Abstract
NG2 발현 세포 (polydendrocytes, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포)는 중추 신경계에서 주요한 넷째 신경교 세포 집단이다. 배아 및 출생 후의 개발하는 동안 그들은 적극적으로 증식 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이 세포는 일반적으로 기본 해리 문화, 신경 세포 공 배양 연구, 고정 조직되었다. 새로 사용 가능한 트랜스 제닉 마우스 선이 배양 시스템은 전뇌와 소뇌 모두 회색과 백질 영역에 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 증식과 분화를 조사하는데 사용될 수있는 슬라이스. 슬라이스 문화는 출생 초기 마우스에서 준비가되어 1 개월까지에 대한 문화에 보관됩니다. 이 조각은 세포의 행동과 상호 작용을 조사하기 위해 배양 기간 동안 여러 번 이미지를 만들 수 있습니다. 이 방법은 NG2의 세포 분열의 시각화와의 상세한 분석을 가능하게하고있는 동안 희소 돌기 아교 세포의 분화로 이어지는 단계 지역별 의존 할 수 있습니다천만에 NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포 기능 이질성. 이는 생체 내에서 밀접 발견 유사한 셀룰러 환경에서 시간 경과에 영향을 미치는 이러한 세포 및 극한 외부 신호를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다.
Introduction
4 - 중추 신경계 Organoytpic 슬라이스 배양 semiintact 시스템 (1)의 뉴런 및 신경교 세포 생물학을 연구하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 9 - 이러한 문화를 채택하고 세포 외 환경의 조작을 반복 장기 라이브 세포 이미징에 대한 쉬운 접근과 전기 생리 레코딩 (5)이 기본으로 해리 된 세포 배양의 많은 혜택을 유지하기가 비교적 간단하다. 또한, 슬라이스 배양 3 차원 조직 cytoarchitecture 지역 신경 연결을 유지하고, 가장 중요한 세포 유형은 시스템에 존재한다. 이러한 특성은 세포와 환경의 상호 작용으로 단일 세포의 행동과 생리를 조사하기 위해 이들 문화에 고유 한 편리한 시스템을 확인합니다.
NG2 세포 증식 및 m을 계속 생성 포유류의 중추 신경계에서 신경교 세포 집단이다배아 및 출생 후의 개발 10 동안 희소 돌기 아교 세포를 yelinating. 이들은 광범위 해리 일차 세포 배양에서 연구되었으며, NG2 형광 단백질의 세포 특이 식 트랜스 제닉 마우스 라인의 최근의 발전은 급성 슬라이스 제제의 생체 내 거동 매핑 및 전기 생리 레코딩에서 촉진했다. 비록 이러한 연구와 거의 NG2 세포 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간적 역학에 대해 공지되어있다. 해리 된 세포 배양 물을 광범위하게 약리 유전 조작에 대하여 설비를 위해 사용되지만, 그것은 세포의 미세 환경의 컨텍스트를 유지하는 것이 바람직하다 특히 다른 뇌 영역에서 이들 세포의 기능 차이를 질의에 적합하지 않다. 슬라이스 배양 세포 약리 조작에 대한 의무이며, 희소 돌기 아교 세포의 수초화 (11, 12)을 조사하기 위해 사용 된 간단한 대안을 제공(LPC)을 lysolecithin 또는 항체 약물 치료 15를 통해 탈수 초화 13, 14, 및 재유 수화 유도를 유도 한 후 신경근 응답.
방법은 조사 및 라이브 영상 및 고정 조직 (또는 postfixation) 전뇌와 소뇌에서 모두 촬영 Organotypic 슬라이스 문화의 NG2 세포의 증식 및 희소 돌기 아교 세포의 분화의 분석 설명을 수행 할 수 있습니다. 이 16 분할 한 후 NG2 세포 세포의 운명을 연구하고 성장 인자 유도 NG2 세포 증식 17 인 지역, 연령 의존적 차이를 발견하는데 사용될 수있는 강력한 방법이다. 이 상대적으로 간단한 기술은 또한 고유 및 / 또는 환경이 아교 세포의 생리학 및 신경 세포의 활동이나 수초의 손상에 대한 반응을 조절하는 메커니즘을 세포를 조사하기 위해 광범위하게 액세스 할 수 있습니다.
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Protocol
주 : 모든 동물의 절차는 지침을 따르고 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고 : YFP 기자 20 (JAX 번호 006148) 선이 각각 사용되었다 : NG2cre 18 구성 적 (JAX # 008533)와 NG2creER 16 유도 이러한 실험 (JAX 번호 008538)의 경우 형질 전환 마우스는 19 (JAX은 # 003920) 또는 gtRosa26 / EG Z에 교차 화상 NG2 세포 및 그 자손. 희소 돌기 아교 세포로 성숙 화상, PLPDsRed 트랜스 제닉 마우스 (21)를 사용 하였다. 일관성 생존을 위해, 조각까지 전뇌와 소뇌 모두에서 출생 일 10 생쥐에서 분리 할 수 있습니다.
1 조각 준비
- 문화 후드에서 여섯 잘 접시에 조직 배양 삽입을 배치하고 (시약 섹션에서 레시피) 1 ml의 슬라이스 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. 5 %와 37 ° C에서 해부하기 전에 CO 2 적어도 2 시간을 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣습니다.
- 70 % 에탄올에서 모든 도구와 조직 초퍼 멸균.
- 이전 해부의 시작 적어도 15 분 동안 얼음에 95 % O 2, 5 % CO 2와 버블 해부 버퍼 (시약 섹션에서 레시피).
- 승인 된 동물 프로토콜에 따라 5 ~ 10 분 동안 얼음에 배치하여 마우스 새끼를 마취. 쥐 꼬리와 발가락 핀치에 응답하지 않는 것을 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인하라.
- 동물 프로토콜을 다음 예리한 가위를 사용하여 동물을 참살. 빨리 첫번째 살균 도구를 사용하여 횡 절개 다음에 시상 컷을하여 전뇌와 소뇌를 통해 두개골을 제거합니다. 조심스럽게 옆으로 조직을 압연하여 뇌와 소뇌의 복부 표면에서 두개골 신경을 잘라.
- 얼음처럼 차가운 산소 해부 버퍼를 포함하는 멸균 35mm 접시에 조직을 배치합니다.
- 면도날을 사용하여, 소뇌 및 전뇌 단절. 그런 다음 중간 시상 컷 죽을반구를 분리 우 전뇌와 소뇌.
- 수동 조직 헬기와 전뇌와 소뇌의 300 μm의 두께의 관상 및 시상 부분을 잘라. 참고 : 수동 조직 헬기 아가로 오스 삽입 할 필요없이 문화 부화 해부에서 신속하게 처리 할 수 있습니다. 앞서 설명한 바와 같이 9 vibratome도 사용될 수있다.
- 얼음에 갓 버블 차가운 해부 버퍼로 분리 된 조각을 전송합니다.
- 작은 해부를 사용하거나 개별 섹션을 분리하고 배양 삽입과 여섯 잘 요리를 미리 배양로 전송 주걱 무게.
- 일회용 전송 피펫 또는 P 200 피펫 팁을 사용하여 문화 삽입물의 표면에서 초과 해부 버퍼를 제거합니다. 세 전뇌 또는 세 소뇌 조각에 두 하나의 문화 삽입에 배치 할 수 있습니다.
참고 : 전뇌 문화와 일치하는 결과를 얻기 위해서 (때문에)는 전방에게 뇌량의 3 분의 1에 걸쳐 조각을 위해 이상적입니다동일한 슬라이스에 모두 회색과 흰색 문제 영역을 공부하기 위해 (그림 1A). 각 동물은 일반적으로 6 전뇌 슬라이스와 6 소뇌 조각을 얻을 수 있습니다. - 인큐베이터에있는 여섯 잘 접시를 놓고 다음 일 일일 슬라이스 준비 후 슬라이스 매체의 ML 슬라이스 고정 될 때까지 다른 모든 일에 슬라이스 매체를 교체합니다.
- 실험에 따라, 문화 5-7 일 후에 조각을 사용합니다. 처음 몇 일 후에 투명하게 조각을 사용하여 요철이 불투명 한 영역을 가지고 그 사람들을 버린다. 참고 : 슬라이스 내에서 불투명 한 영역은 눈으로 볼 수 있으며, 위상차에서 어두운 세포의 덩어리로 나타납니다. 기술이 습득 한 후에, 죽은 불투명 조각 조각 미만 1-5%에서는 거의 발생하지 않는다.
NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포 분화 2 타임 랩스 영상
참고 : 경제의 제로 성장 생쥐 16 : 우리가 NG2cre를 사용 NG2 세포의 증식과 분화의 시간 경과 이미징을 수행하려면NG2 세포 및 그 자손 (도 1C-E)에서 EGFP를 발현한다. 이 줄 리포터 발현 즉시 적어도 4주의 기간 동안 후 단면 슬라이스 라이브 GFP + 세포의 이미지를 획득 할 수있을만큼 충분히 튼튼하다. 깨끗한 이미지는 문화의 첫 번째 3-5일을 통해 발생하는 슬라이스의 초기 숱이 기간 이후에 얻을 수있다.
- 실험을하는 동안, 37 ° C에서 세포 배양 인큐베이터에서 조각을 유지하고 시간의 짧은 기간 만 제거 (슬라이스 미만 15 분), 육 웰 플레이트 동안 영상에 뚜껑을 유지.
- 디지털 카메라를 구비 한 반전 된 형광 현미경을 사용하여, 10 배 대물 렌즈를 사용하여 첫 번째 시점에서 이미지를 캡처. 참고 : 처음 지점이 실험에 의해 달라지며 조각이 제조되었다 일 또는 후 어느 시점이 될 수 있습니다.
- 슬라이스의 두 회색과 흰색 물질 분야에서 시점 일에 여러 지역의 이미지를 캡처합니다. 주 일슬라이스 내의 특정하여 도시 및 후속 이미징 세션에 사용할 수있는 이미지에 개략적 위치를 매핑하여 전자 묘화 영역. 유용한 랜드 마크 백질 책자의 조각 및 / 또는 방향의 모서리를 포함 할 수 있습니다. 콘텐츠 각 시점에서 각 조각에 위치 4-8.
- 4-6 시간 간격으로 연속 된 이미지를 캡처 NG2의 세포 분열 및 희소 돌기 아교 세포의 분화, 이상적 통해 5~7일 검사하는.
- 모든 지역의 최종 이미지를 캡처하여 즉시 조각을 수정. 다음 조각 위에 다른 하나를 가하여, 문화 삽입의 바닥 (0.1M L-라이신 0.01 M 나트륨 메타 요오드와 4 % PFA) 고정액의 한 ML을 추가합니다. 그것은 막에서 분리 할 수 있습니다로 슬라이스에 직접 정착 물총 않도록주의하십시오. 30 분 동안 조직을 수정하고 4 절에 설명 된대로 발달 단계 특정 마커를 사용하여 면역 조직 화학 진행합니다.
- 0.2 M 인산 나트륨 완충액 3 × 10m 씻을 조각인치 1-3일 0.2 M 인산 나트륨 완충액에서 4 ° C에서 필요한 저장하기 전에 조각은 면역 염색한다면 이상적으로 24 시간 내에 염색을 수행합니다. 희소 돌기 아교 세포 (그림 2D-F)로 분화 한 세포의 비율을 결정하기 위해 4 장에 아래와 같이 면역 조직 화학 염색을 진행합니다.
슬라이스 문화에 유도 성 기자 형질 전환 마우스를 사용 NG2 세포 자손의 3 운명 매핑
주 : 문화 특정 시점에서 NG2 세포의 운명을 추적하기 위해, 유도 NG2creER : YFP 트랜스 제닉 마우스를 사용할 수있다.
- 배지에 에탄올 100 나노 4OHT 추가하여 Cre 호텔 재조합 및 리포터 발현을 유도한다. NOTE : 리포터 양성 세포는 모든 NG2 세포 단계에서 세포 것이다 ~ 20-25% YFP + NG2 + / NG2 + 세포의 유도 효율이 시점에서 1~2일 내에 표시한다 (도 2A-C)
- 수정하고 슬라이스를 씻어상이한 시점에서의 각종 조작 후 (섹션 2.5 및 2.6에 기재되어 있음).
4 슬라이스 면역 조직 화학
- 메스를 사용하여 삽입에서 부착 된 조각 세포막을 잘라.
- 멤브레인 픽업시 슬라이스의 조성물을 방해하지 않도록주의하면서, 핀셋의 세트를 이용하여 24 웰 플레이트에 함유하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 중 각각의 웰에 조각을 전송.
- 1 시간 동안 PBS에서 5 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 0.1 % 트리톤 - X100을 포함 차단 솔루션과 24 웰 플레이트에 조각을 전송합니다.
- 4 ° C에서 PBS에서 5 % NGS에 / 차 항체 O에서 N을 슬라이스를 품어. NG2 세포 단계에서 세포를 식별하기위한, 그리고 NG2 PDGFRα 대한 항체를 사용. 희소 돌기 아교 세포 분화를 확인하기위한, 선종 성 용종증 콜라이 항원에 대한 항체를 사용하여 (APC; 클론을 CC1).
- PBS 3 X15의 분에서 두 번째 일 세척 슬라이스에서 다음 차 antibo에 품다RT에서 1 시간 동안 PBS 중 5 %에서 NGS 죽는다. PBS 3 X15 최소의 조각을 세척하고 슬라이드에 탑재합니다. 멤브레인 대물과 조직 사이되지 않도록 슬라이드 대향 조각 위로 막 마운트.
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Representative Results
대표 데이터의 예는 다음과 같습니다 P8 NG2cre의 전뇌와 소뇌에서 모두 슬라이스 문화를 사용하여 획득 한 것을 : 경제의 제로 성장, NG2creER : YFP를 형질 전환 마우스 라인을 PLPDsRed. NG2 세포 전뇌와 소뇌 조각 (그림 1B-D, 비디오 1) 이러한 세포의 표현형 일 동안 이미지를 만들 수는 고정 후 결정 NG2와 CC1 항체 (그림 1E)과 면역 염색 할 수 있습니다. 이미징 사는 또한 세포 증식은 또한 Ki67 (도 1F)와 같은 세포 증식 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 이러한 데이터는 개개의 세포 기초 NG2의 세포 분열 후에 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간의 상세한 역학 분석을 허용한다. YFP 마우스 (도 2) : NG2 세포의 운명 매핑 NG2creER에 4OHT와 슬라이스에 CRE 재조합 유도 한 후에 수행 될 수있다. YFP 리포터 발현 NG2의 + 세포는 fo를이었다이일 배양 배지 (그림 2A)에 4OHT의 첨가 후 문화 싶게. 식스 일 4OHT 유도 한 후, YFP + 세포의 비율은 CC1 + 희소 돌기 아교 세포 (그림 2B)로 분화했다. 이러한 데이터는 세포 외 환경이되는 약물 또는 NG2 세포의 운명에 다양 욕설의 효과를 테스트하기 위해 조작 될 수있는 조각에 NG2 세포의 운명 매핑을 수행하는 가능성을 보여준다. 4OHT의 상이한 농도는 CRE 재조합의 상이한 정도를 달성하기 위해 사용될 수있다. 1μM 4OHT 약 60~70% 재결합 효율의 결과 예를 들어, 2 일간 100 nM의 4OHT 노출 모든 NG2 발현 세포의 약 20~25%에서 리포터 발현시킨다. 마지막으로, 광범위한 수초는 이러한 문화에 존재하고 myelinating 희소 돌기 아교 세포 (그림 3, 비디오 2) PLPDsRed 형질 전환 마우스를 사용하여 라이브 및 고정 조각에서 이미지를 만들 수 있습니다.
NG2 세포 증식 및 분화 (AB) 도식 슬라이스 배양 삽입물을 사용 전뇌와 소뇌 조각 (A) 및 후속 배양하고 시간 경과 영상의 분리를 묘사 한 (B)의 장기 이미징도 1 슬라이스 배양법. (C ) NG2cre에 NG2의 세포 분열 이후의 희소 돌기 아교 세포의 분화를 요약 묘사 :. 피질 NG2cre 지역에서 얻은 경제의 제로 성장 형질 전환 마우스를 (D) 예 이미지 : 122 시간에 걸쳐 두 번 분할 한 GFP + 세포 (화살표)를 보여주는 경제의 제로 성장 마우스, 시간 묘사 안티 NG2와 동일한 슬라이스의 CC1 항체와 면역 염색 (E) 고정. 이미징 실험 시작 후 시간 등의 오른쪽 상단 모서리에 계시 그 이미지로 만들어진 dividi겨 세포는 세 NG2 + 세포 (화살표)되었습니다. (F) 예제 이미지는이 Ki67을 보여주는 + NG2 + 대뇌 피질에 NeuN + 신경 세포의 핵 좌우 대뇌 피질의 슬라이스 문화에 세포. (G)의 예를 보여주는 이미지 NG2 + 세포 (화살촉)과 프로세스 슬라이스 문화. 스케일 바 25 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
YFP 식의 그림 2 유도는 전뇌 슬라이스 문화 NG2 세포 (AB) NG2creER에서 전뇌 슬라이스 문화의 뇌량 지역의 촬영 이미지의 운명을 추적 할 수 : 2 문화 속에서 24 시간 동안 4OHT로 처리 한 다음 왼쪽 YFP 마우스를 일 (A) 또는 육일 (B) (A) 또는 CC1 및 YFP (B)에 대한 면역 염색 하였다. 스케일 바 25 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PLPDsRed 형질 전환 마우스에서 슬라이스 문화 그림 3 이미징 희소 돌기 아교 세포는. (A) 도식 배양 및 PLPDsRed 형질 전환 마우스의 소뇌 조각의 영상, 고립을 묘사. 체외 보여주는 calbindin +에서 오일 후 고정 소뇌 조각에서 촬영 (B) 이미지 ( 유수와 시안) 조롱박 신경 세포슬라이스의 백질 영역으로 돌출 수초 기본 단백질 + (MBP) (녹색) 축삭. 스케일 바 25 μm의. PLPDsRed 쥐에서 소뇌 슬라이스 문화 시간에 표시된 시간에 매일 같은 지역에서 캡처 (C) 낮은 배율 이미지. 스케일 바 100 μm의. (D)는 DsRed + 세포가 집중되어 백질 지역에서 MBP 식을 나타내는 고정 PLPDsRed 슬라이스 문화에서 가져온 낮은 배율 이미지. MBP + 프로세스와 하나의 DsRed의 + 희소 돌기 아교 세포를 나타내는 고정 PLPDsRed 슬라이스 문화에서 가져온 스케일 바 100 μm의. (E) 고배율 이미지. 스케일 바 20 μm의. 48 시간 영상 세션을 통해 상대적으로 안정적인 세포 기관을 나타내는 PLPDsRed 소뇌 조각에서 촬영 (F) 시간 경과 순서, 시간에 오른쪽 상단에 표시된 시간입니다. 스케일 바 25 μm의. 항변SE는이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대뇌 피질의 슬라이스 문화 NG2의 세포 분열의 비디오 1 라이브 영상 NG2cre에서 찍은 대뇌 피질의 조각 문화의 여러 세포 분열 보여주는 대표 시간 경과 시퀀스 :. 경제의 제로 성장 형질 전환 마우스를. 동영상은 초당 5 프레임, 그림 1에 표시된 이미지의 몽타주에 표시. (다운로드에서 "Video_1.mov"을 참조하십시오)
비디오 소뇌 슬라이스 문화 희소 돌기 아교 세포의 2 라이브 영상 PLPDsRed 형질 전환 마우스에서 찍은 소뇌 슬라이스에서 48 시간 동안 몇 군데 희소 돌기 아교 세포의 형태 (화살표)의 작은 변화를 보여주는 대표적인 시간 경과 시퀀스. 동영상은 초당 3 프레임, 그림 3과 같이 이미지의 몽타주에 표시. (다운로드에서 "Video_2.mov"을 참조하십시오)
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Discussion
중추 신경계의 수초화 효율적으로 신경 세포의 통신 및 축삭의 생존 22 필수적이다. 25 - 대부분의 뇌 영역 16,23의 거주 인구를 유지하면서 NG2 세포는 지속적으로 성인에 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이러한 세포의 분화를 조절 일부 유전 및 분자 메커니즘을 설명했지만 많이 발견되고 남아있다. Organotypic 슬라이스 배양 인해 해부학 영역, 세포 외 환경의 쉬운 조작 견고 수초화, 모든 주요 세포 유형의 존재를 유지하는 자신의 고유 한 특성으로 이러한 메커니즘을 조사하기 편리한 도구이다. 이러한 특성은 NG2 세포, 희소 돌기 아교 세포와 축삭 11,26 사이의 단기 및 장기 작용의 조사를 용이하게한다. 또한, 세포 이식은 수행하기가 비교적 용이하고 의존적 D 영역을 조사하는데 사용될 수있다셀 동작을 17 ifferences. 또한, 약리학 적 치료는 정상 17,27,28 NG2에서 세포 증식 및 / 또는 분화에 영향을 미치는 분자 메커니즘과 탈수 초 배양 15,29 조사를 배지에 첨가 할 수있다. 마지막으로, 아마도 심지어 탈수 초성 모독 30 후에, 증식 또는 분화하는 세포 NG2 직접 화합물의 높은 처리량 스크린 분석을 수행하기 위해 슬라이스 배양 물을 사용하는 것이 기술적으로 가능하다.
현재의 방법은 통제 된 문화 속에서 축삭와 희소 돌기 아교 세포 계통의 세포와의 상호 작용을 조사 DRG를 조사하기 위해 개발 된 원래의 준비를 기반으로했다 해리 후근 신경절 (DRG) 또는 배아 대뇌 피질의 신경 세포와 NG2 세포 (31, 32)와 함께 공동 문화를 포함하는 -Schwann 셀 (33)의 상호 작용. 이러한 문화는 축삭 및 희소 돌기 아교 세포의 기본적인 특성을 조사하기 위해 사용되어왔다이러한 축삭 직경 NG2 셀 밀도 제어 증식 의존성과 분화 (37)의 시작으로 다른 질문 외에 36 - 신경 활성 의존적 시그널링을 포함 혈통 세포 상호 작용은 분화 및 미엘린 생산보기 (32, 34)을 유도한다. 이러한 공 배양 시스템은 이러한 문제, 생체 내 상황에 대한 직접 상관 및 응용을 해결하는 것이 이상적이지만 항상 명확한 것은 아니다. 앞서 언급 한 바와 같이, Organotypic 슬라이스 문화는 해리 세포의 공동 문화의 준비에서 길을 잃었 로컬 신경 연결과 세 차원 cytoarchitecture의 많은 유지의 독특한 조건을 제공합니다. 또한 Organotypic 슬라이스 배양 달리 해리 세포의 공동 배양 시스템은 종종 다른 신경 교세포 및 NG2 세포의 개발, 유지 및 생리학에서 중요한 역할을하는 것으로 한 세포 외 매트릭스 분자, 희소 돌기 아교 세포를 포함하지 않는및 수초. 특정 라벨 및 바이러스 벡터 및 형질 전환 동물, 장기 이미징 및 Organotypic 슬라이스 문화의 운명 매핑 별개의 세포 집단의 조작을 위해 사용할 수있는 도구의 다양한 극적인 성장과 함께 NG2 셀의 조사를 위해 강력한 기술로 증명해야 증식, 분화 및 희소 돌기 아교 세포의 수초화.
슬라이스 생존 및 데이터의 재현성을 보장하기 위해 이러한 실험을 수행 할 때 몇 가지 중요한 단계가 수행되어야한다. 첫째, 건강한 슬라이스, 단면 및 슬라이스의 격리를 생성하기 위해 가능한 한 얼음 차가운 해부 버퍼에 신속하게 수행해야합니다. 형광 현미경에 전동 무대 자동화 된 이미지의 위치 수집이 유용 할 수 있지만 둘째, 이미징 및 수동 반복 인수 지역의 정확한 재배치를 방해 할 수있는 많은 요인 multipl을 통해 지속적으로 안정적인 이미지를 얻을 필요가있다 아르전자 일. 슬라이스는 영상 세션 사이가 아닌 무대 위에 인큐베이터에서 세포 배양 인큐베이터에 보관하는 경우에 특히 필요하다. 셋째, 슬라이스 고정, 염색, 및 설치하는 동안은 조직의 중단 라이브 군데 지역과 세포를 재배치 할 수 없게되므로 부드럽게 조각을 처리하기 위해 매우 중요합니다. 신경 세포와 성상 세포의 연구에 사용되는 슬라이스 문화의 준비에 사용되는 전통적인 방법에 대한 구체적인 수정 사항이 없습니다.
고려되어야 슬라이스 배양 방법에 대한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 성상 세포, 미세 아교 세포 및 NG2 세포는 증가 된 손상 부위에서 증식 및 아교 흉터의 형성과 CNS 손상에 반응하는 것으로 알려져있다. 일부 재구성에 슬라이스 결과 및 이들 세포의 초기 반응성 신경교 응답 제조 방법. 유사한위한 NG2 세포 증식 속도는 생체 내에서보고 된 것과 유사한 수준으로 돌아데이터를 해석 할 때 배양 그러나 증가 된 증식 속도 및 이들 세포의 초기 반응성 표현형 며칠 후에 개발 단계가 고려되어야한다. 배지에서 말 혈청의 존재는 NG2 세포 증식을 변경할 수 있으며, 모든 실험의 결과를 해석 할 때 고려되어야한다. 이 외에도, 슬라이스 내에서 변경된 신경 활성의 원인이 자발적 신경 활성, 감각 뉴런과 입력 사이의 장거리 연결을 결여되고,이된다. 마지막으로, 슬라이스 배양 시스템 내의 특정 프로모터 구동 바이러스 벡터 또는 형질 전환 마우스, 세포 유형 특이 유전자 조작의 사용없이 도전. 실험을 설계 할 때 이러한 제한이 고려되어야하지만, 슬라이스 문화는 해리 세포 배양 또는 손상 동물에 대답 할 수없는 질문에 새로운 통찰력을 확보하는 데에 이용 될 수있는 독특한 시스템입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | 25mM |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 1mM |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | 1mg/L |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 0.4mM |
| Horse Serum | Hyclone | SH30074.03 | 25% |
| Titrate to pH 7.22 with NaOH, filter with bottle top filter, and store at 4 degrees Celsius | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| Filter with bottle top filter and store at 4 degrees Celsius, oxygenate with 95%O2 5%CO2 before use | |||
| Other Reagents and Supplies | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| Paraformaldehyde (PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L-6027 | 0.1M |
| Sodium Metaperiodate | Sigma-Aldrich | S-1878 | 0.01M |
| Rabbit anti NG2 antibody | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| Mouse anti CC1 antibody | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| Mouse anti Ki67 antibody | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| Mouse anti NeuN antibody | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| Species specific secondary antibodies | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Millicell culture membrane inserts 0.45μm pore size | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| Bottle top filters | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Ethanol | |||
| 95% O2 5% CO2 gas mix | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| Sterile six well plates | |||
| Dissecting (hippocampal) or weighing spatulas | |||
| Manual or automatic tissue chopper | |||
| Razor blades | |||
| Disposable transfer pipettes | |||
| 35mm and 60mm sterile Petri dishes | |||
| Stereomicroscope | |||
| Inverted Phase Microscope | |||
| Laminar Flow Hood | |||
| Tissue Culture Incubator | |||
| Inverted Fluorescence Microcope | |||
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