الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين
Summary
A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.
Abstract
NG2 الخلايا معربا عن (polydendrocytes، خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف) هي رابع السكان الخلايا الدبقية كبير في الجهاز العصبي المركزي. أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة أنها تتكاثر بنشاط وتوليد الخلايا قليلة التغصن myelinating. وعادة تتم دراسة هذه الخلايا في الثقافات فصلها الأولية، cocultures الخلايا العصبية، وفي الأنسجة الثابتة. باستخدام خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة حديثا شريحة نظم الاستزراع يمكن استخدامها لتحقيق انتشار والتمايز للخلايا دبقية قليلة التغصن النسب في المنطقتين المادة الرمادية والبيضاء في الدماغ الأمامي والمخيخ. يتم إعداد الثقافات شريحة من الفئران بعد الولادة المبكرة ويتم الاحتفاظ في الثقافة لمدة تصل إلى 1 في الشهر. هذه الشرائح ولا يمكن تصوير عدة مرات خلال الفترة الثقافة للتحقيق في سلوك الخلايا والتفاعلات. هذا الأسلوب يسمح التصور من انقسام الخلايا NG2 والخطوات المؤدية إلى دبقية قليلة التغصن التمايز مع تمكين تحليل مفصل للمنطقة تعتمدالأنف والحنجرة خلية دبقية قليلة التغصن NG2 وعدم التجانس الوظيفي. هذا هو أسلوب القوية التي يمكن استخدامها لتحقيق الإشارات الجوهرية وخارجي التأثير على هذه الخلايا مع مرور الوقت في بيئة الخلوية التي تشبه تلك الموجودة في الجسم الحي.
Introduction
وقد أثبتت الثقافات شريحة Organoytpic من الجهاز العصبي المركزي إلى أن تكون مفيدة للغاية لدراسة الخلايا العصبية وبيولوجيا الخلايا الدبقية في نظام semiintact 1-4. هذه الثقافات هي بسيطة نسبيا لاعتماد وتحتفظ العديد من الفوائد من مزارع الخلايا فصلها الأولية مثل التلاعب في البيئة خارج الخلية وسهولة الوصول للالمتكررة على المدى الطويل التصوير الخلية الحية والتسجيلات الكهربية 5-9. بالإضافة إلى ذلك، الحفاظ على الثقافات شريحة التهندس الخلوي الأنسجة 3 الأبعاد، والربط العصبية الإقليمي، ومعظم أنواع الخلايا الرئيسية موجودة في النظام. هذه الخصائص تجعل هذه الثقافات نظام فريد ومريحة للتحقيق في سلوك خلية واحدة وعلم وظائف الأعضاء مع التفاعلات الخلوية والبيئية.
خلايا NG2 هي مجموعة من الخلايا الدبقية في الجهاز العصبي المركزي الثدييات التي لا تزال تتكاثر وتوليد مyelinating قليلة التغصن أثناء التطور الجنيني وبعد الولادة 10. فقد تمت دراستها على نطاق واسع في مزارع الخلايا الأولية فصلها، والتطورات الأخيرة في خطوط الماوس المعدلة وراثيا مع التعبير NG2 خلية محددة من البروتينات الفلورية سهلت في رسم مصير الجسم الحي والتسجيلات الكهربية في الاستعدادات شريحة الحادة. حتى مع هذه الدراسات، لا يعرف الكثير عن ديناميات الزمنية من NG2 تكاثر الخلايا والتمايز دبقية قليلة التغصن. على الرغم من أن يستخدم على نطاق واسع الثقافة خلية فصلها عن المنشأة النسبي في التلاعب الدوائية والوراثية، فإنه ليست مناسبة للاستجواب الاختلافات الوظيفية لهذه الخلايا في مناطق الدماغ المختلفة لا سيما عندما يكون من المرغوب فيه للحفاظ على سياق المكروية الخلوية. الثقافات شريحة توفر بديل بسيط هو أن قابلة للتلاعب الدوائية واستخدمت لتحقيق دبقية قليلة التغصن تكون الميالين 11،12، والخليةاستجابة جزيئية بعد ليزوليسيتين (مجلس السلام الليبيري) أو الأجسام المضادة التي يسببها إزالة الميالين 13،14، وتحريض عودة الميالين عن طريق العلاج الدوائي 15.
وهناك طريقة للتحقيق وإجراء التصوير الحية والأنسجة الثابتة (أو postfixation) تحليل NG2 تكاثر الخلايا والتمايز دبقية قليلة التغصن في الثقافات شريحة عضوي النمط مأخوذة من كل من الدماغ الأمامي والمخيخ يوصف. هذا هو وسيلة قوية يمكن استخدامها لدراسة مصير خلية من خلايا NG2 واحدة بعد تقسيم 16 واكتشاف الاختلافات إقليمية وتعتمد على العمر في عامل نمو الخلايا NG2 يسببها انتشار 17. هذه التقنية بسيطة نسبيا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع لمواصلة التحقيق خلية جوهري و / أو بيئية آليات تنظيم وظائف أعضاء هذه الخلايا الدبقية واستجابتها لنشاط الخلايا العصبية أو ضرر المايلين.
Protocol
Representative Results
Discussion
تكون الميالين في الجهاز العصبي المركزي أمر ضروري للتواصل الفعال وبقاء الخلايا العصبية محور عصبي 22. خلايا NG2 تولد باستمرار قليلة التغصن myelinating في مرحلة البلوغ مع الحفاظ على السكان المقيمين في معظم مناطق الدماغ 16،23 – 25. وقد وصفت بعض الآليات الوراثية والجزيئ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG4179 to A.N.), the National Institutes of Health (NIH R01NS073425 and R01NS074870 to A.N.) and the National Science Foundation (A.N.). We thank Dr. Frank Kirchhoff (University of Saarland, Homburg Germany) for providing PLPDsRed transgenic mice. We thank Youfen Sun for her assistance in maintaining the transgenic mouse colony.
Materials
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope |
References
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures for long-term live imaging. Nature Protocols. 1 (3), 1165-1171 (2006).
- Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. Organotypic slice cultures: a technique has come of age. Trends in Neurosciences. 20 (10), 471-477 (1997).
- Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro. Science. 245 (4914), 192-194 (1989).
- Bahr, B. A., Kessler, M., et al. Stable maintenance of glutamate receptors and other synaptic components in long-term hippocampal slices. Hippocampus. 5 (5), 425-439 (1995).
- Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
- Noctor, S. C., Martínez-Cerdeño, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nature Neuroscience. 7 (2), (2004).
- Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures. Journal of Visualized Experiments JoVE. (61), (2012).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic slice culture of E18 rat brains. Journal of Visualized Experiments JoVE. (6), e235 (2007).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Reviews Neuroscience. 10 (1), 9-22 (2009).
- Haber, M., Vautrin, S., Fry, E. J., Murai, K. K. Subtype-specific oligodendrocyte dynamics in organotypic culture. Glia. 57 (9), 1000-1013 (2009).
- Bin, J. M., Leong, S. Y., Bull, S. -. J., Antel, J. P., Kennedy, T. E. Oligodendrocyte precursor cell transplantation into organotypic cerebellar shiverer slices: a model to study myelination and myelin maintenance. PloS one. 7 (7), (2012).
- Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system. Journal of Neuroscience Research. 78 (2), 157-166 (2004).
- Harrer, M. D., von Budingen, H. C., et al. Live imaging of remyelination after antibody-mediated demyelination in an ex model for immune mediated CNS damage. Experimental Neurology. 216 (2), 431-438 (2009).
- Fancy, S. P. J., Harrington, E. P., et al. Axin2 as regulatory and therapeutic target in newborn brain injury and remyelination. Nature Neuroscience. 14 (8), 1009-1016 (2011).
- Zhu, X., Hill, R. A., Dietrich, D., Komitova, M., Suzuki, R., Nishiyama, A. Age-dependent fate and lineage restriction of single NG2 cells. Development. 138 (4), 745-753 (2011).
- Hill, R. A., Patel, K. D., Medved, J., Reiss, A. M., Nishiyama, A. NG2 Cells in White Matter But Not Gray Matter Proliferate in Response to PDGF. Journal of Neuroscience. 33 (36), 14558-14566 (2013).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Novak, A., Guo, C., Yang, W., Nagy, A., Lobe, C. G. Z/EG, a double reporter mouse line that expresses enhanced green fluorescent protein upon Cre-mediated excision. Genesis. 28 (3-4), 147-155 (2000).
- Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
- Hirrlinger, P. G., Scheller, A., et al. Expression of reef coral fluorescent proteins in the central nervous system of transgenic mice. Molecular and Cellular Neuroscience. 30 (3), 291-303 (2005).
- Nave, K. -. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Rivers, L. E., Young, K. M., et al. PDGFRA/NG2 glia generate myelinating oligodendrocytes and piriform projection neurons in adult mice. Nature Neuroscience. 11 (12), 1392-1401 (2008).
- Dimou, L., Simon, C., Kirchhoff, F., Takebayashi, H., Gotz, M. Progeny of Olig2-expressing progenitors in the gray and white matter of the adult mouse cerebral cortex. The Journal of Neuroscience. 28 (41), 10434-10442 (2008).
- Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration. Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).
- Ioannidou, K., Anderson, K. I., Strachan, D., Edgar, J. M., Barnett, S. C. Time-lapse imaging of the dynamics of CNS glial-axonal interactions in vitro and ex vivo. PloS one. 7 (1), e30775 (2012).
- Ghoumari, A. M., Baulieu, E. E., Schumacher, M. Progesterone increases oligodendroglial cell proliferation in rat cerebellar slice cultures. Neuroscience. 135 (1), 47-58 (2005).
- Azim, K., Butt, A. M. GSK3β negatively regulates oligodendrocyte differentiation and myelination in vivo. Glia. 59 (4), 540-553 (2011).
- Hussain, R., El-Etr, M., et al. Progesterone and nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors. Endocrinology. 152 (10), 3820-3831 (2011).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Lubetzki, C., Demerens, C., et al. Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (14), 6820-6824 (1993).
- Demerens, C., Stankoff, B., et al. Induction of myelination in the central nervous system by electrical activity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (18), 9887-9892 (1996).
- Wood, P. M., Bunge, R. P. Evidence that sensory axons are mitogenic for Schwann cells. Nature. 256 (5519), 662-664 (1975).
- Stevens, B., Tanner, S., Fields, R. D. Control of myelination by specific patterns of neural impulses. The Journal of Neuroscience. 18 (22), 9303-9311 (1998).
- Stevens, B., Porta, S., Haak, L. L., Gallo, V., Fields, R. D. Adenosine: a neuron-glial transmitter promoting myelination in the CNS in response to action potentials. Neuron. 36 (5), 855-868 (2002).
- Wake, H., Lee, P. R., Fields, R. D. Control of local protein synthesis and initial events in myelination by action potentials. Science. 333 (6049), 1647-1651 (2011).
- Rosenberg, S. S., Kelland, E. E., Tokar, E., De la Torre, A. R., Chan, J. R. The geometric and spatial constraints of the microenvironment induce oligodendrocyte differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14662-14667 (2008).
