Introduction
Glycosylering een essentieel eiwit post-translationele modificatie, bijdraagt tot organismale fysiologie, pathologie weefsel en cellulaire herkenning 1-3. Ondanks de grote vooruitgang in de analytische glycoscience, het karakteriseren van de volledige diversiteit van glycanen op een specifiek eiwit blijft een zeer uitdagende taak, vooral op eiwitten geïsoleerd uit primaire biologische bronnen. Niettemin, de microheterogeniteit van glycoproteïne glycanen vaak invloed functionele interacties met andere eiwitten. Daarom karakterisering van glycan diversiteit is essentieel voor het begrijpen van de fysiologische betekenis van cellen en weefsels glycosylering 4,5. Om de bijdrage van glycoproteïne glycosylering om weefsel fysiologie en pathofysiologie, robuuste, gevoelige, en uitgebreide glycomic analytische technieken begrijpen steeds belangrijker geworden. In proteoomanalyses worden eiwitidentificaties algemeen bereikt door LC-MS/ MS analyse van tryptische peptiden 6. Eiwitvertering kan worden uitgevoerd met een gezuiverd eiwit of eiwitten gescheiden door SDS-PAGE na in-gel digestie met proteasen zoals trypsine 7-9. Voorverrijking van het eiwitmengsel door SDS-PAGE verhoogt de diepte en nauwkeurigheid eiwit ID. De ontwikkeling van analoge strategieën voor glycomic analyse van glycoproteïne glycosylering ligt in de voorhoede van glycoscience.
De twee belangrijkste klassen van glycanen worden door ofwel N-koppeling of O-koppeling aan eiwitskeletten bevestigd. N-gekoppelde glycanen zijn aan asparagine (Asn) residuen die als onderdeel van een sequon gedefinieerd als Asn-X-Ser / Thr / Cys (X elk aminozuur behalve proline), en kan worden vrijgemaakt door enzymatische digestie met peptide N -glycanase (PNGaseF of A), hetzij in oplossing, in-gel of blot op 10-12. O-gekoppelde glycanen zijn voornamelijk aan serine (Ser) of threonine (Thr) residuen. Echter, slechts één enzym is idenvaardigd dat kan vrijgeven O-gekoppelde glycanen van glycoproteïne en het heeft een zeer beperkt glycan specificiteit vrijgeven alleen de eenvoudige O-gekoppelde glycanen. Chemische releasestrategieën blijven voorkeursmethode voor uitgebreide afgifte van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen. Reducerende of niet-reducerende β-eliminatie of hydrazinolyse goed gekarakteriseerde chemische afgifte technieken en zijn de meest gebruikte methoden voor het vrijgeven van O-gekoppelde glycanen van glycoproteïnen 13,14. Hoewel reductieve β-eliminatie is gebruikt om O-gekoppelde glycanen bevrijden van glycoproteïnen door SDS-PAGE, eerdere benaderingen nodig HPLC scheiding voor daaropvolgende analyse 15-17.
Multidimensional MS (MS n) analyse verschaft momenteel de rijkste bron van structurele gegevens voor het karakteriseren glycanen afgegeven uit glycoproteïnen die het verwachte meeste biologische bronnen bedragen. De diepte van MSgebaseerde structuurkarakterisering wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door permethylating de vrijgekomen glycanen vóór de analyse. Permethylation verbetert ionisatie en heeft de neiging om molaire signaal reacties te egaliseren over een breed scala van glycaanstructuren 18,19. Bovendien permethylation ondubbelzinnig labels terminal en monosaccharide eenheden met kenmerkende massa, waardoor structuuropheldering 20-23 verhogen. Bijvoorbeeld zure glycanen algemeen moeilijk te detecteren niet gepermethyleerd species MS. Hoewel zure glycanen negatieve ion modus kan worden gedetecteerd door MS, is het onmogelijk om zowel zure als neutrale glycanen detecteren in dezelfde ionenmodus. Een groot voordeel van glycan permethylation is dat alle vrije hydroxylgroepen (OH) op monosaccharide substituenten een glycan zal worden afgesloten met een methylgroep (OCH3 of OMe), dus een gesialyleerde glycaan de kosten geneutraliseerd, waardoor ze detecteerbare als gepermethyleerd neutraal (aziëlo) glycanen. De hydroxylgroepen van sulfaat groepen op sulfoglycans zijn bestand tegen permethylation, waardoor retentie van anionische lading, die ionisatie onderdrukt en vermindert gevoeligheid. Deze onderdrukking voorkomt nog glycomic uitgebreide analyse van zeer complexe glycoproteïnen zoals mucinen, die een grote dichtheid aan gesulfateerde 24-26 glycanen dragen.
Recente rapporten over de zuiverende gesulfateerde glycanen gebruikte gebracht, omgekeerde fase chromatografie te zuiveren en aparte gepermethyleerd glycanen voorafgaand aan MALDI-analyse. Deze werkwijze berust op volledige scheiding van gesulfateerde en niet-gesulfateerde glycanen met verschillende mobiele fasen voor elutie, die we hebben gevonden minder stringent dan organische fase verdeling zijn. Daarom zijn nieuwe technieken geschikt voor de detectie en verrijking van sulfoglycans hier gepresenteerd. Deze technieken zorgen voor de kwantitatieve herstel van gesulfateerde glycanen in de waterfase volgende water: DCM (dichloormethaan)extractie, die routinematig wordt uitgevoerd aan het einde van glycan permethylation 27 reacties. Belangrijk is dat deze robuuste scheiding van gepermethyleerd sulfoglycans uit een mengsel van gepermethyleerd niet-gesulfateerde glycanen gelijktijdig verrijkt voor geladen deeltjes, terwijl ook de vereenvoudiging van MS 2 fragmentatiepatronen. Een uitgebreide protocol voor betere in-gel-O-gelinkte glycan analyse wordt gepresenteerd. De verbeterde protocol verbetert glycan herstel, verhoogt de structurele informatie verkregen door middel van MS n analyse van gepermethyleerd glycanen, en verbetert de gevoeligheid van toepassing op essentiële glycoproteïnen geïsoleerd uit biologische bronnen sulfoglycomic analyses.
Dit protocol is bedoeld voor O-gekoppelde glycan analyse van hele glycoproteïne extracten of een specifiek glycoproteïne van belang opgelost door SDS-PAGE en bestaat uit drie experimentele procedures; A) gel clean-up, B) in-gel reductieve β-eliminatie, en C) glycan permethyning. Het doel is om omvangrijke O-gekoppelde glycomic gegevens te verkrijgen voor glycoproteïnen geoogst uit primaire bronnen van biologisch belang (figuur 1). Glycoproteïnen door SDS-PAGE worden gevisualiseerd door kleuring en banden van belang worden uitgesneden en de resulterende gel band wordt gesneden in kleine stukjes. De gel stukken worden ontkleurd en onderworpen aan ethylacetaat wassen gel verontreinigingen (Figuur 2A) verwijderd. Glycaan afgifte wordt bereikt door in-gel reductieve β-eliminatie (Figuur 2B) en de vrijgekomen glycanen gepermethyleerd. Waterige organische extractie volgende permethylation kwantitatief partities de anionische gesulfateerde glycanen weg van niet-gesulfateerde neutraal glycanen (figuur 2C). In-gel reductieve β-eliminatie gekoppeld waterige organische extractie maakt de karakterisering van O-gekoppelde glycanen en sulfoglycans bezit van kleine hoeveelheden glycoproteïne door SDS-PAGE. Het strategisch overzicht is summarized in figuur 1 en de details zijn weergegeven in figuur 2. Bovendien kan een gedeelte van de gel ontkleurd en gewassen stukken worden gebruikt door standaard eiwit ID LC-MS / MS-proteomica.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Lab Bezorgdheid over veiligheid
In overeenstemming met standaard laboratorium best practices, het volgende in acht. Bewaar alle organische oplosmiddelen in de juiste locaties. Houd alle afvalstoffen in chemisch afval containers met duidelijke etikettering van chemische samenstelling. Zoals verschillende reagentia die bij deze protocollen zijn potentiële carcinogene of genereren vluchtige brandbare gassen, behandelen alle reagentia in een zuurkast met ventilatie. Draag persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas, en oogbescherming bij het werken met organische oplosmiddelen.
Figuur 1. Procedure voor in-gel O-glycomics. (A) Eiwitten van belang worden opgelost door SDS-PAGE, gedetecteerd door gepaste kleuringen (Coomassie en zilver) en uitgesneden. Weggesneden gel stukken worden gesnedenin kleine blokjes, ontkleurd en met ethylacetaat gewassen om verontreinigingen die interfereren latere MS analyse verlagen. Een gedeelte van de gel slice kan worden gereserveerd in-gel tryptische digestie en daaropvolgende proteomische karakterisering door LC-MS / MS. (B) O-gekoppelde glycanen afgegeven uit glycoproteïnen opgelost door in-gel reductieve β-eliminatie. Essentiële stappen omvatten ontzouten en boraat verwijdering door azeotroop met methanol. (C) O-gekoppelde glycanen afgegeven door reductieve β-eliminatie worden gepermethyleerd vervolgens verdeeld in waterige en organische fasen. Sulfoglycans worden kwantitatief teruggevonden in de bovenste (waterige) fase, terwijl neutrale en gesialyleerde glycanen partitie in de onderste (DCM) laag.
Figuur 2. Detail stroomschema in-gel glycomics. Elke Experimental stap getoond in figuur 1 afzonderlijk weergegeven. (A) gel ontkleuren en EtOAc extractie, (B) direct in-gel reductieve β-eliminatie voor O-gebonden glycan release, en (C) permethylation en fase partitie. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
1. Gel excisie en verwijdering van Gel-afgeleide Verontreinigingen
- Voor aanvang van de procedure, te bereiden in Materials List geclassificeerde chemicaliën en reagentia.
- Lossen proteïne op SDS-PAGE onder toepassing standaard Tris-Glycine buffersystemen. Vlek opgelost eiwitten met ofwel Coomassie Brilliant Blue of Silver Stain. In het algemeen, terugwinning van O-gekoppelde glycanen van zilver gekleurde gelen ongeveer 80-90% van de terugwinning behaald uit Coomassie gekleurde gels.
- Na elektroforese plaats de gel op een glazen plaat en accijnzen tHij regio van belang met een schone scalpel of scheermesje.
- Om de opbrengst van O-glycanen te verhogen, de overdracht van de gel band van belang op een andere glasplaat en snijd de uitgesneden gel stuk in ongeveer 2 mm blokjes. Vermijd gel stukken kleiner dan 1 mm blokjes omdat glycan herstel verminderd. Breng de kleine gel stukken in een schroefdop glazen buis (13 x 100 mm) met een roestvrij stalen microspatula.
- Voeg 1 ml 25 mM ammonium bicarbonaat (Ambic, NH 4 HCO 3) om het monster buis, cap de glazen buis met een met teflon beklede schroef dop, en meng door flicking de buis voordat het laten staan gedurende 10 min. Laat krachtig bewegen niet in dienst om te voorkomen dat het rippen van de gel stukken.
- Verwijder Ambic voorzichtig uit de glazen buis met behulp van een Pasteur glazen pipet of een pipet voorzien van een extra-lange plastic tip. Vermijd smashing en het overdragen van de kleine stukken gel tijdens het verwijderen van de Ambic oplossing.
- Voeg 1 ml acetonitril (ACN) voor deglazen buis, cap, en meng door flicking buis vóór te laten staan gedurende 10 min. Zorg ervoor dat de gel stukken volledig zijn bedekt met oplosmiddel. Indien nodig, duwt gel stukken off van buiswand en in oplosmiddel met pipet tip.
- Pipet af ACN uit de glazen buis en herhaal de stappen 1,5-1,7 totdat de heldere blauwe kleur wordt geëlimineerd. Herhaal minste vijf opeenvolgende Ambic / ACN wasbeurten indien nodig. Voor zilver gekleurde gels, gebruik dan een destain kit. Ga verder met de volgende stap wanneer de gel stuk draait gelijkmatig wit terwijl in ACN.
- Pipet vloeistof af uit de glazen buis, recapituleren de buis, voeg 1 ml van Ambic en laat gedurende 5 min.
- Verwijderen Ambic en voeg 2 ml ethylacetaat (EtOAc) om de glazen buis. Samenvatting buis met Teflon gevoerde dop en bij 4 ° C geïncubeerd met end-over-end agitatie of alternatief uitvoeren EtOAc drie wasbeurten bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten elk. Hoe langer de EtOAc wassen, hoe efficiënter de verwijdering van verontreinigingen.
- Verwijderende laatste EtOAc wassen en voeren drie wassingen met elk 2 ml H2O Volledige verwijdering van EtOAc zal zorgen voor een robuuste reductieve β-eliminatie reactie.
- Pipet uit H 2 O en dehydrateren de gel door eenmaal wassen met 1 ml ACN.
OPMERKING: Na het drogen, de gedroogde gels zijn er klaar voor in-gel β-eliminatie. Gedehydrateerde gel stukken kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot gebruik. - Stop het wasproces elke stap en bewaar de gel stukken bij 4 ° C overnacht, ongeacht welke buffer of oplossing wordt aangebracht op de gel (Ambic, ACN, H2O). Herstart monstervoorbereiding op elk moment in de komende 2 dagen.
- Gebruik een deel van het ontkleurd en vochtarme gel stukken voor eiwit ID door standaard proteomics aanpak.
2. In-gel O-glycan door reductieve β-eliminatie
- Bereid een voorraadoplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) met 50% NaOH en vast NaOH en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
OPMERKING: Nadat men de β-eliminatie reactie verlopen gedurende 18 uur, dient het ontzoutingsproces dezelfde dag uitgevoerd.
3. Ontzouten op kationenwisselingschromatografie
- Terwijl de monsterbuis op ijs overmatige warmteontwikkeling voorkomen, voeg langzaam 10% azijnzuur (AcOH) druppelsgewijs aan de base te neutraliseren. Voorzichtig vortex het monster buis tussen toevoegingen van AcOH. Wees voorzichtig om zuur voeg langzaam en druppelsgewijs als de additibetreffende zuur een "vulkaan" van belletjes. Centrifugeer de buis om bubbels te elimineren en spillover te voorkomen, indien nodig.
- Om de grote hoeveelheid natrium in het reactiemengsel te verwijderen, passeert het reactiemengsel door een kleine kation-uitwisseling kolom (Dowex of AG-50W-X8 hars, H + vorm).
- Was de kationenuitwisselingshars met 1 M NaOH en 1 M HCl voor gebruik om verontreinigingen die interfereren met MS analyse, zelfs wanneer de hars van analysekwaliteit te verwijderen.
- Week de hars in 1 M NaOH en verwijder oplossing door decanteren. Voeg gedeïoniseerd water, verwijder het water, voeg dan 1 M HCl.
- Herhaal deze stappen tot de oplossing boven de hars is kleurloos. Was de gereinigde hars met gedeïoniseerd water en bewaar in 5% AcOH bij 4 ° C.
- Om een klein glazen kolom, kras te maken en breken de punt van een Pasteur glazen pipet met behulp van een keramische mes, zodat de versmalling van de pipet tip is ongeveer 1 cm lang. Plagen elkaar een prop glaswol en duw in de richting van de punt vormen een ondersteuning voor het harsbed. Bevestig de kolom pipet met een klem of een wasknijper en plaats over een glazen reageerbuis.
- Was de lege pipet met 1 ml methanol (MeOH) en 3 ml van 5% AcOH. Swirl H + Dowex of AG50 kationenuitwisselingshars slurrie opgeslagen in 5% AcOH en overbrengen van de suspensie voldoende om een 1 ml bedvolume van de kolom Pasteur pipet produceren.
- Spoel de kolom met behulp van vijf volumes van 5% AcOH. Controleer stromen door het verschijnen van harsdeeltjes en kan de kolom niet als hars wordt gedetecteerd.
- Plaats column over een nieuwe schroefdop glazen buis (16 x 125 mm) en de belasting monster. Verzamel de stroom door en elueer glycanen met ten minste 3 volumes van 5% AcOH in dezelfde buis.
- Bedek de buis met Parafilm en maak kleine gaatjes met een naald. Het monster buis bij -80 ° C of op droog ijs. Eenmaal bevroren Droog het monster, door vriesdrogen. Bewaar de gedroogde materiaal bij -20 °C tot gebruik.
4. Boraat Removal
- Bereid 10% AcOH in MeOH. Neem 10 ml ijsazijn en het volume op 100 ml met methanol. Bewaar het reagens in een glazen fles met teflon gevoerd deksel tot 6 maanden.
- Voeg 300 ui 10% AcOH in MeOH gedroogde gevriesdroogde monsterbuis en vortex. Verwijder de resulterende trimethylboraat door verdamping onder een N2 stroom.
Opmerking: Het mengen boraatzouten met methanol onder zure condities produceert trimethylboraat die een vluchtige verbinding. - Droog onder N2 stroom bij 37 ° C. Na drogen, voeg een hoeveelheid van AcOH in MeOH zoals beschreven in stap 4.2. Droog de vloeistof gedurende 5 minuten onder stikstof (N2) stroom bij 37 ° C.
- Herhaal resuspensie en drogen minstens 3 keer. Bewaar het gedroogde materiaal bij -20 ° C tot gebruik.
5. C18 Clean-up
- Equilibreer een C18 cartridge(Grootte 1 ml, 100 mg hars) met behulp van drie volumes van ACN en vijf volumes van 5% AcOH. Versnel passage van het in evenwicht brengen oplossingen door toepassing van milde positieve luchtdruk.
- Voeg 500 ul van 5% AcOH de ontzout en-boraat gratis monster buis en oplossen door vortex.
- Laad geresuspendeerd monster op de geëquilibreerde C18-kolom en het verzamelen van de stroom door in een glazen schroefdop buis (13 x 100 mm). Elueer O-glycanen met 3 ml 5% AcOH in dezelfde buis.
- Parafilm de buis te prikken met een kleine naald of gebruik losjes gesloten PTFE beklede dop op de tube bedekken, en het monster bij -80 ° C of op droog ijs te bevriezen. Verwijder het oplosmiddel door vriesdrogen. Bewaar de gedroogde monster bij -20 ° C tot gebruik.
6. Base Voorbereiding voor Permethylation
OPMERKING: Om robuuste permethylation bereiken, bereiden NaOH slurry fris. Alle glaswerk voor permethylation reacties dienen grondig gereinigd.
- Aan de basis reagens te bereiden op permethylation, voeg 400 ul van 50% NaOH aan een schoon glas schroef-bovenbuis (13 x 100 mm). Voeg 800 ul van watervrije MeOH en vortex.
- Voeg 4 ml watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) en vortex om een wit precipitaat te genereren.
- Centrifugeer bij 600 xg gedurende 1 minuut om het neerslag te pelleteren. Pipet uit supernatant af en gooi. Voeg een extra 4 ml watervrij DMSO aan de pellet. Vortex.
- Herhaal stap 6.2 en 6.3 ten minste drie keer of tot geen wit neerslag gevormd.
- Los het pellet base in 3 ml watervrij DMSO en meng door pipetteren en neer met een schone Pasteur pipet.
- Met de basis direct voor de volgende reactie permethylation aangezien niet kan worden opgeslagen.
7. Permethylation van Uitgebracht Glycans
- Voeg 200 pl watervrije DMSO op de C18-gezuiverde monster en vortex of ultrasone trillingen te mengen.
- Voeg 300 ul van de resuspended base slurry naar het monster en voeg onmiddellijk 100 ul van joodmethaan (MEI). Verzegelen buis met teflon beklede kap en krachtig mengen gedurende 5 min met de vortex.
- Om de permethylation reactie te stoppen, voeg 2 ml van 5% AcOH op ijs en vortex. Pipetoplossing en neer 5 maal de resterende hoeveelheid MeI Damp.
OPMERKING: De AcOH neutraliseert de oplossing en verwijdering van MeI verhoogt de efficiëntie van de extractie van gesulfateerde glycanen in de waterfase tijdens de fase-partitie. - Voeg 2 ml dichloormethaan (DCM) en vortex. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 1 min bij kamertemperatuur aan de waterige en organische fasen gescheiden.
- Breng de bovenste laag (waterige fase die de meeste gepermethyleerd gesulfateerde glycanen bevat) in een nieuwe glazen buis (13 x 100 mm).
- Voeg 2 ml H2O aan de organische fase en vortex. Centrifugeer bij 600 xg gedurende 1 min aan de waterige en organische fasen gescheiden en combineren tweede waterige fase met first waterige fase (stap 7.5).
- Herhaal stap 7.6 en 7.5 drie keer, maar er is geen noodzaak om de waterige fase verkregen uit de volgende partities slaan.
- Verwijder de uiteindelijke toplaag (waterfase) zoveel mogelijk van de onderste laag (organische fase) en breng de onderste laag (organische fase) in een afzonderlijke nieuwe glazen buis met schoon Pasteur pipet.
- Droog de organische fase onder N2 stroom bij 42 ° C.
- Bedek de buis met Parafilm en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
8. C18 Clean-up van gepermethyleerd Gesulfateerde O-glycanen van de waterige fase
- Equilibreer een kolom C18 cartridge met drie volumes van ACN en vijf volumes van 5% AcOH.
- Laad de waterige fase verzameld en gecombineerd van stappen 7.5 en 7.6 op de kolom.
- Was de kolom met 10 ml H2O voor ontzouting.
- Elueer de gepermethyleerd gesulfateerde O-glycanen in een nieuwe glazen buis met 2 mlvan 50% ACN. Gebruik een extra elutie met 85% ACN om het herstel van gepermethyleerd gesulfateerde O-glycanen verbeteren op grotere oligosacchariden.
- Droge eluaten onder stikstofstroom bij 42 ° C.
- Bewaar het gedroogde materiaal bij -20 ° C maximaal 6 maanden voor MS analyse.
9. Massaspectrometrie van gepermethyleerd O-glycanen
- Analyseer gepermethyleerd O-glycanen door directe infusie in een geschikte massaspectrometer met een nanoelectrospray bron bij een spuit debiet van 0,40-0,60 pl / min bij 210 ° C capillaire temperatuur. Voor fragmentatie door CID in MS / MS en MS n van een ion trap instrument, gelden 30-40% botsingsenergie.
- Bij negatieve ion modus reconstitueren gepermethyleerd gesulfateerde O-glycanen in 50 pl methanol / 2-propanol / 1-propanol / 13 mM waterig ammoniumacetaat (16: 3: 3: 2 naar het volume). Voor positieve ion-modus, reconstitueren gepermethyleerd neutraal / gesialyleerde O-glycanen in 50 ul van 1 mM natrium hydroXide in methanol / water (1: 1).
- Gebruik de totale ion mapping (TIM) en neutrale verlies scan (NL scan) functionaliteit van de Xcalibur software pakket versie 2.0 voor MSN-analyse van individuele O-glycanstructuren 13,19 karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Effect van Ethylacetaat Behandeling Voorafgaand aan In-gel Reductive β-eliminatie
Een vertegenwoordiger massaspectrum van gepermethyleerd O-gekoppelde glycan monsters bezit van runderen mucine met in-gel reductieve β-eliminatie wordt getoond in figuur 3. De EtOAc wassen van de gel stukken verwijdert effectief SDS en polyacryl verontreinigingen die interfereren latere MS analyse 27.
Figuur 3. Ethylacetaat wassen van polyacrylamidegel- stuk voorafgaand aan in-gel reductieve β-eliminatie verbetert detectie van vrijgekomen glycanen. (A) zonder wassen met ethylacetaat, het massaspectrum van gepermethyleerd O-gekoppelde glycanen afgegeven door in-gel β-eliminatie van runderen onderkaak mucine wordt gedomineerd door een overvloed van een polydispers contaminant, die bijna volledig verduistert het MS signalen geassocieerd met O-gekoppelde glycanen. (B) Het wassen van de gel stuk met ethylacetaat elimineert de verontreiniging pieken, waardoor gevoelige detectie van glycanen. Gewijzigd ten opzichte van Kumagai 25.
Herstel van O-gebonden Glycan is Groter van Small Gel Slices
O-gekoppelde glycanen werden afgegeven uit runderen onderkaak mucine door in-gel reductieve β-eliminatie met gel gesneden stukken die zowel klein waren (~ 2 x 2 mm) of grote (~ 5 x 5 mm). Gel stukken kleiner dan ~ 2 x 2 mm werden niet efficiënt hersteld door de stappen wassen. Na permethylation, een bekende hoeveelheid van een gepermethyleerd externe glycan standaard (maltotri- en maltotetrasaccharide, DP3 en DP4) werd toegevoegd aan elk kwantificering van glycan herstel 27 vergemakkelijken. Het herstel van O-gekoppelde glycanen van kleine stukjes gel bijna 10 maal groter dan van grote gelplakken (Figuur 4).
Figuur 4. Glycan herstel van kleine stukjes gel is efficiënter dan van grotere stukken. Kleine stukjes (~ 2 x 2 mm) leverde meer glycaan- dan grotere blokjes (~ 5 x 5 mm). Balken geven de relatieve signaalsterkten van de som van O-gekoppelde glycan structuren genormaliseerd met de gedetecteerde voor een externe standaard (maltotrisaccharide DP3, ingesteld op 100%), om de vrijgekomen glycan werd toegevoegd voordat MS analyse signaal. Waarden zijn gemiddelde standaardafwijking n = 3. Gewijzigd ten opzichte van Kumagai K 25.
Verrijking van Sulfoglycans door Phase Partition
Een gepermethyleerd gesulfateerde glycan standaard (sulfo-Le a) werd volledig hersteld in de waterige fase. Gepermethyleerd gesialyleerde glycanen vrijgelaten uit the mucine glycoproteïne verdeeld in DCM fase (figuur 5). Het herstel van elk gepermethyleerd glycanen van waterige organische verdeling was vergelijkbaar met dat van de eerder gekarakteriseerde C18 Sep-Pak clean-up methode 27. De efficiëntie en de eenvoud van de fase partitie methode aanzienlijk vergemakkelijkt monsters worden verwerkt en de daaropvolgende analytische benaderingen.
Figuur 5. Differential herstel van sulfo- en sialo-glycanen door fase partitie. Bovine mucine glycoproteïne werd verrijkt met een bekende hoeveelheid van een sulfo-glycaan standaard (sulfo-Le a) alvorens te worden onderworpen aan reductieve β-eliminatie. Vrijgegeven glycanen gepermethyleerd permethylation en de reactie werd ingesteld op 1: 1: water: DCM. De verkregen organische en waterige fasen werden gescheiden en MS geanalyseerd. Glycan herstel werd gekwantificeerd reltieve naar gepermethyleerd externe glycan normen, die werden verrijkt in het monster voor MS-analyse. Glycan herstel in de organische (DCM) en waterige (water) fase getoond ten opzichte van de externe standaard, die is ingesteld op 100%. Sulfoglycans niet detecteerbaar in de organische fase, maar kwantitatief teruggewonnen in de waterfase. Resultaten stellen het gemiddelde ± SE van drie onafhankelijke experimenten. Gewijzigd ten opzichte van Kumagai 25.
Toepassing op Diepgaande Proteomic en Glycomic Analyses in biologische monsters
Speeksel eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE en gekleurd met Coomassie Brilliant Blue (G-250). Een hoog moleculair gewicht eiwit op MW ~ 600 kDa werd uitgesneden uit de gel en een gedeelte van de gel stuk werd onderworpen aan in-gel tryptische digestie en LC-MS / MS-gebaseerde proteoomanalyse die band geïdentificeerd als MUC5B 16,24 . De rest van de gel stuk werd onderworpen aan in-gel redu ctive β-eliminatie voor O-glycanen analyse 27. Na permethylation en waterige organische fase partitie (Water: DCM 1: 1), gepermethyleerd glycanen in de waterige en organische fasen werden geanalyseerd door NSI-MS. Niet-gesulfateerde gepermethyleerd O-glycanen werden uit de organische fase en alle gepermethyleerd sulfoglycans werden uit de waterige fase, die de identificatie en karakterisering van bijna isobare gesulfateerde en niet-gesulfateerde glycanen, bijv vergemakkelijkt Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol (m / z = 1606,8 [M + Na] +) en (SO3) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc GalNAc 1-ol (m / z = 1606,7, [M + 2Na-H] +) verschillen 0,1 gewichtseenheden en moeilijk te lossen zonder fysiek scheiden van de twee soorten van fase scheidingswand (Figuur 6).
Pbelasting / 51840 / 51840fig6highres.jpg "width =" 700px "/>
Figuur 6. Detectie van isobare complexiteit in neutraal en sulfo-glycanen gescheiden door waterig-organische partitie. MS 2 fragmentatiepatronen verkregen uit ouderionen gedetecteerd door totale ion mapping (TIM) analyse van gepermethyleerd O-glycanen vrijgelaten uit menselijk speeksel mucine door in-gel β-eliminatie en water: DCM partitie volgende permethylation. (A) MS 2 van TIM analyse van DCM fase een 2,8 massaeenheid venster rond m / z = 1608. (B) Het MS 2 spectrum van dezelfde massa venster voor TIM analyse van de waterfase. In de DCM-fase grote fragment ionen overeen met verlies van Hex 1 -O (m / z 1370,8), Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 + Na (1331,8), verlies van Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), verlies Hex 1 HexNAc 1 (1.143,6), verlies van Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 (969,5), verliesvan Fuc 1 Hex 2 HexNAc 1 -O (747,4), Fuc 1 Hex 1 HexNAc 1 + Na (660,4), en Hex 1 HexNAc 1 + Na (486,3). Op basis van deze fragment ionen, wordt een mengsel van niet-gesulfateerde structuren met een samenstelling van Fuc 1 Hex 3 HexNAc 2 GalNAc-ol voorgesteld zoals getoond aan de rechterkant van het spectrum. Daarentegen grote fragment-ionen voor de waterfase zijn verlies van SO3 Na (1486,8), verlies van NeuAc (1231,5), verlies van Fuc 1 Hex 1 -O (1196,7), verlies van combinatie van NeuAc en SO3 Na ( 1111,8), en verlies van NeuAc 1 Hex 1 -O (1009,4). Een mengsel van gesulfateerde structuren met een samenstelling van (SO 3 -) 1 NeuAc 1 Fuc 1 Hex 2 HexNAc GalNAc 1-ol wordt voorgesteld. Zonder fysieke scheiding van de neutrale en sulfoglycans door fase-partitie, interpreteren MS 2 spectra van deze mengsels is aanzienlijk challenging. Gewijzigd ten opzichte van Kumagai 25. Klik hier om een grotere versie van de afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water, deionized water | Sigma-Aldrich | 270733-4L | CHROMASOLV, for HPLC |
| Acetic acid, Glacial | Fisher | A38-500 | Certified ACS ≥99.7% w/w |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-4L-R | CHROMASOLV, for HPLC, ≥99.9% |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830-500G | BioUltra, ≥99.5% (T), Step 1 |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | CHROMASOLV Plus, for HPLC, ≥99.9%, Step 1 |
| Ethyl acetate | Fluka | 34972-1L-R | LC-MS CHROMASOLV, Step 1 |
| Sodium borohydride | Aldrich | 213462-25G | ReagentPlus, 99%, Step 2 |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | ReagentPlus, 99.5%, Step 6. Store at 4 °C until use. Sit at room temperature before use. |
| Sodium hydroxide solution, 50% w/w | Fisher | SS254-1 | Certified, Step 6 |
| Dimethyl sulfoxide, anhydrous | Sigma-Aldrich | 276855-1L | Anhydrous, ≥99.9%, Step 6 |
| Methanol, anhydrous | Sigma-Aldrich | 322415-100ML | Anhydrous, 99.8%, Step 6 |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-4L | CHROMASOL®, for HPLC, ≥99.8%, contains amylene as stabilizer, Step 7 |
| Dowex 50WX8 hydrogen formhydrogen form 100-200 mesh | Sigma-Aldrich | 217506-500G | Step 3 |
| AG 50W-X8 Resin | Bio-Rad | 142-1441 | Step 3 |
| BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg Solid Phase Extraction Column, PP, Octadecyl (C18) Reverse Phase | JT Baker | JT-7020-01 | Step 5 and 8 |
| 7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | Step 1 | |
| Bio-Safe Coomassie Stain | Bio-Rad | 161-0786 | G-250, Step 1 |
| Silver Stain Kit for Mass Spectrometry | Pierce | 24600 | Step 1 |
| Oligosaccharides Kit (Maltotriose, Dp3: R474140) | Supelco | 47265 | |
| Oligosaccharides Kit (Maltotetraose, Dp4: R474135) | Supelco | 47265 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Glass, Short Tip | VWR | 14673-010 | Wash before use |
| PYREX 13 x 100 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-13 | Wash before use |
| PYREX 16 x 125 mm Disposable Round Bottom Threaded Culture Tubes | Corning | 99447-16 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-13 | Wash before use |
| Phenolic Caps/Closures with PTFE-Faced Rubber Liner | Kimble | 45066C-15 | Wash before use |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81265 | volume 500 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81165 | volume 250 μl, needle size 22 G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 81065 | volume 100 μl, needle size 22s G |
| Hamilton HPLC syringe | HAMILTON | 80965 | volume 50 μl, needle size 22s G |
| Hamilton Calibrated Syringes | HAMILTON | 80300 | volume 10 μl, needle size 26s G |
| Petri Dish Glass 100 mm x 15mm | GSC INTERNATIONAL INC | 1500-4 | Wash before use, Step 1 |
| Bard-Parker Surgical Blades | Fisher | 371310 | Step 1 |
| Reacti-Therm Heating/Stirring Module | Pierce | 18870 | Step 1, 4 and 7 |
| Heating Blocks | Fisher | 125D | Step 2 |
| Pyrex fiber glass wool borosilicate pore size 8 μm | Aldrich | CLS3950 | Step 3 |
| Fused Silica CutterTubing cutter | alltech | 3194 | Step 3 |
| Multi-tube vortexers | VWR | 444-7063 | Step 6 |
| Lyophilizer 25EL Freezemobile | Virtis | 25EL | |
| Centrifuge | VWR | Clinical 50 | |
| LTQ Orbitrap Discovery | Thermo Fisher Scientific |
References
- Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
- Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
- Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
- Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
- Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
- Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
- Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
- Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
- Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
- Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
- Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
- Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
- Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
- Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
- Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
- Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
- Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
- Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
- Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
- Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
- Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
- Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
- Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
- Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
- Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
- Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).
