Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Forbedret i-gel Reduktive β-Elimination for Omfattende O-bundne og sulfo-Glykobiologi ved massespektrometri

Published: November 20, 2014 doi: 10.3791/51840
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1,2, 1
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

Introduction

Glycosylering er et essentielt protein posttranslationel modifikation, der bidrager til organismal fysiologi, væv patologi og cellulær genkendelse 1-3. Til trods for store fremskridt i analytisk glycoscience, karakteriserer den komplette mangfoldighed glykaner på et specifikt protein fortsat er et særdeles udfordrende opgave, især på proteiner isoleret fra primære biologiske kilder. Ikke desto mindre, mikroheterogeniteten glycoproteinkomponenter glycaner ofte påvirker funktionelle interaktioner med andre proteiner. Derfor er væsentlige for forståelsen af fysiologiske betydning af cellulær og væv glycosylerings 4,5 karakterisering af glykan mangfoldighed. For at forstå bidrag glycoprotein glycosylering væv fysiologi og patofysiologi, robust, følsomme, og omfattende glycomic analytiske teknikker er blevet stadig vigtigere. I proteomanalyse er protein identifikationer generelt opnås ved LC-MS/ MS-analyse af tryptiske peptider 6. Proteinfordøjelsen kan udføres under anvendelse af et oprenset protein eller proteiner løst ved SDS-PAGE efter i-gel fordøjelse med proteaser, såsom trypsin 7-9. Pre-berigelse af proteinblandingen ved SDS-PAGE øger dybden og nøjagtigheden af ​​protein ID. Udviklingen af ​​analoge strategier for glycomic analyse af glycoprotein glycosylering ligger på forkant med glycoscience.

De to hovedklasser af glycaner er knyttet til protein backbone enten gennem N-binding eller O-binding. N-forbundne glycaner er bundet til asparagin (Asn) rester findes som en del af en sequon defineret som Asn-X-Ser / Thr / Cys (X er en vilkårlig aminosyre bortset fra prolin), og kan frigives ved enzymatisk fordøjelse med peptid-N -glycanase (PNGaseF eller A), enten i opløsning, i-gel eller på blot 10-12. O-bundne glykaner er hovedsagelig bundet til serin (Ser) eller threonin (Thr) -rester. Imidlertid har kun ét enzym blevet identificeret som er i stand til at frigive O-bundne glycaner fra glycoprotein, og det har en yderst begrænset glycan specificitet, frigiver kun de simpleste O-bundne glycaner. Kemisk frigivelse strategierne stadig den foretrukne metode for en omfattende frigivelse af O-bundne glycaner fra glycoproteiner. Reduktiv eller ikke-reduktiv β-elimination, eller hydrazinolyse er godt karakteriserede kemisk frigivelse teknikker og er i dag de mest anvendte metoder til at frigive O-bundne glycaner fra glycoproteiner 13,14. Selv reduktiv β-eliminering er blevet anvendt til at frigive O-bundne glycaner fra glycoproteiner adskilt ved SDS-PAGE, tidligere fremgangsmåder kræves HPLC-separation til efterfølgende analyse 15-17.

Multidimensional MS (MS n) analyse giver i øjeblikket den rigeste kilde til strukturelle data til karakterisering glycaner frigivet fra glycoproteiner isoleret i de beløb, der forventes fra de fleste biologiske kilder. Dybden af ​​MS-baseret strukturel karakterisering lettes meget ved permethylating de frigivne glykaner forud for deres analyse. Permethylering forbedrer ionisering og har tendens til at udligne molære signalrespons på tværs af en bred vifte af glycanstrukturer 18,19. Derudover permethylering utvetydigt tags terminal- og monosaccharid dele med markante masserne og dermed forbedre den strukturelle belysning 20-23. For eksempel, er generelt svære at opdage, da ikke-permethyleret arter ved MS sure glykaner. Selvom sure glycaner kan detekteres i negativ ion-mode af MS, er det umuligt at detektere både sure og neutrale glycaner i samme ion-mode. En stor fordel ved glycan permethylering er, at alle de frie hydroxylgrupper (OH) på en glycan s monosaccharid substituenter vil blive afsluttet med en methylgruppe (OCH3 eller OMe), således en sialylerede glykan anklager neutraliseres, hvilket gør dem opdages som permethyleret neutral (AsienLO) glykaner. Men hydroxyler sulfatgrupper på sulfoglycans er resistente over for permethylering, hvilket resulterer i tilbageholdelse af anionisk ladning, der undertrykker ionisering og nedsætter følsomheden. Denne undertrykkelse forhindrer i øjeblikket omfattende glycomic analyse af meget komplekse glycoproteiner såsom muciner, som bærer en stor overflod af sulfaterede glykaner 24-26.

Nylige rapporter om rensende sulfaterede glykaner anvendte opladet, omvendt fase chromatografi at rense og separate permethyleret glykaner før MALDI analyse. Denne metode bygger på fuldstændig adskillelse af sulfaterede og ikke-sulfaterede glykaner ved hjælp af forskellige mobile faser for eluering, som vi har fundet at være lempeligere end organiske fase partitionering. Derfor er nye teknikker, der er egnede til påvisning og berigelse af sulfoglycans præsenteres her. Disse teknikker gør det muligt for kvantitativ genvinding af sulfaterede glycaner i den vandige fase efter vand: DCM (dichlormethan)ekstraktion, som rutinemæssigt udføres ved afslutningen af glycan permethylering reaktioner 27. Vigtigere er det, denne robuste adskillelse af permethylerede sulfoglycans fra en blanding af permethylerede non-sulfaterede glykaner samtidig beriger for ladede arter samtidig forenkle MS 2 fragmenteringsmønstre. En omfattende protokol for forbedret i-gel O-bundet glycan analyse præsenteres også. Den forbedrede protokol forbedrer glycan genopretning, øger den strukturelle information fås via MS n analyse af permethylerede glykaner og forbedrer følsomheden af sulfoglycomic analyser anvendes til væsentlige glycoproteiner isoleret fra biologiske kilder.

Denne protokol er beregnet til O-koblet glycan analyse af hele glycoprotein ekstrakter eller for et bestemt glycoprotein af interesse løses ved SDS-PAGE og er sammensat af tre eksperimentelle procedurer; A) gel oprydning, B) i-gel reduktiv β-elimination, og C) glycan permethyning. Målet er at opnå fuldstændige O-bundne glycomic data for glycoproteiner høstet fra primære kilder af biologisk interesse (figur 1). Glycoproteiner adskilt ved SDS-PAGE visualiseres ved farvning og bånd af interesse udskæres og den resulterende gel båndet skæres i små stykker. Gelstykkerne er affarvet og underkastet ethylacetat vasker for at fjerne forureninger gel (figur 2A). Glycan frigivelse opnås ved in-gel reduktiv β-eliminering (figur 2B), og de ​​frigivne glycaner er permethyleret. Vandige organiske ekstraktion efter permethylering kvantitativt opdeler de anioniske sulfaterede glykaner væk fra ikke-sulfaterede neutrale glykaner (figur 2C). In-gel reduktiv β-eliminering koblet til vandige organiske ekstraktion muliggør karakteriseringen af ​​O-bundne glycaner og sulfoglycans frigivet fra små mængder af glycoprotein separeret ved SDS-PAGE. Den strategisk overblik er summarized i figur 1 og detaljer er vist i figur 2. Desuden kan en del af affarvet og vasket gelstykker anvendes til protein ID ved standard LC-MS / MS proteomiske teknikker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Lab Sikkerhedsspørgsmål

I overensstemmelse med standardlaboratoriemetoder bedste praksis, observere følgende. Opbevar alle organiske opløsningsmidler i passende steder. Hold alle affaldsmaterialer i kemiske affaldsbeholdere med tydelig mærkning af kemiske sammensætninger. Da flere reagenser, der anvendes i disse protokoller er potentielle kræftfremkaldende stoffer eller generere flygtige brændbare gasser, håndtere alle reagenser i et stinkskab med ventilation. Bær personlige værnemidler såsom handsker, kittel og beskyttelsesbriller, når der arbejdes med organiske opløsningsmidler.

Figur 1
Figur 1. Procedure for i-gel O-Glykobiologi. (A) Proteiner af interesse løses ved SDS-PAGE, påvises ved passende farvningsprocedurer (Coomassie eller sølv), og udskåret. Udskårne gel stykker er skåreti små tern, affarvet og vasket med ethylacetat for at reducere forureninger, der interfererer med efterfølgende MS-analyse. En del af gelen skive kan reserveres i-gel tryptisk fordøjelse og efterfølgende proteomisk karakterisering ved LC-MS / MS. (B) O-bundne glykaner frigives fra løst glycoproteiner ved in-gel reduktiv β-elimination. Væsentlige skridt omfatter afsaltning og borat fjernelse ved azeotrop med methanol. (C) O-bundne glycaner frigivet ved reduktiv β-eliminering permethyleret og efterfølgende opdelt i vandige og organiske faser. Sulfoglycans kvantitativt inddrives i den øverste (vandige) fase, mens neutrale og sialylerede glykaner partition i den nederste (DCM) lag.

Figur 2
Figur 2. Detalje rutediagram for i-gel Glykobiologi. Hver eksperimenterendetal trin vist i figur 1 er individuelt illustreret. (A) gel affarvning og EtOAc ekstraktion, (B) direkte i-gel reduktiv β-elimination for O-bundet glycan release, og (C) permethylering og fase partition. Klik her for at se en større udgave af figuren.

1. Gel udskæring og fjernelse af Gel-afledte Forurenende stoffer

  1. Inden du starter procedure, udarbejder kemikalier og reagenser, der er opført i Materials List.
  2. Løse protein på SDS-PAGE-gel ved anvendelse af standard Tris-Glycin puffersystemer. Stain løst proteiner med enten Coomassie Brilliant Blue eller sølvfarvning. I almindelighed, nyttiggørelse af O-bundne glykaner fra sølvfarvede geler er ca. 80-90% af den opnåede fra Coomassie opsving farvede geler.
  3. Efter elektroforese placere gelen på en glasplade og punktafgifter than område af interesse ved hjælp af en ren skalpel eller barberblad.
  4. For at øge udbyttet af O-glycans overføre gelen båndet af interesse på en anden glasplade og skære udskårne gel stykke ind i ca. 2 mm terninger. Undgå at gelstykker mindre end 1 mm terninger fordi glykan opsving er reduceret. Overføre de små gelstykker i skruelåg glasrør (13 x 100 mm) med en rustfri stål microspatel.
  5. Tilsæt 1 ml 25 mM ammoniumbicarbonat (AMBIC, NH 4 HCO 3) til prøverøret, cap glasrør med en Teflon-foret skruelåg cap, og bland forsigtigt ved at knipse røret før lade stå i 10 min. Ikke anvende kraftig omrøring for at undgå at rive gelstykkerne.
  6. Fjern forsigtigt AMBIC fra glasrøret ved hjælp af enten en Pasteur glaspipette eller en pipette er udstyret med en ekstra lang plastik tip. Undgå at smadre og overføre de små gelstykker samtidig fjerne den AMBIC løsning.
  7. Tilsæt 1 ml acetonitril (ACN) tilglasrør, cap, og bland forsigtigt ved at svirpe rør før lade stå i 10 min. Sørg for, at gelstykkerne er helt dækket med opløsningsmiddel. Skub om nødvendigt gelstykker off af rørvæggen og ind opløsningsmiddel med pipette spids.
  8. Pipette off ACN fra glasrøret og gentag trin 1,5-1,7 indtil den lyse blå farve er elimineret. Gentag mindst fem sekventielle AMBIC / ACN vaske hvis det er nødvendigt. For sølvfarvede geler, skal du bruge en affarvning kit. Fortsæt til næste trin, når gelstykket vender ensartet hvidt, mens i ACN.
  9. Pipette off enhver væske fra reagensglas, rekapitulere røret, tilsæt 1 ml AMBIC og lad stå i 5 min.
  10. Fjern AMBIC og tilsæt 2 ml ethylacetat (EtOAc) til glasrør. Recap rør med Teflon-foret hætte og den anbringes ved 4 ° C natten over med ende-over-ende agitation eller alternativt udføre tre EtOAc vaske ved stuetemperatur i 30 minutter hver. Jo længere EtOAc vask, en mere effektiv fjernelse af forurenende stoffer.
  11. Fjerneden endelige EtOAc vaske og udføre tre vaske hver med 2 ml H 2 O. Fuldstændig fjernelse af EtOAc vil sikre en robust reduktiv β-elimineringsreaktion.
  12. Pipettere off H2O og dehydrere gelen ved vask en gang med 1 ml ACN.
    BEMÆRK: Efter tørring de dehydratiserede geler er klar til i-gel β-elimination. Dehydrerede gelstykker kan opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
  13. Stop vaskeprocessen på ethvert trin og gemme gelstykkerne ved 4 ° C natten over, uanset hvilken buffer eller opløsning påføres gel (AMBIC, ACN, H 2 O). Genstart prøveforberedelse anytime inden for de næste 2 dage.
  14. Bruge en del af affarvet og dehydrerede gelstykker for protein ID ved standard proteomiske metoder.

2. In-gel O-glycan Frigivelse ved Reduktiv β-Elimination

  1. Fremstille en stamopløsning af 1 M natriumhydroxid (NaOH) ved anvendelse af 50% NaOH eller fast NaOH og opbevares ved 4 ° C indtil anvendelse. Tage 5,2 ml 50% NaOH (eller 4 g fast NaOH) og justere volumen til 100 ml at 1 M NaOH-opløsning. 1 M NaOH stamopløsning til 100 mM NaOH, som kan opbevares ved 4 ° C op til 6 måneder uden tab af effektivitet i reduktive β-eliminationsreaktioner fortyndes.
  • Lav 2 M natriumborhydrid (NaBH4) i 100 mM NaOH. Opløs 38 mg NaBH4 i 0,5 ml 100 mM NaOH. Generelt anvender 0,5-1,0 ml af borhydrid løsning for hver prøve. Variere mængden af ​​reaktionsopløsningen på mængden af ​​tørrede gel stykker fremstillet i trin 1. forventer at bruge 0,5 ml af borhydrid opløsning til 1-2 udskåret gelstykker (trin 1.3).
  • Der tilsættes 500 pi af 100 mM NaOH til de dehydrerede gelstykker og lad stå i 3-5 min på is for at ækvilibrere gelen til de grundlæggende betingelser, som øger glycan genopretning.
  • Der tilsættes 500 pi 2 M NaBH4 i 100 mM NaOH, hvilket resulterer i slutkoncentrationer på 1 M NaBH
  • Løbet af den første times inkubation, bland forsigtigt røret hver 15 min. Undgå kraftig omrøring, da det kan fragmentere gelstykkerne. Udføre reaktionen i en godt ækvilibreret inkubator / ovn eller i en varmeblok. Sikre, at gelstykkerne er dækket med reaktionsopløsningen.
  • Reaktionen standses ved at fjerne prøverøret fra inkubatoren eller varmeblokken og anbringe det på is.
    BEMÆRK: Efter at den β-elimineringsreaktion at fortsætte i 18 timer, skal afsaltning proces udføres inden for samme dag.

    • 3. Afsaltning på kationbytningskromatografi

    1. Under opretholdelse af prøverøret på is for at forhindre overdreven varme formation, tilsættes langsomt dråbevis 10% eddikesyre (AcOH) for at neutralisere basen. Forsigtigt vortex prøverøret mellem tilføjelser af AcOH. Vær omhyggelig med at tilføje syre langsomt og slip klog som additipå af syre vil producere en "vulkan" bobler. Centrifugeres røret for at fjerne bobler og forhindre afsmitning, hvis det er nødvendigt.
      1. For at fjerne den store mængde af natrium i reaktionsblandingen, passere reaktionsblandingen gennem en lille kationbytterkolonne (Dowex eller AG-50W-X8-harpiks, H + form).
      2. Vaske kationbytterresinen med 1 M NaOH og 1 M HCI før brug for at fjerne kontaminanter, der interfererer med MS-analyse, selv om harpiksen er af analytisk kvalitet.
      3. Soak harpiksen i 1 M NaOH og fjern opløsning ved dekantering. Tilføj deioniseret vand, fjerne vand, tilsæt derefter 1 M HCI.
    2. Gentag disse trin, indtil opløsningen over harpiksen er farveløs. Vask renset harpiks med deioniseret vand og opbevares i 5% AcOH ved 4 ° C.
    3. For at gøre en lille glassøjle, ridse og bryde spidsen af ​​en Pasteur-pipette af glas ved hjælp af en keramisk cutter, således at tilspidsning af pipettespidsen er ca. 1 cm lang. Drille hinanden en prop af glasuld og trykkes mod spidsen danner en støtte for harpikslejet. Fastgør pipette kolonnen med en klemme eller tøjklemme og sted over et reagensglas.
    4. Vask den tomme pipette med 1 ml methanol (MeOH) og 3 ml 5% AcOH. Swirl H + Dowex eller AG50 kationbytterharpiks gylle opbevares i 5% AcOH og overføre nok af opslæmningen til frembringelse af et 1 ml lejevolumen i Pasteur pipette kolonne.
    5. Skyl kolonnen ved hjælp af fem bind af 5% AcOH. Tjek flyde igennem for udseendet af harpiks partikler og ikke bruge kolonnen, hvis der registreres harpiks.
    6. Placer kolonnen over en ny skruelåg glasrør (16 x 125 mm) og belastning prøve. Saml gennemstrømningen og eluere glycaner med mindst 3 volumener 5% AcOH i det samme rør.
    7. Dæk rør med Parafilm og gøre små huller med en nål. Anbring prøverøret ved -80 ° C eller på tøris. Når frosne, tørre prøven ved frysetørring. Gemme det tørrede materiale ved -20 ° CC indtil anvendelse.

    4. Borat Removal

    1. Forbered 10% AcOH i MeOH. Tag 10 ml iseddike, og justere lydstyrken til 100 ml med methanol. Dette reagens opbevares i en glasflaske med Teflon-foret hætte i op til 6 måneder.
    2. Tilsæt 300 pi af 10% AcOH i MeOH til det tørrede, lyofiliserede prøveglas og vortex. Fjern den resulterende trimethylborat ved fordampning under en N2 strøm.
      BEMÆRK: Blanding boratsalte med methanol under sure betingelser frembringer trimethylborat som er en flygtig forbindelse.
    3. Tør under N2 strøm ved 37 ° C. Efter tørring, tilføje en anden portion af AcOH i MeOH som beskrevet i trin 4.2. Tørre væsken i 5 minutter under nitrogen (N2) strøm ved 37 ° C.
      1. Gentag resuspension og tørring mindst 3 gange. Gemme det tørrede materiale ved -20 ° C indtil anvendelse.

    5. C18 Clean-up

    1. Ækvilibrer en C18 patron kolonne(Størrelse 1 ml, 100 mg harpiks) ved hjælp af tre bind af ACN og fem volumener 5% AcOH. Fremskynde passage af Den udlignende løsninger ved anvendelse af mild positivt lufttryk.
    2. Tilføj 500 pi 5% AcOH til afsaltet og borat-fri prøve rør og de opløses ved vortex.
    3. Indlæse genopslæmmede prøve på den ækvilibrerede C18-søjle og indsamle gennemstrømningen i et glas rør med skruelåg (13 x 100 mm). Elute O-glycaner med 3 ml 5% AcOH i det samme rør.
    4. Parafilm røret, så små huller med en lille nål eller anvende PTFE-foret hætte løst lukket dække røret og fryse prøven ved -80 ° C eller på tøris. Fjernelse af opløsningsmiddel ved frysetørring. Opbevar den tørrede prøve ved -20 ° C indtil anvendelse.

    6. Base Forberedelse til permethylering

    BEMÆRK: For at opnå robust permethylering, forberede NaOH opslæmning frisk. Alle glasvarer, der anvendes til permethylering reaktioner skal udførligt rengøres.

    1. At forberede basen reagens til permethylering, tilsættes 400 pi 50% NaOH til et rent glas med skruelåg rør (13 x 100 mm). Tilføj 800 pi vandfrit MeOH og vortex.
    2. Tilsæt 4 ml vandfrit dimethylsulfoxid (DMSO) og vortex at frembringe et hvidt bundfald.
    3. Centrifugeres ved 600 x g i 1 min for at pelletere bundfaldet. Pipette off supernatanten og kassér. Tilføj yderligere 4 ml vandfri DMSO til pillen. Vortex.
    4. Gentag trin 6.2 og 6.3 et minimum af tre gange mere, eller indtil ingen hvide bundfald.
    5. Den pelleteret base i 3 ml vandfri DMSO Opløs og bland forsigtigt ved pipettering op og ned med en ren Pasteur-pipette.
    6. Brug basen umiddelbart for følgende permethylering reaktion som den ikke kan lagres.

    7. permethylering af frigivne Glykaner

    1. Tilsæt 200 pi vandfrit DMSO til C18-oprenset prøve og vortex eller sonikeres for at resuspendere.
    2. Tilsæt 300 pi af resuspended basis opslæmning til prøven og straks tilsættes 100 pi iodmethan (MEI). Seal rør med Teflon-foret hætte og energisk mix i 5 min ved vortex.
    3. For at stoppe permethylering reaktion, tilsættes 2 ml 5% AcOH på is og vortex. Pipetteopløsning op og ned 5 gange for at reducere den resterende mængde af Mel ved inddampning.
      BEMÆRK: AcOH neutraliserer opløsning og fjernelse af Mel øger udvindingen effektiviteten af ​​sulfaterede glykaner i vandfasen i den fase-partition.
    4. Der tilsættes 2 ml dichlormethan (DCM) og vortex. Centrifuger ved 600 x g i 1 min ved stuetemperatur for at adskille de vandige og organiske faser.
    5. Overfør det øverste lag (vandig fase, der indeholder størstedelen af ​​permethylerede sulfaterede glycaner) i en ny glasrør (13 x 100 mm).
    6. Tilsæt 2 ml H2O til den organiske fase og vortex. Centrifuger ved 600 x g i 1 min for at adskille de vandige og organiske faser, og denne anden vandige fase kombineres med granst vandige fase (trin 7.5).
    7. Gentag trin 7.6 og 7.5 tre gange mere, men der er ingen grund til at gemme de vandige faser som følge af de efterfølgende partitioner.
    8. Fjern den endelige toplag (vandig fase) så meget som muligt fra det nederste lag (organisk fase) og overføre det nederste lag (organisk fase) i en separat ny glasrør med rent Pasteur pipette.
    9. Den organiske fase under N2 strøm tørre ved 42 ° C.
    10. Dæk rør med Parafilm og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.

    8. C18 Clean-up af permethyleret Sulfateret O-glycaner fra vandfasen

    1. Ækvilibrer en C18 patron kolonne med tre volumener ACN og fem volumener 5% AcOH.
    2. Indlæse de vandige faser opsamlet og kombineret fra trin 7.5 og 7.6 på søjlen.
    3. Vask kolonnen med 10 ml H2O til afsaltning.
    4. Elueres permethylerede sulfaterede O-glycans i et nyt reagensglas med 2 ml50% ACN. Brug en ekstra eluering med 85% ACN at forbedre inddrivelsen af ​​permethylerede sulfatiserede O-glycans på større oligosaccharider.
    5. Tørre eluater under nitrogenstrøm ved 42 ° C.
    6. Gemme det tørrede materiale ved -20 ° C op til 6 måneder forud for MS-analyse.

    9. massespektrometri af permethyleret O-glycaner

    1. Analysere permethyleret O-glycaner ved direkte infusion i en passende massespektrometer under anvendelse af en nanoelektrospray kilde på en sprøjte strømningshastighed på 0,40 til 0,60 pl / min ved 210 ° C kapillær temperatur. For fragmentering ved CID i MS / MS og MS n af et ionfælde instrument, anvende 30-40% kollision energi.
    2. For negativ ion-mode rekonstitueres permethylerede sulfateret O-glycaner i 50 pi methanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM vandig ammoniumacetat (16: 3: 3: 2 efter volumen). For positiv ion-mode rekonstitueres permethyleret neutrale / sialylerede O-glycaner i 50 pi af 1 mM natrium hydrohydroxid i methanol / vand (1: 1).
    3. Brug den samlede ion kortlægning (TIM) og neutral tab scanning (NL scanning) funktionalitet Xcalibur softwarepakken version 2.0 til MSN analyse for at karakterisere de enkelte O-glycanstrukturer 13,19.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Effekt ethylacetat behandling forud for In-gel Reduktiv β-Elimination

    Et repræsentativt massespektrum af permethylerede O-linked glycan prøver frigivet fra kvæg mucin anvendelse i-gel reduktiv β-eliminering er vist i figur 3. EtOAc vask af gelstykkerne fjerner effektivt SDS og polyacryl kontaminanter, der interfererer med efterfølgende MS-analyse 27.

    Figur 3
    Figur 3. Ethylacetat vask af polyacrylamidgel stykke inden i-gel reduktiv β-eliminering forøger påvisning af frigivne glycaner. (A) Uden vask med ethylacetat, massespektret af permethylerede O-bundne glykaner frigivet af i-gel β-elimination fra kvæg submaxillært mucin er domineret af en overflod af en polydispers contaminant, som næsten helt tilslører MS-signaler, der er forbundet med O-bundne glykaner. (B) Vask gelstykket med ethylacetat eliminerer forurenende toppe, giver følsom påvisning af glycaner. Modificeret fra Kumagai 25.

    Inddrivelse af O-bundet Glycan er større fra Small gelstykkerne

    O-bundne glycaner blev frigivet fra bovin submaksillær mucin ved in-gel reduktiv β-eliminering ved hjælp af gel-stykker, der enten blev skåret små (~ 2 x 2 mm) eller store (~ 5 x 5 mm). Gelstykker mindre end ~ 2 x 2 mm blev ikke effektivt inddrives gennem vasketrinene. Efter permethylering, en kendt mængde af en permethylerede ekstern glycan standard (maltotri- og maltotetrasaccharide, DP3 og DP4) blev tilsat til hver for at lette kvantificering af glycan recovery 27. Genopretningen af ​​O-bundne glycaner fra små gelstykker var næsten 10 gange større end fra store gelskiver (Figur 4).

    Figur 4
    Figur 4. Glycan genvinding fra små gelstykker er mere effektiv end fra større stykker. Små stykker (ca. 2 x 2 mm) gav mere end glycan større terninger (~ 5 x 5 mm). Søjler viser relative signalintensiteter for summen af ​​alle O-bundne glycanstrukturer normaliseret til signal detekteres for en ekstern standard (maltotrisaccharide DP3, sat til 100%), som blev føjet til det frigivne glycan før MS-analyse. Værdierne er gennemsnit standardafvigelse for n = 3. Modificeret fra Kumagai K 25.

    Berigelse af Sulfoglycans af Phase Partition

    En permethyleret sulfateret glycan standard (sulfo-Le a) blev fuldstændig tilbagebetalt i den vandige fase. Permethylerede sialylerede glycaner frigivet fra the mucin glycoprotein partitioneret i DCM-fasen (Figur 5). Genopretning af hver permethylerede glycaner ved vandig-organiske del var sammenlignelig med det tidligere karakteriserede C18 Sep-Pak oprydning metode 27. Effektiviteten og enkelhed fase partition metode i høj grad letter prøve throughput og efterfølgende analytiske tilgange.

    Figur 5
    Figur 5. Differential inddrivelse af sulfonamidgruppen og sialo-glycaner efter fase partition. Bovin mucin glycoprotein blev tilsat en kendt mængde af en sulfo-glycan standard (sulfo-Le a) før det udsættes for reduktiv β-elimination. Løst glycaner blev permethyleret og permethylering Reaktionen blev justeret til 1: 1: vand: DCM. De resulterende organiske og vandige faser blev separeret og analyseret ved MS. Glycan opsving blev kvantificeret reltiv til permethylerede eksterne glykan standarder, som blev tilsat til prøven før MS-analyse. Glykan inddrivelser i det økologiske (DCM) og vandig (vand) faser vist i forhold til den eksterne standard, som blev sat til 100%. Sulfoglycans kunne ikke påvises i den organiske fase, men kvantitativt udvundet i den vandige fase. Resultaterne repræsenterer middelværdien ± SE af tre uafhængige eksperimenter. Modificeret fra Kumagai 25.

    Ansøgning til Dybdegående proteomiske og Glycomic Analyser i biologiske prøver

    Humant spyt-proteiner blev separeret ved SDS-PAGE og farvet med Coomassie Brilliant Blue (G-250). Et protein med høj molekylvægt på MW ~ 600 kDa blev udskåret fra gelen og en del af det stykke gel blev underkastet in-gel tryptisk fordøjelse og LC-MS / MS-baseret proteomanalyse, som identificerede dette bånd som MUC5B 16,24 . Resten af ​​gelstykket blev underkastet in-gel redu ctive β-elimination for O-glykan analyse 27. Efter permethylering og vandig-organiske fase partition (Vand: DCM, 1: 1), permethyleret glycaner i de vandige og organiske faser blev analyseret ved NSI-MS. Non-sulfateret permethyleret O-glycans blev udvundet fra den organiske fase, og alle de permethylerede sulfoglycans blev udvundet fra den vandige fase, hvilket letter identifikation og karakterisering af næsten isobare sulfateret og ikke-sulfaterede glykaner fx Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GaINAc-ol (m / z = 1606,8, [M + Na] +) og (SO 3) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GaINAc-ol (m / z = 1606,7, [M + 2Na-H] +) afviger kun 0,1 masse- enheder og vil være vanskeligt at løse uden fysisk adskillelse af de to arter af fase partition (figur 6).

    pload / 51840 / 51840fig6highres.jpg "width =" 700 pixel "/>
    Figur 6. Påvisning af isobare kompleksitet i neutrale og sulfo-glycaner adskilt af vandige organiske partition. MS 2 fragmenteringsmønstre opnået fra moderioner påvist ved total ion mapping (TIM) analyse af permethylerede O-glycaner frigivet fra humant spyt mucin ved in-gel β-elimination og vand: DCM partition efter permethylering. (A) MS 2 fra TIM analyse af DCM-fasen for en 2,8 masseenhed vindue omkring m / z = 1608. (B) MS 2 spektrum af den samme masse vindue TIM analyse af vandfasen. I DCM-fasen, de store fragmentioner svarer til tab af Hex 1 -O (m / z 1370,8) Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1331,8), tab af Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), tab Hex 1 HexNAc 1 (1143,6), tab af Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), tabaf Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660,4), og Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Baseret på disse fragmentioner, er en blanding af ikke-sulfaterede strukturer med en sammensætning af Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GaINAc-ol foreslået som vist til højre af spektret. I modsætning hertil, de store fragmentioner for vandfasen er tab af SO3 Na (1486,8), tab af NeuAc (1231,5), tab af Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), tab af kombination af NeuAc og SO 3 Na ( 1111,8), og tab af NeuAc 1 Hex 1 -O (1009,4). En blanding af sulfaterede strukturer med en sammensætning af (SO 3 -) foreslås 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 GaINAc-ol. Uden fysisk adskillelse af neutrale og sulfoglycans ved fase partition, tolkning MS 2 spektre af sådanne blandinger er betydeligt mere challenging. Modificeret fra Kumagai 25. Klik her for at se en større udgave af figuren.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Water, deionized water Sigma-Aldrich  270733-4L CHROMASOLV, for HPLC
    Acetic acid, Glacial Fisher A38-500 Certified ACS ≥99.7% w/w
    Methanol Sigma-Aldrich  34860-4L-R CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9%
    Ammonium bicarbonate Fluka 09830-500G BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1
    Acetonitrile Sigma-Aldrich  34998-4L CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1
    Ethyl acetate Fluka 34972-1L-R LC-MS CHROMASOLV, Step 1
    Sodium borohydride Aldrich 213462-25G ReagentPlus, 99%, Step 2
    Iodomethane Sigma-Aldrich  289566-100G ReagentPlus, 99.5%,  Step 6.  Store at 4 °C until use.  Sit at room temperature before use.
    Sodium hydroxide solution, 50% w/w Fisher SS254-1 Certified, Step 6
    Dimethyl sulfoxide, anhydrous Sigma-Aldrich  276855-1L Anhydrous, ≥99.9%, Step 6
    Methanol, anhydrous Sigma-Aldrich  322415-100ML Anhydrous, 99.8%, Step 6
    Dichloromethane Sigma-Aldrich  34856-4L CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7
    Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh Sigma-Aldrich  217506-500G Step 3
    AG 50W-X8 Resin  Bio-Rad 142-1441 Step 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase JT Baker JT-7020-01 Step 5 and 8
    7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel  Bio-Rad Step 1
    Bio-Safe Coomassie Stain  Bio-Rad 161-0786 G-250, Step 1
    Silver Stain Kit for Mass Spectrometry Pierce 24600 Step 1
    Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) Supelco  47265
    Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) Supelco  47265
    Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip VWR 14673-010 Wash before use
    PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-13 Wash before use
    PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes Corning 99447-16 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-13 Wash before use
    Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner Kimble 45066C-15 Wash before use
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81265 volume 500 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81165 volume 250 μl, needle size 22 G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 81065 volume 100 μl, needle size 22s G
    Hamilton HPLC syringe HAMILTON 80965 volume 50 μl, needle size 22s G
    Hamilton Calibrated Syringes HAMILTON 80300 volume 10 μl, needle size 26s G
    Petri Dish Glass 100 mm x 15mm GSC INTERNATIONAL INC 1500-4 Wash before use, Step 1
    Bard-Parker Surgical Blades Fisher 371310 Step 1
    Reacti-Therm Heating/Stirring Module Pierce 18870 Step 1, 4 and 7
    Heating Blocks Fisher 125D Step 2
    Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm Aldrich CLS3950 Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutter alltech 3194 Step 3
    Multi-tube vortexers  VWR 444-7063 Step 6
    Lyophilizer 25EL Freezemobile Virtis 25EL
    Centrifuge VWR Clinical 50
    LTQ Orbitrap Discovery Thermo Fisher Scientific

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    Tags

    Kemi glycoprotein glycosylerings in-gel reduktiv β-elimination O-bundet glycan sulfateret glycan massespektrometri protein-id SDS-PAGE Glycomics sulfoglycomics
    Forbedret i-gel Reduktive β-Elimination for Omfattende O-bundne og sulfo-Glykobiologi ved massespektrometri
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T.,… More

    Nix, D. B., Kumagai, T., Katoh, T., Tiemeyer, M., Aoki, K. Improved In-gel Reductive β-Elimination for Comprehensive O-linked and Sulfo-glycomics by Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (93), e51840, doi:10.3791/51840 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter