ambos M. annularis e M. faveolata, os componentes espectrais são muito semelhantes, bem como seus picos de emissão. A diferença significativa, no entanto, deve-se à localização destes componentes espectrais e a sua abundância (ver Figura 9)."target =" ghres.jpg _blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. dois fótons de fluorescência imagens em 3D de pólipos de coral de M. annularis (AD) e M. faveolata (EH). (A e E) foram fotografadas sem separação espectral de componentes usando 780 nm de excitação do laser de dois fótons, com o sinal óptico coletadas 450-700 nm. (B e F) foram recolhidos com o mesmo de excitação (780 nm), mas dois detectores de PMT foram usados simultaneamente para recolher os dados a partir de dois componentes ou seja., Um 500-550 nm (verde-cromatóforo autofluorescência) e o outro 650- 720 nm (fluorescência vermelha-clorofila). (C e G) são codificados profundidade imagens(B e F), o vermelho é mais raso e azul é componentes mais profundos em 2D. (D e H) são imagens yz de corte através de (B e F), respectivamente, mostrando a fluorescência vem apenas da superfície do coral e o esqueleto não tem nenhuma fluorescência a 780 nm de excitação. Observe a diferença substancial no conteúdo chromatophore entre os dois corais. A M. habitat annularis (0-10 m WD) é menor do que o M. habitat faveolata (10-20 m WD). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 as potências de dez estrutura espacial hierárquica de estudos of ecossistemas de recifes de coral. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
SI Figura 1 tiros de tela mostrando os passos (AI) envolvidos na criação de volume 3D e renderização isosurface a partir de qualquer dos dados SBFI ou a microscopia 2Photon usando o software de análise de imagem (ver Tabela de Materiais). (A) as fatias 2D da matéria dados no modo de fatia mostrando um único plano; (B) volume 3D de todas as fatias em 2D; (C) o assistente de criação isosurface com uma região de interesse (ROI) selecionada; (D) um algoritmo com uma subtração de fundo selecionada; (E) um valor limiar aplicado para pegar os pixels que represent o de dados; (F) os pontos centrais de sementeira da superfície; (G) um filtro com base em volume é aplicada para eliminar o menor volume de detritos e de ruído; (H) o 3D definitiva proferida isosurface; (I) assistente chave quadro de animação para criar filmes como nos vídeos SI. As imagens finais prestados são apresentados em ambas as modalidades de volume e isosuperfície no SI Vídeos 3-7. O protocolo passos 3.1.3-3.1.5 cobre estes procedimentos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Materiais / Equipamentos | Empresa | Catálogo / Número modelo | Comentários / Descrição |
| Tecido Coral Skeleton | Nenhum | Nenhum | 2,5 centímetros BIOPsy do habitat natural |
| Arch Soco Coring Dispositivo | CS Osborne and Company | No. 149 | Para a coleta de biópsia Coral |
| Paraformaldeído | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% pré-diluído |
| Histoclear / Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Alternativa não-tóxica para xileno, desidratação e desparafinização |
| Xileno e etanol | Fisher Scientific | Fisher Scientific | Desidratação |
| Parafina | Richard Allen Científica | Tipo H REF 8338 | Solução Infiltração |
| Vybar | A vela Criador | Nenhum | Componente do Red Wax |
| Stearin | A vela Criador | Nenhum | Componente do Red Wax |
| Sudão IV | Fisher Chemical | S667-25 | Fundo vermelho Wax-Opaque |
| Gérmen de Trigo Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | Para a rotulagem Coral Muco |
| Prolong Ouro | Life Technologies | P36095 | Meio de montagem anti-fade |
| Fluoro Dish | Instrumentos de Precisão mundo | FD-35-100 | Por dois fótons |
| XY Motor, Motorista e Controlador | Lin Engenharia | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY movimento de translação |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Derreter a cera |
| Forno de convecção | Yamato | DX-600 | A infiltração ea inclusão |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | |
| Micrótomo | Leica | RM2055 | Facas descartáveis |
| Microscópio Stereo | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objetivo |
| Microscópio de fluorescência com ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert 200 M, ApoTome I Sistema | A imagem latente de seção fina de um pólipo: Zooxanthellae |
| Câmera Axiocam | Carl Zeiss | MRM | Câmera monocromática 1388x1040 pixels |
| Software Axiovision | Carl Zeiss | Versão 4.8 | Programa de aquisição de imagem |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai EHP, laser pulsado (70 fs) | Com o módulo DeepSee |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 com Spectral Detector | 34canal de detecção PMT |
| Software Zen | Carl Zeiss | 2010 ou acima | para dois fótons e aquisição de imagem espectral |
| Imaris Software Suite | Bitplane, Inc., | Versão 7.0 ou superior | Volume 3D, Rendering Iso-superfície, Visualization |
Tabela 1.-primas essenciais, equipamentos, microscópios, e software utilizado neste estudo.
SI Video 1. In situ vídeo campo subaquática que mostra o habitat de corais em 12 m WD de M. faveolata em Playa Kalki, Curaçao.
SI Video 2. Individual 2D imagens de rostos bloco de série da imagem renderizada em 3D mostrado na Fi4E figura.
SI Video 3. imagem do rosto isosuperfície 3D rendeu o bloco de série apresentado na Figura 4E e SI vídeo 1, mostrando a topografia do pólipo coral.
SI Video 4. volume 3D imagem de microscopia dados brutos de dois fótons proferida do pólipo coral M. faveolata. A excitação é 780 nm ea emissão capturado simultaneamente em duas larguras de banda para zooxantelas (pseudo-cor vermelha, 600-700 nm) e cromatóforos (pseudo-colorido verde, 500-550 nm).
SI Video 5. imagem de microscopia de dois fótons do pólipo coral M. volume 3D renderizados em isosuperfície-spotsfaveolata. A excitação é 780 nm ea emissão capturado simultaneamente em duas larguras de banda para zooxantelas (pseudo-cor vermelha, 600-700 nm) e cromatóforos (pseudo-colorido verde, 500-550 nm).
SI Video 6. volume 3D imagem de microscopia dados brutos de dois fótons proferida do pólipo coral M. annularis. A excitação é 780 nm ea emissão capturado simultaneamente em duas larguras de banda para zooxantelas (pseudo-cor vermelha, 600-700 nm) e cromatóforos (pseudo-colorido verde, 500-550 nm).
SI Video 7. volume 3D prestados isosuperfície-spots imagem de microscopia de dois fótons do pólipo coral M. annularis. A excitação é 780 nm ea emissão capturado simultaneamente em duas larguras de banda para zooxantelas (PSeudo de cor vermelha, 600-700 nm) e cromatóforos (pseudo-colorido verde, 500-550 nm).
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Discussion
Pesquisa recife de coral é um esforço de pesquisa altamente interdisciplinar, envolvendo análise da simultânea físicos, químicos e fenômenos biológicos que atuam no ambiente marinho. O estudo dos ecossistemas de recifes de coral complexos é, portanto, melhor concluída dentro de "Powers of Ten" quadro contextual (Figura 10). Este gráfico ilustra que a compilação do ecossistema coral abrange uma ampla gama de dimensões espaciais (10 -9 a 10 5 m). Além disso, este exercício ilustra que analisa geobiológico em um comprimento de escala intermédia de 1 mm a 1 cm são a ponte necessária para combinar de campo e análises laboratoriais. Este Powers of Ten quadro é o contexto para os experimentos, análises, modelagem e síntese da física, química e parâmetros biológicos que controlam Curaçao ecossistemas de recifes de coral.
O presente estudo é o primeiro a aplicar a suíte o totalmente integradof FM, SBFI e técnicas MCVL para acompanhar a resposta dos corais aparentemente saudáveis para aumentar a profundidade da água. Microscopia de luz disponíveis ferramentas de tecido inteiro de imagem ou amostras biológicas grossas têm sido limitados, devido a uma variedade de limitações ópticos colocados pelas próprias amostras, que incluem a absorção, dispersão, e outros fenómenos. Em apenas na última década, microscopia eletrônica de varredura SBFI foi utilizado em ultra-altas resoluções 31, bem como de imagem microscópica de luz, utilizando todo o campo com base SBFI imagem de várias amostras biológicas. Isto inclui as análises de tudo do cérebro para os tecidos cardíacos inteiras e mesmo as amostras contendo os ossos que foram moídas, polido, rotulados e trabalhada, ao mesmo tempo após cada secção foi feito 23-29. Recentemente, a microscopia de fluorescência confocal e foram usados para revelar os contornos, forma e distribuição de proteínas e pigmentos em amostras biológicas 32-33. No entanto, a estrutura 3D de cada pólipos de coral had não foi resolvido anteriormente. O pré-requisito para SBFI com amostras de coral é de descalcificação, como o carbonato de cálcio tem de ser removido antes do processamento das amostras passíveis de infiltração e de seccionamento usando um micrótomo regular.
Isto é onde a microscopia de fluorescência de dois fotões torna-se indispensável para a análise dos tecidos biológicos, devido às suas fenómenos de excitação únicos de dois fotões. Isso levou a prolongada 33-34 profundidade de penetração dos tecidos de coral no presente estudo, onde a etapa de descalcificação foi efetivamente eliminado devido à não-linear de excitação de dois fótons fenômenos 34. Além disso, o módulo de pre-compensação com o laser de dois fotões desde muito menor largura de impulso, o qual, adicionalmente, a profundidade de penetração melhorada. No lado da amostra, uma vez que o carbonato de cálcio não absorve a luz de infravermelho próximo a 780 nm, profundidade de penetração é limitada tipicamente por a distância de trabalho do objectivo. Ainda uma outra desvantagem of descalcificação e a remoção do esqueleto de coral é a perda de integridade estrutural do tecido do coral, o que faz com que as estimativas do volume de tecido ainda mais depois de a amostra ter passado por vários passos de desidratação e reidratação e incorporação em cera isento de água. Isso enfatiza a importância de determinar volumes de tecido de coral antes e após o processamento.
A caracterização confocal de proteínas fluorescentes de coral foi concluída para os corais Grande Barreira de Corais e as propriedades espectrais de proteção foram correlacionados com a profundidade do habitat coral 32. No entanto, no presente estudo, que demonstram, pela primeira vez utilizando microscopia de dois fotões que há uma redução substancial em todos os lugares de chromatophores no coral águas profundas, excepto em tecidos da boca. Além disso, as alterações distintas na distribuição dos Zooxanthellae com respeito aos chromatophores foi observada através transecções profundidade em M. annularis, where os tecidos dos corais de águas rasas são completamente cobertas com cromatóforos. Com a resolução fornecida pela imagem de alta ampliação (Figuras 8C e 8D), agora podemos quantificar com precisão a área eo volume ocupado pela zooxantelas, e os seus rácios de densidade do tecido pode ser determinada em relação a outros componentes celulares. Tomados em conjunto, a integração de SBFI e dois fótons de fluorescência de imagem espectral no presente estudo têm rendido vitalmente importantes novos insights sobre a morfologia ea estrutura dos tecidos corais. Estes dados irão ajudar a quantificar os componentes individuais de tecido coral, quer a nível individual ou de pólipo no nível contextual de interação entre pólipos coloniais em toda uma cabeça de coral. Este contexto irá agora permitir que a resposta adaptativa do holobiont coral a mudanças na profundidade da água do nível do mar e irradiância de ser rastreado e quantitativo previsto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coral Tissue Skeleton | 2.5 cm Biopsy from natural habitat | ||
| Arch Punch Coring Device | C.S. Osborne and Company | No. 149 | For Coral biopsy collection |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | RT 15700 | 16% Pre-diluted |
| Histoclear/Safeclear II | Electron Microscopy Sciences | RT 64111-04 | Non-Toxic alternate to Xylene, Dehydration and Deparafinization |
| Xylene and Ethanol | Fisher Scientific | Dehydration | |
| Paraffin Wax | Richard Allen Scientific | Type H REF 8338 | Infiltration solution |
| Vybar | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Stearin | The Candle Maker | Component of Red Wax | |
| Sudan IV | Fisher Chemical | S667-25 | Red Wax-Opaque background |
| Wheat Germ Agglutinin (WGA) | Life Technologies | W32466 | For labeling Coral Mucus |
| Prolong Gold | Life Technologies | P36095 | Anti-fade mounting media |
| Fluoro Dish | World Precision Instruments | FD-35-100 | For two-photon imaging |
| XY Motor, Driver and Controller | Lin Engineering | 211-13-01R0, R325, R256-RO | XY Translational Movement |
| Hot Plate | Corning | DC-220 | Melting all wax |
| Convection Oven | Yamato | DX-600 | Infiltration and Embedding |
| Tissue Processor | Leica | ASP 300 | Dehydration, Infiltration |
| Microtome | Leica | RM2055 | Disposable knifes |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stereolumar V 12 | 1.5x (30 mm WD) Objective |
| Fluorescence Microscope with ApoTome | Carl Zeiss | Axiovert M 200, ApoTome I System | Imaging thin section of a polyp: Zooxanthellae |
| Axiocam camera | Carl Zeiss | MRm | Monochrome camera 1388x1040 pixels |
| Axiovision Software | Carl Zeiss | Version 4.8 | Image acquisition program |
| Two-Photon Laser | Spectraphysics | Maitai eHP, pulsed laser (70 fs) | With DeepSee module |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM 710 with Spectral Detector | 34 channel PMT detection |
| Zen Software | Carl Zeiss | 2010 or above | for two-photon and spectral image acquisition |
| Imaris Suite Software | Bitplane, Inc., | Version 7.0 or above | 3D Volume, Iso-surface Rendering, Visualization |
References
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