Introduction
グリコシル化は、生物生理学、組織病 理学、および細胞認識1-3に貢献し、必須タンパク質の翻訳後修飾である。分析糖鎖の主要な進歩にもかかわらず、特定のタンパク質上のグリカンの完全な多様性を特徴づけることは、特に主要な生物学的供給源から単離されたタンパク質に、極めて困難な課題である。それにもかかわらず、糖タンパク質グリカンの微小不均一性は、頻繁に他のタンパク質との機能的相互作用に影響を与えます。したがって、グリカン多様性の特徴付けは、細胞および組織のグリコシル4,5の生理的意義を理解するために不可欠である。組織の生理学および病態生理学、堅牢敏感な、包括的なglycomic分析技術の糖タンパク質のグリコシル化の寄与を理解するためにますます重要になってきた。プロテオーム解析では、タンパク質同定は、一般的LC-MSにより達成されるトリプシンペプチド6の/ MS分析。タンパク質消化は、7-9トリプシンなどのプロテアーゼによるゲル内消化後のSDS-PAGEによって分離精製されたタンパク質またはタンパク質を用いて行うことができる。 SDS-PAGEによるタンパク質混合物の予備濃縮は、タンパク質IDの深さと正確さを向上させます。糖タンパク質グリコシル化のglycomic分析のための類似の戦略の開発は、糖質科学の最前線に位置しています。
グリカンの2つの主要なクラスは、N-連結またはO-連結のいずれかを介してタンパク質主鎖に結合している。 N結合型グリカンは、アスパラギンに結合しているアスパラギン（Asn）のAsn-X-Ser / Thr / Cysをとして定義シークの一部として見出される残基は、（Xはプロリンを除く任意のアミノ酸である）、そしてペプチド- Nによる酵素消化により放出させることができる-glycanase（PNGアーゼFまたはA）、いずれの溶液中で、ゲル内、またはオンブロット10-12。 O結合型グリカンは主にセリン（セリン）またはトレオニン（スレオニン）残基に結合している。ただし、1つの酵素は、IDENされている糖タンパク質のO-結合グリカンを放出することが可能であり、それは唯一の最も単純なO結合型グリカンを放出する、非常に限られたグリカン特異性を有するtified。化学物質放出戦略は、糖タンパク質のO-結合グリカンの包括的放出のための選択の方法のままである。還元的または非還元的β脱離、またはヒドラジンのよく特徴付けられた化学物質放出技術であり、現在糖タンパク質13,14からのO結合グリカンを放出するための最も一般的に使用されるアプローチである。還元的β脱離は、SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質のO-結合グリカンを放出するために使用されてきたが、従来のアプローチは、その後の分析のために15〜17 HPLC分離を必要とした。
多次元MS（MS n）の分析では、現在、ほとんどの生物学的情報源から見込額で単離した糖タンパク質から放出されたグリカンを特徴付けるための構造データの最も豊富なソースを提供します。 MSの深さベースの構造的特徴が大幅に先立って彼らの分析にリリースグリカンをpermethylatingによって促進される。完全メチル化は、イオン化を強化し、グリカン構造18,19の幅広い分子のシグナル応答を等化する傾向がある。また、過メチル化は、明確にすることにより構造の解明20-23を高め、独特の大衆を持つ端末および置換単糖部分をタグ付けします。例えば、酸性グリカンはMSにより非過メチル化種として検出することが一般的に困難である。酸性グリカンMS負イオンモードで検出することができるが、同じイオンモードの両方で、酸性および中性グリカンを検出することは不可能である。グリカンの完全メチル化の主要な利点は、完全メチル化のように、グリカンの単糖置換基上の遊離ヒドロキシル基（OH）の全てがそれらのように検出可能にメチル基（OCH 3またはOMeで）、このようにしてシアル化グリカンの電荷が中和されるでキャップされることであるニュートラル（アジアLO）グリカン。しかし、sulfoglycans上の硫酸残基のヒドロキシルイオン化を抑制し、感度を低下させるアニオン電荷の保持をもたらす、完全メチル化に耐性がある。この抑制は、現在、そのような硫酸化グリカン24-26の高い存在を運ぶムチン、など非常に複雑な糖タンパク質の包括的なglycomic分析を防ぎます。
浄化硫酸化グリカン上の最近の報告では、逆相精製するクロマトグラフィーおよびMALDI分析の前に別々の過メチル化グリカン、充電に使用。この方法では、我々は、有機相分配よりもあまり厳密であることがわかってきた溶出のための異なる移動相を使用した硫酸化および非硫酸化グリカンの完全な分離に依存している。したがって、sulfoglycansの検出および濃縮のために適した新しい技術がここに提示されている。これらの技術は、水以下の水相中の硫酸化糖鎖の定量的回収を可能に：DCM（ジクロロメタン）日常グリカン過メチル化反応27の最後に行われ、抽出、。また、MS 2フラグメンテーションパターンを簡素化しながら、重要なことは、完全メチル化非硫酸化グリカンの混合物からの完全メチルsulfoglycansのこの堅牢な分離は、付随的に帯電した種のために豊かにします。改善されたゲル内O-結合グリカン分析のための総合的なプロトコルも提示されている。改良されたプロトコルがグリカンの回復を高め、過メチル化グリカンのMS n分析を通じて得られる構造情報を増加させ、生物学的な供給源から単離さ不可欠糖タンパク質に適用sulfoglycomic分析の感度を向上させます。
このプロトコルは、全体の糖タンパク質抽出物のO結合型グリカン分析のために、またはSDS-PAGEにより分離し、目的の特定の糖タンパク質のことを意図しており、3つの実験の手順で構成されている。 A）は、ゲルクリーンアップ、B）は、ゲル内還元的β脱離、およびC）糖鎖permethy設置と。目標は、生物学的に関心のある主要な供給源から採取された糖タンパク質のための総合的なO結合型glycomicデータ（ 図1）を得ることである。 SDS-PAGEによって分離された糖タンパク質を染色することによって視覚化され、目的のバンドを切り出し、得られたゲルのバンドを小片にスライスされる。ゲル片を脱染色し、ゲルの汚染物質（ 図2A）を除去し、酢酸エチルでの洗浄に供される。グリカン放出は、ゲル内還元的β脱離（ 図2B）によって達成され、遊離されたグリカンを完全メチル化されている。水性有機抽出後に過メチル化を定量的に離れて非硫酸ニュートラルグリカン（ 図2C）からのアニオン性硫酸化グリカンを仕切る。水性 - 有機溶媒抽出に結合されたゲル内還元的β脱離は、SDS-PAGEで分離した糖タンパク質の少量から放出されたO結合型グリカンとsulfoglycansの特徴付けを可能にします。戦略的な概要はsummariです図1および詳細におけるZEDは、 図2に示されている。また、脱染色し、洗浄し、ゲル片の部分は、通常のLC-MS / MSプロテオミクス技術によるタンパク質のIDのために使用することができる。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS ≥99.7% w/w |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μl, needle size 22s G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μl, needle size 22s G |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μl, needle size 26s G |
| Petri Dish Glass 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
