Abstract
As células que expressam NG2 (polydendrocytes, células precursoras de oligodendrócitos) são a quarta maior população de células da glia do sistema nervoso central. Durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal eles ativamente proliferar e gerar oligodendrócitos myelinating. Estas células têm sido vulgarmente estudada em culturas dissociadas de neurónios primárias, co-culturas, e em tecido fixado. Utilizando linhas de ratinhos transgénicos fatia recentemente disponíveis sistemas de cultura pode ser utilizado para investigar a proliferação e diferenciação de células da linhagem de oligodendrócitos em ambas as regiões de matéria cinzenta e branca do cérebro anterior e do cerebelo. Culturas de fatias são preparadas a partir de ratos pós-natais precoces e são mantidas em cultura durante 1 mês. Estas fatias podem ser fotografada várias vezes ao longo do período de cultura para investigar o comportamento celular e interações. Este método permite a visualização de divisão celular NG2 e os passos que levam à diferenciação de oligodendrócitos, enquanto permitindo uma análise detalhada da região, dependement células NG2 e oligodendrócitos heterogeneidade funcional. Esta é uma técnica poderosa que pode ser utilizada para investigar os sinais intrínsecas e extrínsecas que influenciam estas células ao longo do tempo em um ambiente celular que se assemelha ao que se encontra in vivo.
Introduction
Culturas fatia Organoytpic do sistema nervoso central têm provado ser extremamente útil para o estudo do neurônio e da biologia de células gliais em um sistema semiintact 1-4. Estas culturas são relativamente simples de adoptar e reter muitos benefícios de culturas dissociadas de células primárias, tal como a manipulação do ambiente extracelular e de fácil acesso para a imagem de células vivas repetida a longo prazo e registos electrofisiolicos 5-9. Além disso, as culturas de fatias manter citoarquitetura tecido 3-dimensional, conectividade neuronal regional, e a maioria dos tipos de células principais estão presentes no sistema. Estas propriedades fazem essas culturas um sistema único e conveniente para investigar o comportamento de uma única célula e fisiologia com interações celulares e ambientais.
NG2 células são uma população de células da glia do sistema nervoso central dos mamíferos que continuam a proliferar e gerar myelinating oligodendrócitos durante embrionário e pós-natal de desenvolvimento 10. Eles têm sido extensivamente estudados em culturas de células primárias dissociadas, e o desenvolvimento recente de linhas de ratinhos transgénicos com expressão específica para células NG2 de proteínas fluorescentes em facilitou o mapeamento destino in vivo e registos electrofisiolicos em preparações de fatias agudas. Mesmo com esses estudos, pouco se sabe sobre a dinâmica da proliferação de células NG2 e diferenciação de oligodendrócitos. Embora a cultura de células dissociadas é amplamente utilizado para a relativa facilidade em manipulações farmacológicas e genéticas, que não é adequado para a interrogação diferenças funcionais destas células em diferentes regiões cerebrais particularmente quando é desejável manter o contexto do microambiente celular. Culturas de fatias proporcionar uma alternativa simples, que é passível de manipulações farmacológicas e têm sido utilizados para investigar a mielinização 11,12 oligodendrócitos, célulaular resposta após lisolecitina (LPC) ou anticorpo desmielinização 13,14, e indução de remielinização por meio do tratamento farmacológico 15.
Um método para investigar e realizar imagem ao vivo e tecido fixo (ou postfixation) análise da proliferação celular e diferenciação NG2 oligodendrócitos em culturas organotípicas de fatias retiradas quer do cérebro anterior e do cerebelo é descrito. Este é um método poderoso que pode ser utilizado para estudar o destino da célula de células NG2 individuais após divisão 16 e para descobrir diferenças região-e dependente da idade, do factor de crescimento NG2 induzida a proliferação de células 17. Esta técnica relativamente simples é amplamente acessível para investigar celular intrínseca e / ou ambiental mecanismos que regulam a fisiologia destas células gliais e sua resposta à atividade neuronal ou danos mielina.
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Protocol
NOTA: Todos os procedimentos com animais está seguindo as diretrizes e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) da Universidade de Connecticut.
NOTA: Para estas experiências constitutivas NG2cre 18 (JAX # 008533) e induzível NG2creER 16 (JAX # 008538) camundongos transgênicos cruzou para Z / EG 19 (JAX # 003920) ou gtRosa26: YFP repórter 20 (JAX # 006148) linhas, respectivamente, foram utilizados a imagem células NG2 e seus descendentes. Para imagem oligodendrócitos maduros, foram utilizados PLPDsRed camundongos transgênicos 21. Para a sobrevivência consistente, as fatias pode ser isolado a partir de murganhos de até 10 dias pós-natal de ambos o cérebro anterior e do cerebelo.
1 fatia Preparação
- Em uma capa de cultura, colocar inserções de cultura de tecidos em seis poços e adicionar 1 ml fatia meio de cultura (receita na seção de reagentes). Colocar as placas na incubadora de cultura de células a 37 ° C com 5% de CO 2, pelo menos, 2 horas antes da dissecação.
- Esterilizar todas as ferramentas e cortador de tecidos com 70% de etanol.
- Tampão bolha dissecção (receita na secção reagentes) com 95% de O2, 5% de CO 2 em gelo durante pelo menos 15 minutos antes do início da dissecção.
- Anestesiar filhotes de rato, colocando-se em gelo durante 5-10 minutos de acordo com os protocolos aprovados animais. Determinar a profundidade adequada de anestesia, confirmando que os ratos não respondem a cauda e pés beliscar.
- Decapitar os animais utilizando uma tesoura afiada seguintes protocolos animais. Remover rapidamente o crânio sobre o cérebro anterior e do cerebelo fazendo primeiro um corte sagital seguido de incisão lateral, usando ferramentas esterilizados. Cortar nervos cranianos a partir da superfície ventral do cérebro e cerebelo com cuidado rolando o tecido para o lado.
- Colocar o tecido de uma estéril prato de 35 mM contendo tampão de dissecção oxigenado gelado.
- Usando uma lâmina de barbear, cortar o cerebelo eo cérebro anterior. Em seguida, faça um corte médio-sagital throurg o cérebro anterior e do cerebelo, separando os hemisférios.
- Corte 300 m de espessura secções coronal e sagital do cérebro anterior e cerebelo com um cortador de tecidos manual. NOTA: Um cortador de tecidos manual permite o processamento rápido de dissecção de incubação da cultura, sem a necessidade de incorporação de agarose. Um vibratome também pode ser utilizado como descrito anteriormente 9.
- Transferir fatias separadas em tampão de dissecção frio recém borbulhar em gelo.
- Use pequena dissecação ou pesando espátulas para separar seções individuais e transferi-los para pré-incubados seis pratos bem com inserções de cultura.
- Remover qualquer excesso de tampão de dissecção a partir da superfície da lâmina de cultura, utilizando uma pipeta de transferência descartável ou uma ponta de pipeta P 200. Dois a três prosencéfalo ou três fatias de cerebelo podem ser colocados em uma inserção de cultura.
NOTA: Para obter resultados consistentes com as culturas do cérebro anterior, é ideal para tomar fatias que mede o anterior de um terço do corpo caloso(Figura 1A), a fim de estudar as duas regiões de substância cinzenta e branca na mesma fatia. Cada animal geralmente produz seis fatias do cérebro anterior e seis fatias do cerebelo. - Coloque as placas de seis poços na incubadora e substituir o meio fatia com 1 ml de meio de fatia 1 dia após a preparação fatia e, em seguida, a cada dois dias até que a fixação fatia.
- Dependendo da experiência, utilizam fatias após 5-7 dias em cultura. Use somente as fatias que se tornam transparentes após os primeiros dias e descartar aqueles que possuem regiões opacas irregulares. NOTA: regiões opacas dentro fatias são visíveis a olho nu e aparecer como um aglomerado de células escuras sob contraste de fase. Após a técnica foi dominada, fatias opacos mortas ocorrem raramente, em menos de 1-5% de fatias.
2 Time-Lapse Imagem de NG2 divisão celular e diferenciação Oligodendrocyte
NOTA: Para executar time lapse imagem da proliferação das células NG2 e diferenciação usamos NG2cre: ZEG camundongos 16que expressam GFP em células NG2 e seus descendentes (Figura 1C-E). Expressão Reporter nesta linha é suficientemente robusto para obter imagens ao vivo de GFP + células em fatias imediatamente após o corte por um período de tempo de pelo menos quatro semanas. As imagens são obtidas mais claras após o período inicial de desbaste da fatia, o qual ocorre durante os primeiros 3-5 dias de cultura.
- Durante toda a experiência, manter as fatias numa incubadora de cultura de células a 37 ° C e remover apenas por breves períodos de tempo (inferior a 15 min por fatia), mantendo-se a tampa sobre a seis poços enquanto a imagem.
- Usando um microscópio de fluorescência invertido equipado com uma câmera digital, capturar imagens no primeiro ponto de tempo usando uma objetiva de 10X. NOTA: Os pontos da primeira vez vai variar de acordo com experiência e pode ser o dia em que os cortes foram preparados ou qualquer ponto após o tempo.
- Capturar imagens de várias regiões no ponto de um tempo em ambas as áreas de matéria cinzenta e branca da fatia. ª Notae região fotografada por marcos específicos dentro da fatia e mapeando a localização da imagem em um esquema que pode ser utilizado para sessões de imagem subseqüentes. Marcos úteis podem incluir bordas das fatias e / ou orientação de tratos de substância branca. Imagem 4-8 locais de cada fatia em cada ponto de tempo.
- Capturar imagens subseqüentes com um intervalo de 4-6 horas se examinar a divisão celular NG2 e diferenciação de oligodendrócitos, idealmente mais de 5-7 dias.
- Capturar uma imagem final de todas as regiões e corrigir as fatias imediatamente. Adicionar 1 ml de fixador (4% PFA com 0,1 M L-lisina de meta-periodato de sódio 0,01 M) para a parte inferior da inserção de cultura e, em seguida adicionar mais 1 ml por cima das fatias. Tome cuidado para não esguichar o fixador diretamente na fatia como ela pode desprender da membrana. Fixe o tecido por 30 min e prosseguir com imuno-histoquímica utilizando marcadores específicos do estágio de desenvolvimento como descrito na seção 4.
- Fatias de lavagem com tampão de fosfato de sódio 0,2 M 3 x 10 m. Se necessário, as fatias armazenar a 4 ° C em tampão fosfato de sódio 0,2 M durante 1-3 dias antes da coloração imunológica mas idealmente realização da coloração dentro de 24 horas. Prossiga com imuno-histoquímica, como descrito abaixo na seção 4 para determinar a proporção de células que diferenciam em oligodendrócitos (Figura 2D-F).
3. Destino Mapeamento de NG2 Progênie celular usando Inducible Reporter ratos transgênicos em culturas fatia
NOTA: Para rastrear o destino das células NG2 de um momento em particular na cultura, NG2creER indutíveis: ratinhos transgénicos YFP pode ser utilizado.
- Induzir a recombinação Cre e expressão repórter pela adição de 100 nM 4OHT dissolvido em etanol ao meio de cultura. NOTA: As células positivas repórter deve aparecer dentro de 1-2 dias de indução com uma eficiência de 20-25% de células ~ YFP NG2 + + / NG2 + e neste ponto todo o tempo será células na fase de célula NG2 (Figura 2A-C)
- Fix e lavar a fatias em diferentes pontos de tempo após várias manipulações (descrita nas secções 2.5 e 2.6).
4 Slice Imunohistoquímica
- Corte as membranas com as fatias ligados fora das inserções, utilizando um bisturi.
- Transferir fatias para poços individuais de uma placa de 24 poços de solução salina contendo fosfato tamponada (PBS), utilizando um conjunto de pinças, tendo o cuidado de não perturbar a composição da fatia aquando do levantamento da membrana.
- Transferir as fatias para uma placa de 24 poços com uma solução contendo 5% de soro de cabra normal (NGS) e 0,1% de Triton-X100 em PBS durante 1 hr a bloquear.
- Incubar as fatias em anticorpo primário S / N em 5% de NGS em PBS a 4 ° C. Para identificação de células na fase de célula NG2, utilizar anticorpos para NG2 e PDGFRα. Para identificar os oligodendrócitos diferenciadas, utilizar um anticorpo para o antigénio da polipose adenomatosa coli (APC; clone CC1).
- No segundo dia de fatias de lavagem em PBS 3 x 15 min, em seguida, incuba-se Antibo secundáriomorre em 5% de NGS em PBS durante 1 h à TA. Lave as fatias em PBS 3 x15 min e montagem em lâminas. Montar com fatias para cima e membrana de frente para o slide para que a membrana não será entre o objetivo eo tecido.
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Representative Results
Exemplos de dados representativos são dadas abaixo que foram obtidos utilizando culturas fatia de ambos parte frontal do cérebro e cerebelo de P8 NG2cre: ZEG, NG2creER: YFP e PLPDsRed linhas de camundongos transgênicos. Células NG2 pode ser trabalhada ao longo de dias em fatias do cérebro anterior e cerebelo (Figura 1B-D, Vídeo 1) e o fenótipo destas células pode ser determinado após fixação e coloração imunológica com anticorpos NG2 e CC1 (Figura 1E). Além de viver de imagem, a proliferação de células também pode ser avaliada através de coloração imuno-histoquímica de marcadores de proliferação celular como Ki67 (Figura 1F). Estes dados permitem uma análise detalhada da dinâmica temporal de diferenciação de oligodendrócitos após a divisão celular NG2 em uma base célula individual. Mapeamento de destino das células NG2 pode ser levada a cabo após a indução de recombinação cre em fatias com 4OHT em NG2creER: YFP ratinhos (Figura 2). + Células-NG2 expressando repórter YFP foram found nas culturas de dois dias após a adição de 4OHT para o meio de cultura (Figura 2A). Seis dias após a indução 4OHT, uma proporção das células YFP + tinha diferenciado em CC1 + oligodendrócitos (Figura 2B). Estes dados demonstram a possibilidade de se realizar o mapeamento destino das células NG2 em fatias em que o ambiente extracelular pode ser manipulada para testar os efeitos dos fármacos ou de vários insultos sobre o destino das células NG2. Diferentes concentrações de 4OHT podem ser usadas para obter diferentes graus de recombinação cre. Por exemplo, a exposição a 100 nM durante 2 dias 4OHT provoca expressão repórter em cerca de 20-25% de todas as células que expressam NG2 1 uM enquanto 4OHT resulta em, aproximadamente, 60-70% de eficiência de recombinação. Finalmente, extensa de mielina está presente nestas culturas e oligodendrócitos myelinating pode ser trabalhada em fatias vivos e fixas usando ratinhos transgénicos PLPDsRed (Figura 3, de vídeo 2).
Figura método de cultura 1 fatia por imagiologia de longo prazo da proliferação e diferenciação de células NG2 (AB) esquemático que descreve o isolamento de fatias do cérebro anterior e do cerebelo (A) e subsequente cultura e imagiologia de lapso de tempo utilizando inserções de cultura de fatia (B). (C ) Representação delineando a divisão celular NG2 e diferenciação oligodendrocítica subsequente em NG2cre:. ratinhos transgénicos ZEG (D) as imagens Exemplo adquiridos a partir de regiões corticais de NG2cre: ratos ZEG mostrando um único GFP + célula (setas) dividindo duas vezes ao longo de um período de 122 horas, o tempo representado no canto superior direito de horas após o início da experiência de imagem (E). Fixação e imunomarcação com anti-NG2 e anticorpos CC1 da mesma fatia revela que a dividi imagéticocélulas ng resultou em três NG2 células (setas) +. (F) imagem Exemplo mostrando dois Ki67 + NG2 + células em uma cultura fatia cortical. (G) imagem Exemplo mostrando NG2 + células (setas) e seus processos interligados com NeuN + núcleos neuronais em uma cortical cultura fatia. Barras de escala de 25 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 Indução da expressão YFP para rastrear o destino das células NG2 em culturas de fatias do cérebro anterior (AB) As imagens tiradas da região do corpo caloso de culturas de fatias do cérebro anterior a partir de NG2creER: ratinhos tratados com YFP 4OHT durante 24 horas e, em seguida, deixadas em cultura durante 2 dias (A) e 6 dias (B), (A) ou CC1 e YFP (B), demonstrando a diferenciação de células positivas NG2 repórter em oligodendrócitos, enquanto na cultura de 6 dias após a recombinação cre (seta). Barras de escala de 25 um por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 oligodendrócitos de imagem em culturas fatia de camundongos transgênicos PLPDsRed. (A) Esquema representando o isolamento, cultura e imagem de fatias de cerebelo de camundongos transgênicos PLPDsRed. (B) A imagem obtida a partir de uma fatia cerebelo fixo após 5 dias in vitro mostrando calbindina + ( ciano) neurônios de Purkinje com mielinizadobásicos proteína + (MBP) (verde) axônios mielina salientes em regiões de substância branca da fatia. Scale Bar 25 m. (C) imagens capturadas baixa ampliação da mesma região a cada dois dias nos horários indicados em horas em culturas fatia do cerebelo de ratos PLPDsRed. Barra de escala de 100 um. Imagem baixa ampliação feita a partir de uma cultura de fatia PLPDsRed fixa que mostra a expressão de MBP em regiões de matéria branca onde as células são concentradas DsRed + (D). Barra de escala de 100 um (E). Imagem de alta ampliação feita a partir de uma cultura de fatia PLPDsRed fixo mostrando individuais + oligodendrócitos DsRed com processos MBP +. Scale Bar 20 m. (F) Sequência Time-lapse tirado uma fatia cerebelo PLPDsRed mostrando corpos celulares relativamente estáveis durante a sessão de imagens 48 horas, o tempo indicado no canto superior direito em horas. Scale Bar 25 m. Please, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1 Imagens ao vivo da divisão celular NG2 em uma cultura fatia cortical tempo Representante lapso de seqüência mostrando múltiplas divisões celulares em uma cultura fatia cortical retirado de um NG2cre:. Camundongo transgênico ZEG. Vídeo exibido em 5 quadros por segundo, montagem de imagens mostradas na Figura 1. (Consulte "Video_1.mov" em Downloads)
Vídeo 2 ao vivo imagens de oligodendrócitos em culturas fatia cerebelo lapso de tempo de seqüência Representante mostrando pequenas alterações na morfologia oligodendrócitos (seta) fotografada mais de 48 horas em uma fatia cerebelo tirado de um camundongo transgênico PLPDsRed. Vídeo exibido em 3 quadros por segundo, montagem de imagens mostradas na Figura 3. (Veja "Video_2.mov" em Downloads)
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Discussion
Mielinização no sistema nervoso central é essencial para a comunicação neuronal e sobrevivência eficiente axonal 22. Células NG2 gerar continuamente oligodendrócitos myelinating para a idade adulta, mantendo uma população residente na maioria das regiões do cérebro 16,23 - 25. Alguns mecanismos genéticos e moleculares que regulam a diferenciação destas células foram descritas, mas ainda há muito a ser descoberto. Culturas fatia organot�icas são uma ferramenta conveniente para investigar estes mecanismos devido às suas características únicas de manutenção regiões anatômicas, fácil manipulação do ambiente extracelular, mielinização robusta, ea presença de todos os principais tipos de células. Estas características facilitam a investigação das interações de curto e longo prazo entre as células NG2, oligodendrócitos e axônios 11,26. Além disso, o transplante de células é relativamente fácil de realizar e pode ser utilizada para investigar dependente da região dIFERENÇAS no comportamento de células 17. Além disso, os tratamentos farmacológicos podem ser adicionadas ao meio de cultura para investigar os mecanismos moleculares que influenciam a proliferação e / ou diferenciação de células normais em NG2 17,27,28 e culturas desmielinizados 15,29. Finalmente, é tecnicamente viável a utilização de culturas fatia para executar telas para análise de alto rendimento de compostos que direcionam as células NG2 a proliferar ou diferenciar, possivelmente, até mesmo depois de um insulto desmielinizante 30.
Os métodos atuais para investigar as células oligodendrócitos linhagem e suas interações com os axônios em um ambiente controlado cultura incluem co-culturas com dissociada gânglio da raiz dorsal (DRG) ou neurônios corticais embrionárias e as células NG2 31,32, que foram baseados em preparações originais desenvolvidos para investigar DRG célula -Schwann interações 33. Estas culturas foram utilizadas para investigar as propriedades fundamentais do axónio e oligodendrócitosinteracções de células de linhagem neuronal, incluindo sinalização dependente de actividade para induzir a diferenciação e a produção de mielina 32,34 - 36, além de outras questões, tais como a dependência de diâmetro e axónio proliferação controlador NG2 densidade celular e o aparecimento de diferenciação 37. Embora esses sistemas co-cultura são ideais para abordar tais questões, correlação direta e aplicação à situação in vivo nem sempre é clara. Como mencionado anteriormente, as culturas organotípicas de fatias fornecer uma condição única de manutenção de muitas das ligações neuronais locais e três citoarquitetura dimensional que são perdidos em preparações de co-cultura de células dissociadas. Além disso, ao contrário culturas fatia organotypic, os sistemas de co-cultura de células dissociadas muitas vezes não incluem outras células gliais e moléculas da matriz extracelular que têm mostrado a desempenhar papéis importantes no desenvolvimento, manutenção e fisiologia das células NG2, oligodendrócitos, E mielina. Com o dramático crescimento na variedade de ferramentas disponíveis para a rotulagem e manipulação de populações de células distintas, com vetores virais e animais transgênicos, imagens de longo prazo e mapeamento destino em culturas fatia organotypic específico deve provar ser uma técnica poderosa para a investigação de células NG2 proliferação, diferenciação e oligodendrócitos mielinização.
Várias etapas críticas devem ser realizadas durante a execução dessas experiências para garantir a sobrevivência fatia e reprodutibilidade dos dados. Em primeiro lugar, a fim de gerar cortes saudáveis, o seccionamento e isolamento de fatias devem ser realizadas tão depressa quanto possível e em tampão de dissecção gelado. Em segundo lugar, enquanto a aquisição automatizada posição da imagem com um palco motorizado em um microscópio de fluorescência pode ser útil, há muitos fatores que podem prejudicar a deslocalização precisa das regiões fotografada e manual repetida aquisição é necessário para obter imagens consistentemente confiáveis sobre multiple dias. Isto é particularmente necessário se as fatias são mantidas numa incubadora de cultura de células entre as sessões de imagem e não numa incubadora fase superior. Terceiro, durante a fixação fatia, de coloração, e a montagem é extremamente importante para lidar com as fatias delicadamente como qualquer perturbação do tecido irá resultar na incapacidade para mudar regiões vivo fotografada e células. Não há modificações específicas, métodos tradicionais utilizados para preparações de cultura fatia que são usados para estudos de astrócitos e neurônios.
Existem várias limitações no processo de cultura de fatia que deve ser considerado. Os astrócitos, microglia e células NG2 são conhecidos por responder à lesão do SNC, com o aumento da proliferação no local da lesão e na formação de uma cicatriz glial. O processo de preparação das fatias resulta em alguma reorganização e uma resposta da glia reactiva inicial a partir destas células. NG2 taxa de proliferação celular voltar a níveis semelhantes aos relatados in vivo para correspondidaestágios de desenvolvimento após vários dias em cultura no entanto, as maiores taxas de proliferação e fenótipo reativo inicial destas células devem ser consideradas na interpretação dos dados. A presença de soro de cavalo no meio de cultura pode alterar a proliferação das células NG2 e devem ser consideradas na interpretação dos resultados de qualquer experiência. Além disso, embora haja actividade neuronal espontânea, a entrada sensorial e ligações de longo alcance entre os neurónios estão em falta, o que poderia conduzir a actividade neuronal alterada dentro da fatia. Finalmente, sem a utilização de vectores virais promotoras conduzido específicos ou ratinhos transgénicos, as manipulações genéticas específicas do tipo de células dentro de sistemas de cultura de fatia é um desafio. Embora essas limitações devem ser considerados no projeto de experimentos, as culturas fatia é um sistema único que pode ser utilizado para obter novo insight sobre questões que não podem ser respondidas com culturas de células dissociadas ou no animal intacto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
References
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