Abstract
Sinds 1940 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is het verstrekken van biologen met ultra-hoge resolutie beelden van biologische materialen. Maar omdat bewerkelijke en tijdrovende protocollen vereisen ook ervaring bereiding van artefactvrij monsters TEM wordt niet als een gebruiksvriendelijke techniek. Traditionele monstervoorbereiding voor TEM gebruikt chemische fixatives om cellulaire structuren te behouden. Hogedruk invriezen is Cryofixatie biologische monsters onder hoge druk zeer snel afkoelsnelheid produceren, waardoor ijsvorming, hetgeen nadelig is voor de integriteit van cellulaire ultrastructuur beperken. Hoge druk invriezen en vries substitutie zijn de methoden van de keuze voor het produceren van de hoogste kwaliteit morfologie in harssecties voor TEM. Deze methoden minimaliseren van de artefacten normaal in verband met conventionele verwerking voor TEM van dunne secties. Na Cryofixatie het bevroren water in het monster wordt vervangen door vloeistoforganisch oplosmiddel bij lage temperaturen, een proces genaamd freeze substitutie. Freeze substitutie wordt meestal uitgevoerd over meerdere dagen in speciale, dure apparatuur. Een innovatie kan het proces drie uur te vullen, in plaats van de gebruikelijke twee dagen. Dit wordt meestal gevolgd door een aantal dagen van monstervoorbereiding dat infiltratie en inbedding in epoxyharsen voor het snijden omvat. Hier presenteren we een protocol combineert hoge druk invriezen en quick freeze substitutie waarmee planten monster fixatie kan worden bereikt binnen een paar uur. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het werken met andere weefsels of organismen. Plantenweefsels zijn van bijzonder belang vanwege de aanwezigheid van beluchte ruimtes en watergevulde vacuolen die ijsvrij bevriezing van water belemmeren. Bovendien is het proces van chemische fixatie is bijzonder lang in planten door celwanden de penetratie van de chemische belemmeren om diep in de weefsels. Plantaardige weefsels zijn daarom particularly uitdagend, maar dit protocol is betrouwbaar en produceert monsters van de hoogste kwaliteit.
Introduction
Onze kennis van cel ultrastructuur voornamelijk afkomstig elektronenmicroscopie, die informatie kan oplossen in het bereik van enkele nanometers 1. Ondanks het feit dat zo krachtig in resolutie TEM wordt niet beschouwd als gebruiksvriendelijk, als monstervoorbereiding vereist tijdrovend en moeizaam protocollen, en vereist enige expertise van de behandelaar. Traditionele fixatie van de monsters is gecombineerd gebruik van aldehyden en osmiumtetroxide vóór verdere verwerking die uitdroging omvat, inbedding in hars en vervolgens snijden om ultra-dunne secties die vervolgens worden gekleurd met zware metalen te produceren. Het is echter bekend dat chemische fixatie artefacten waaronder eiwit aggregatie en verlies van lipiden 1 en wijzigingen membranen die uiteindelijk invloed verscheidene cellulaire compartimenten 2 kan produceren. Deze artefacten zijn grotendeels toegeschreven aan de trage fixatie en dehydratatie bij kamertemperatuur 3, 4, 5.
6, 7. HPF afneemt a temperatuur monster met die van vloeibare stikstof, onder zeer hoge druk (210 MPa of 2.100 bar) in milliseconden. Wanneer goed uitgevoerd HPF voorkomt vorming van grote ijskristallen die grote schade aan cel ultrastructuur kan veroorzaken. HPF kan worden gebruikt om monsters van 100-200 urn dikte bepalen op typische concentraties van biologische opgeloste stoffen 7. Er zijn tal van recensies over de natuurkunde en de beginselen die ten grondslag liggen HPF, bijvoorbeeld 1, 7, 8.
Na HPF worden monsters geïncubeerd bij lage temperatuur (-78.5 ° C tot -90 &# 176, C) in de aanwezigheid van vloeibaar organisch oplosmiddel dat chemische fixatieven zoals osmiumtetroxide, meestal een paar dagen. Bij deze lage temperatuur wordt het water in het monster vervangen door het organische oplosmiddel, meestal aceton of methanol 1, 9. Daarom is deze werkwijze genoemd freeze substitutie (FS). Het monster wordt vervolgens geleidelijk verwarmd en gedurende deze tijd wordt vastgesteld, meestal met osmiumtetroxide en uranyl acetaat 9. Verknoping bij lage temperaturen heeft het voordeel vaststelling moleculen die geïmmobiliseerd 1. FS levert dus monsters van superieure kwaliteit in vergelijking met die van conventionele chemische fixatie bij kamertemperatuur vast, in het bijzonder het resulteert in een verbeterde ultrastructureel behoud, beter behoud van antigeniciteit en minder verlies van ongebonden cellulaire componenten 10, 11.
De meeste FS wordt over langere tijdsperioden uitgevoerd typisch tot enkele dagen. Dit is vooral true voor planten monsters 12, 13, 14. Een recent protocol ontwikkeld door McDonald en Webb vermindert de tijd voor FS van enkele dagen tot enkele uren 15. In hun snelvriesstrip substitutie (QFS) procedure, wordt FS over 3 uur uitgevoerd, terwijl in de supersnelle FS (SQFS) monsters worden verwerkt in 90 minuten. De kwaliteit van de monsters die door deze werkwijzen vergelijkbaar met die aan traditionele FS protocollen. We hebben de QFS protocol voor verdere verwerking van plantaardige monsters na HPF aangenomen. Het is gebleken dat niet alleen tijd, maar ook geld, zoals QFS en SQFS gebruiken gemeenschappelijke labapparatuur plaats van de dure handel verkrijgbare FS machines.
Plantenweefsels zijn vaak zeer moeilijk te bereiden TEM. Gemiddeld plantencellen groter dan zowel bacteriële of dierlijke cellen. De aanwezigheid van hydrofobe wasachtige cuticula, dikke celwanden, groot-water gevulde vacuolen bevatten organische zuren, hydrolasen en fenolische compounds die mogen nemen tot 90% van het totale celvolume 16, en de aanwezigheid van beluchte ruimtes ernstig vermindert warmtegeleidbaarheid van het systeem 17. Verder, in het geval van planten, de monsterdikte bijna altijd meer dan 20 urn, de limiet voor gebruik van chemische fixatie. Bij deze dikten, de lage warmtegeleidbaarheid van water voorkomt bevriezing percentage meer dan -10.000 ° C / sec in het midden van het monster. Dit percentage is nodig om schadelijke zeshoekige ijsvorming (ijskristallen met een lagere dichtheid en groter dan 10 tot 15 nm) te vermijden 8. Samen vormen deze huidige uitdagingen voor zowel de juiste vriespunt van het monster en de daaropvolgende FS. Toch Cryofixatie is de beste methode voor het bevestigen van planten monsters. Hier een protocol voor de HPF-QFS van plantaardige weefselmonsters wordt gepresenteerd. Het richt zich op het model soort Arabidopsis thaliana, maar is ook gebruikt met Nicotiana benthamiana. De typische resultaten tonen aan dat HPF-QFS produceert samples van vergelijkbare kwaliteit traditionele HPF-FS in een fractie van de tijd. Met de juiste aanpassingen kan dit protocol ook voor andere relatief dikke biologische monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De QFS procedure vereist uiterste zorgvuldigheid en voorzichtigheid door de gebruiker en wij deze veiligheidsmaatregelen benadrukken hier als voorzorgsmaatregelen en opmerkingen, indien van toepassing.
1.Voorbereiding voor HPF Run
- Vóór het begin van monstervoorbereiding, zet de hoge druk vriezer volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: De HPF eenheid die wordt gebruikt in dit protocol is een Wohlwend Compact 02-eenheid (Figuur 1A), en het duurt ongeveer 1-1-en-een-half uur van de start-up procedure voor HPF loopt kan beginnen.- Het inschakelen van de Wohlwend Compact 02 High Pressure Vriezer.
- Schakel het instrument door de hoofdschakelaar van "0" naar "1".
- Laat perslucht de machine.
- Laat vloeibare stikstof om de machine.
- Druk op de "SYSTEM opdrogen" knop.
- Na 30 min, druk op de "SYSTEM opdrogen "nogmaals op de knop.
- Druk op de "ON / OFF"-toets om over te schakelen op het instrument.
- Druk op de "nitrogen" knop.
- Laat de machine afkoelen voor 20 minuten, zelfs als de "DRIVE IN" knop al heeft verlicht.
- De "DRIVE IN" toets licht op.
- Druk op de "DRIVE IN" knop.
- Drukt u op de knop "AUTO".
- De "SYSTEM READY"-knop gaat branden.
- Plaats de temperatuur-en-druk-sonde in de drukkamer en vergrendel deze met de pin.
- Druk op de "JET AUTO" knop. Deze stap controleert of de drukverhoging en temperatuurdaling wens zijn; in wezen een proefvaart. Scherpe dalingen van de temperatuur en de scherpe stijging van de druk wordt verwacht (Figuur 1B).
- Voeren twee JET cycli.
- Het inschakelen van de Wohlwend Compact 02 High Pressure Vriezer.
2 Voorbereiding voor Receiving Frozen Monsters
- Vul een isolatiebox met cryovial houders met vloeibare stikstof (zie Veiligheidsmaatregelen), waardoor de houders volledig bedekt (figuur 1C).
OPMERKING: Gebruik PBM inclusief cryogloves en een veiligheidsbril bij het werken met vloeibare stikstof. - Plaats het juiste aantal flesjes die de FS medium in de aluminiumbuis houders in de vloeibare stikstof (figuur 1C). Met dit protocol maximaal vier schijven die elk een enkel monster in een cryovial kan worden geplaatst.
OPMERKING: De flacons moeten met een scherp instrument zoals een gediamanteerde schrijver, en zeer zacht potlood worden geëtiketteerd.- Voor fixatief tijdens QFS gebruiken 1% OsO 4 en 0,1% uranylacetaat in aceton 9. Bereid de oplossing grote hoeveelheden afzien aliquots van 1,5 ml in cryoflesjes en opslag in vloeibare stikstof ingevroren.
OPMERKING: Volg de veiligheidswaarschuwingen voor het omgaan OsO 4 en uranylacetaat.
OPMERKING: OsO 4 OPMERKING: De cryovials gebruikt om monsters te QFS houden moet harde O-ring zodat de buizen verzegeld blijven tijdens QFS lekkage van OsO 4 te vermijden.
- Voor fixatief tijdens QFS gebruiken 1% OsO 4 en 0,1% uranylacetaat in aceton 9. Bereid de oplossing grote hoeveelheden afzien aliquots van 1,5 ml in cryoflesjes en opslag in vloeibare stikstof ingevroren.
- Bereid gist pasta door het mengen van bakkersgist met een ongeveer gelijk volume van 10% methanol met een tandenstoker of een ander dergelijk instrument, totdat de pasta glad is. De gistpasta fungeert als een extracellulair cryoprotectant en wordt gebruikt om de ruimte rond het monster in de monsterdrager vullen. De hoeveelheid pasta afhankelijk van het aantal monsters; 10 monsters of minder de pasta (1 ml) worden gemengd in een microcentrifugebuis.
3 Hoge druk Bevriezing van Monsters
- Verwijderen van een blad (of ander weefsel) van de belangstelling van de plant en zachtjes leg het op een stuk dental was of ander snijoppervlak. Gebruik een punch van 2,0 mm of de gewenste grootte van een steekproef uit het blad te snijden. Behandel het monster voorzichtig met een pincet en zo snel mogelijk te werken.
- Werken onder een stereomicroscoop, plaatst de bladschijf in de 0,2 mm kant van het type A specimen drager en bedek volledig in gist plakken. Zorg ervoor dat de schijf volledig is gevuld en de pasta is ter hoogte van de rand van de houder door het gladstrijken van de pasta met een fijn penseel (figuur 2).
- Plaats de drager in de monsterhouder. Bedek het monster met het type B specimen drager, vlakke ondergrond neer.
OPMERKING: Het monster houder moet droog en op kamertemperatuur zijn. - Neem monster in specimen houder, plaatst u deze in de machine en start een bevriezing cyclus door op de "JET AUTO"-knop, die moet voltooien in een seconde of twee.
- Zo snel mogelijk te werken, verwijder de houder uit de machine en plaats de tip die de sample in vloeibare stikstof in de geïsoleerde doos op de HPF machine. Dompel de uiteinden van twee paar tang in de vloeibare stikstof worden gekoeld.
OPMERKING: Na het bevriezen, de dragers mogen alleen worden met vloeibare stikstof gekoelde pincet behandeld. Warm (kamertemperatuur) tang zijn vaak de oorzaak van de storing in cryotechniques. - Open een cryovial met de FS media en plaats het deksel aan de zijkant van de box. Met behulp van een paar van vloeibare stikstof gekoeld tang, verwijder voorzichtig de schijf uit de monsterhouder, ervoor te zorgen dat de schijf is altijd in de vloeibare stikstof of damp. Werken in vloeibare stikstof damp, houdt de FS buis met een voorgekoeld pincet en gebruik de andere om de houder te plaatsen in de FS flacon. Schroef het deksel van de FS flesje weer. Zorg dat er geen enige vloeibare stikstof in de flacon.
OPMERKING: Bij het overbrengen van monsters om cryovials voor QFS, ervoor zorgen dat er geen vloeibare stikstof wordt gevangen in de flesjes. Vloeibare stikstof breidt 700-voudig tijdens verwarmen en eventuele trapped vloeibare stikstof explosies veroorzaken tijdens deze periode. - Herhaal stap 3,1-3,7 totdat alle gewenste monsters bevroren. Meerdere bladschijven die dezelfde soort monster kan in hetzelfde flesje geplaatst. Merk op dat de monsterhouder te drogen en op kamertemperatuur gebracht tussen freezen runs. Om dit snel te doen, verwarmen met een föhn, en de controle op de temperatuur op de tast.
4 Voorbereiding op Freeze Substitutie
- Volledig onder te dompelen de aluminium heater blok in vloeibare stikstof gedurende 10 minuten of totdat kiemkoken stopt. Terwijl dit gebeurt, plaats een laag droog ijs (1-2 cm) op de bodem van de houder als de ruimte FS (figuur 3). Een storaxschuimcontainer of ijsemmer kan voor FS, samen met gemalen droog ijs of pellets.
- Plaats vlug de cryovials met de monsters samen met de temperatuursensor in de middelste rijen van het verwarmingsblok. Zorg ervoor dat de deksels op deflacons zijn stevig vastgeschroefd, zodat de FS media niet lekken tijdens FS. De gegevens van de temperatuur.
- Voeg de temperatuursonde door een thermokoppel door de bovenkant van een cryovial zodat de bodem van de buis bereikt. Sluit de deksel van de buis met hars zodat er geen vloeistof lekt. De buis 1,5 ml aceton bij het begin van elke QFS run.
- Met behulp van geïsoleerde cryogloves of grote tang, giet alles uit de vloeibare stikstof uit de verwarming blok. Zorg ervoor dat u giet de cryovials.
OPMERKING: Gebruik PBM inclusief cryogloves en een veiligheidsbril bij het werken met vloeibare stikstof. - Plaats het blok met de flesjes op de laag van droog ijs in de QFS kamer. Zorg ervoor dat het blok wordt geplaatst, zodat de buizen horizontaal liggen, maar met een lichte opwaartse tilt. Er mag geen lekkage als de juiste cryovials gebruikt.
- Verpak de QFS kamer met droogijs zodat de FS buizen bedekt, hoewel het niet noodzakelijkbedek de bovenkant van het blok. Plaats het deksel op de kamer.
5 Quick FS
OPMERKING: Voer de QFS run in een zuurkast in het geval dat elke lekkage van OsO 4 per ongeluk optreedt ondanks andere voorzorgsmaatregelen.
- Plaats QFS kamer op een platform rotatieschudinrichting in een zuurkast en draaien met 125 rpm gedurende 120 min. Gedurende deze tijd de temperatuur van het blok geleidelijk toenemen tot ongeveer -80 ° C. Het roeren zorgt mengen van de componenten beter FS.
OPMERKING: De plaatsing van de shaker in de zuurkast en de positie van de zuurkast deur moet in de gehele QFS procedure en voor ieder QFS werking vaste opwarming monsters waarborgen. - Verwijder het droogijs uit de kamer en ga schudden een uur.
OPMERKING: de temperatuur zou toenemen tot ongeveer -15 ° C tot -20 ° C. - Verwijder de monsters en temperatuursonde van de QFS kamer en op deshaker bij kamertemperatuur gedurende nog 10-15 min, totdat ze bij kamertemperatuur. Stop met het opnemen van de temperatuur.
- Tijdens FS, schakelt u de HPF machine.
- Sluit de kraan van de vloeibare stikstof tank terwijl het HPF machine wordt gevuld met stikstof.
- Druk op de "nitrogen" knop.
- Wacht tot het rode "ZUIGERMOTOREN DOWN" licht gaat uit.
- Druk op de "ON / OFF" knop.
- Druk op de "SYSTEM opdrogen" knop.
- Snijd de toevoer van samengedrukte lucht naar de machine.
- Na een minimum van 12 uur (om uitdroging van vocht te garanderen), schakelt u de machine uit door de hoofdschakelaar van "1" naar "0".
6 Bericht FS Processing
- Verwijder voorzichtig de FS media met plastic pipetten en plaats het in de juiste container voor giftig afval.
OPMERKING: OsO 4 en uranylacetaat zijn gevaarlijke chemische stoffenen moet in de zuurkast worden behandeld tijdens het dragen van de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), met inbegrip van gesloten-toed schoenen, laboratoriumjas en handschoenen. - Spoelmonsters vier maal met 100% aceton. Verzamel de eerste twee wasbehandelingen en plaats in het giftige afval container.
- Met behulp van fijne tang, verwijder de weefselmonsters van de houders. Houd monsters nat met aceton als dit wordt gedaan, en werken heel voorzichtig te breken monsters te voorkomen.
Opmerking: Het is niet ongewoon en kan zelfs handig zijn de gistpasta weg van de monsters vallen op dit punt. De gist pasta is meestal erg donker bruin, terwijl het blad weefsel is nog groen. - Het verzamelen van de monsters in cryovials met aceton. Ga verder met monstervoorbereiding (infiltratie en inbedding) voor TEM volgens gebruikelijke protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onderstaande resultaten zijn verkregen met behulp van een Wohlwend Compact 02 voor HPF (figuur 1A). Een groot voordeel van dit instrument is het gemak van het gebruik van het model dragers en de houders ervan. Bij het gebruik van andere instrumenten, McDonald raadt twee gebruikers de monstervoorbereiding en HPF, men moet uitvoeren voorbereiding van de monsters en de andere doet het invriezen en transfer naar de FS cryovials 9. De Wohlwend monsterdragers en houder is eenvoudig genoeg voor een gebruiker om onafhankelijk te manipuleren (figuur 2A, B, E, F en G). Er dient echter te worden opgemerkt dat een enkele proef zou moeten uitvoeren om vertrouwd te raken met de HPF instrument geworden voor het werken met waardevolle monsters. Een ervaren gebruiker zou kunnen meerdere (10 of meer) exemplaren vastgesteld per uur. Echter, de in dit protocol beginselen worden gebruikt met elk van de commercieel beschikbare HPF machines.
Misschiende meest kritische deel van de HPF-QFS procedure is de monstervoorbereiding voor het laden in het model drager (figuur 2C). Hoewel dit niet intuïtief zijn, is de stap in het protocol dat de onderzoeker meeste controle. De HPF machine is robuust, en met het juiste gebruik en het onderhoud moeten de verwachte veranderingen in druk en temperatuur te produceren met weinig variatie tussen de monsters. Als een monster slecht wordt behandeld tijdens de bereiding dan geen andere stap zal de schade te vergoeden verlossen. Plantenweefsels zijn vrij gemakkelijk te manipuleren tijdens deze fase van het proces omdat zij niet gekweekt in medium en de cellen muren geven de cellen goede sterkte. Het is echter belangrijk dat de monsters snel worden behandeld om ultrastructurele veranderingen die het gevolg zijn van het verwijderen van de moederplant te voorkomen en stress en het verwonden reacties te beperken. Het kleinste exemplaar vervoerder die plaats biedt aan een steekproef moet worden gebruikt om te zorgen voor een efficiënte en consistente HPF (Figure 2C). Ten slotte moet het specimen drager worden gevuld, maar niet overvol (figuur 2D). De gevulde specimen drager is gemakkelijk in het HPF machine voor het invriezen (Figuur 2 H en I).
De eerste stappen in de QFS protocol kan uitdagend zijn voor een beginner, dus het is aan te bevelen dat twee mensen samen moeten werken tot gebruikers tevreden zijn met de procedure (figuur 3A-E). Voorzichtigheid is geboden bij het hanteren van vloeibare stikstof en het fixatives osmiumtetroxide en uranylacetaat. Een kenmerkende curve voor temperatuurveranderingen tijdens QFS weergegeven in figuur 2J. De temperatuur stijgt snel van -196 ° C, de temperatuur van vloeibare stikstof tot ongeveer -80 ° C. Het is bij temperaturen van ongeveer -78 ° C tot -90 ° C die bevriezen substitutie vindt waarschijnlijk plaats 9. Een moeilijke stap in de QFS protocol is de verwijdering van droogijs na 2 uur FS. Bijdeze stap, verkeerd gebruik van de monsters kan een piek in de temperaturen te produceren. Hiervoor moet de verwarming blok snel worden opgetild uit de QFS kamer met een cryoglove en het droogijs snel uitgegoten in een secundaire container.
HPF werd gebruikt om verschillende plantenweefsels zoals Nicotiana benthamiana bladeren en Arabidopsis bladeren en embryo vast. Het is moeilijk om monsters van volwassen bladeren lossen zijn door de grote centrale vacuolen van de meeste cellen. Jongere bladeren bevatten kleinere vacuolen maar de trichomen zijn meestal vrij dicht op elkaar gepakt. De aanwezigheid van de trichomen kan het moeilijk maken om de monsters met gistpasta pakken maar zorg moet worden gezorgd dat deze goed wordt gedaan om de hoeveelheid lucht gevangen tussen het bladoppervlak en de pasta minimaliseren. De ingesloten lucht zal warmteoverdracht tijdens HPF belemmeren en vermindering van de kwaliteit van de fixatie. Dit geldt voor een monster.
Na HPF en QFS monsters kunnen worden bereid voor viewing onder de TEM door te infiltreren en verankering met hars. Dunne lagen van 65-100 nm kan vervolgens worden bereid door snijden. Typische resultaten worden getoond in Figuur 4. De getoonde afbeeldingen zijn van Arabidopsis bladmonsters. Plasma membranen zijn gewoonlijk vlak en gedrukt tegen de celwand, een teken van goede fixatie (Figuur 4A, C en E). Andere organellen zoals chloroplasten (Figuur 4A, D, F en H) en thylakoiden (figuur 4B), mitochondria (figuur 4D en F), Golgi (figuur 4 G), microtubuli (figuur 4E) en ribosomen (vooral figuur 4C) zijn ook duidelijk zichtbaar en de grote centrale vacuolen blijven intact (Figuur 4A). Slechte behandeling tijdens het HPF-QFS resultaten in artefacten zoals ijskristal-geïnduceerde schade (Figuur 4D) en plasmolyse (figuur 4H). Lead neerslag kan ook vormen tijdens kleuring van secties (Figuur 4F).
Figuur 1: De Wohlwend Compact 02 High-Pressure Freezer (A) De Wohlwend Compact 02 HPF machine gebruikt voor Cryofixatie met de aangesloten computer terminal.. De monsters worden in de voorkant van de machine (kleine cirkel) ingevroren. Een temperatuur-curve kan worden gegenereerd op de computer scherm voor elke run, zoals gewenst door de gebruiker. (B) Een typische temperatuur-druk-curve voor een HPF run. De gele en paarse lijn geven de temperatuur en druk respectievelijk. Let op de steile hellingen van beide curves. De hoge druk wordt gehandhaafd gedurende ongeveer 400 msec. Elk interval op de x-as de 50 msec. De gegevens werden verzameld met EasyScopeII voor DSIM12 software. (C) De geïsoleerde doos en deksel voor opslag gebruikt of ingevroren monsters direct na bevriezing kan gemakkelijk worden geplaatst op de top van de HPF machine. Het is gevuld met vloeibare stikstof. De ronde aluminium containers houden de cryovials.
Figuur 2: Het voorbereiden weefselmonster voor HPF. (A) Het monster houder voor de Compact 02 HPF machine in zijn gesloten configuratie. (B) Het monster houder is geopend. (C) Een blad monster in de 0,2 mm en van een type A specimen drager. De andere kant van deze drager is 0,1 mm diep. (D) Het blad monster bedekt met gist plakken. Merk op dat de vervoerder is vol, maar niet overvol. (E) Het monster drager in de monsterhouder. (F) Het monster wordt behandeld met het type B drager. Deze drager heeft een plat oppervlak en anderzijds een goed dat0,3 mm diep. Hier het vlakke oppervlak met daartussen het monster. (G) De monsterhouder is gesloten en klaar voor gebruik in de HPF machine. (H) De opening aan de voorzijde van het HPF instrument waarin de monsterhouder invriezen ingevoegd . (I) de temperatuur en druk probe / houder ingebracht in de HPF machine. (J) Een typische temperatuurcurve voor een QFS run (data verzameld met EasyLog software). Temperatuur werd geregistreerd elke seconde. De piek aan het begin van de run is door de elektronica van de gebruikte probe en niet strookt echte temperatuurmeting.
Figuur 3:. Apparatuur gebruikt in QFS QFS kan op elke geïsoleerde container worden uitgevoerd, zoals een piepschuim doos of een emmer mee (A) <./ Strong> Een laag van droog ijs 1-2 cm diep bedekt de bodem van de QFS kamer, hier een piepschuim doos. (B) Een heater blok met 13 mm gaten wordt gebruikt om huis monsters tijdens QFS. De temperatuursensor met digitale data logger is geplaatst in het verwarmingsblok. (C) Na koelen van het verwarmingsblok in vloeibare stikstof de monsters in het blok geplaatst, wordt de vloeibare stikstof uitgegoten en het gehele samenstel wordt in de kamer QFS . met droogijs (D) De QFS kamer gevuld met droog ijs, zodat de monsters bedekt; er is geen nadeel aan die de hele heater blok met droogijs. (E) De kist is bedekt en vervolgens verplaatst naar de roterende shaker in een zuurkast waar de monsters wordt geschud gedurende de QFS procedure.
Figuur4:.. Arabidopsis bladeren bereid door HPF-QFS Resultaten verkregen voor monsters bereid door HPF-QFS en afgebeeld door TEM op een Zeiss Weegschaal 200 HT FE MC (A) Een afbeelding medium sterke vergroting met een chloroplast (CH) met celwanden en cytoplasma van aangrenzende cellen. De vacuolen (V) bevatten elektronen dicht materiaal. Schaal bar = 0,5 urn. (B) Een sterke vergroting beeld van een chloroplast. Schaal bar = 100 nm. (C) een hoge vergroting beeld van de celwand tussen aangrenzende cellen. Een vertakt plasmodesma zichtbaar (pijl). Let op de gladde plasmamembraan gedrukt tegen de celwand van de vacuole. Het cytoplasma wordt dicht op elkaar gepakte met ribosomen. V vacuole. De tonoplast is vloeiend. Schaal bar = 200 nm. (D) Een afbeelding lage vergroting waarop de gebieden van goede fixatie in de chloroplast (CH) in de buurt van de regio's op schade (asterisk). Schaal bar = 0,5 micrometer. (E) Een sterke vergroting van een mobiele wall en de microtubuli. Schaal bar = 100 nm. (F) Afbeelding met goede conservering van chloroplasten (CH) en mitochondria (M). Grote zwarte neerslag is wel vlekken secties met lood citraat. Schaal bar = 1 micrometer. (G) Hoge vergroting uitzicht van Golgi (GA). Schaal bar = 200 nm. (H) slecht bewaard gebleven voorbeeld toont een gebrek aan informatie in de chloroplasten en plasmolyse (zwarte pijl). Schaal bar = 1 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het succes van het protocol hier gepresenteerde sterk afhankelijk van de gebruiker. Eerst wordt geavanceerde voorbereiding nodig om ervoor te zorgen dat alle benodigde materialen zijn direct beschikbaar en in voldoende hoeveelheid om een hele HPF-QFS run te voltooien. Ten tweede moet de gebruiker sneller werken, overgang van stap tot stap op efficiënte wijze dat sample handling minimaliseert, waardoor veranderingen in de natieve toestand van het weefsel te minimaliseren. Zodra monsters worden ingevroren en voordat ze zijn uitgedroogd is het noodzakelijk dat ze koud worden bewaard, dus zorg moet worden genomen om te hanteren die per ongeluk kan opwarmen van de steekproef, bijvoorbeeld te voorkomen, behandelen met een gehandschoende hand in plaats van pre-gekoelde pincet. Snelheid en efficiëntie verhogen met bekendheid met het protocol, zodat de praktijk runs worden aanbevolen alvorens je monsters van belang vast te stellen. Ten derde moet de gebruiker zich bewust van de gevaren van de chemicaliën die in het FS medium en de gevaren van het werken met vloeibare stikstof en droogijs blijven. Een zuurkast is noodzakelijk voor het opstellen van de FS medium en voor de QFS procedure. Voor alle andere stappen, de benodigde persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas, dichte schoenen en een veiligheidsbril aan te bevelen.
De voordelen van Cryofixatie plaats van chemische fixatieven bij kamertemperatuur voor het bereiden van monsters voor TEM, waaronder planten, zijn lang 10. Een vergelijkende studie van de ultrastructuur van wortel tips van Nicotiana en Arabidopsis door HPF of chemische fixatieven vaste vond dat de HPF-FS-methode gaf veel betere resultaten 5. In weefsel bereid door HPF-FS de plasmalemma en andere cellulaire membranen is gladder, de plasmalemma was vlak tegen de celwand, en in het algemeen organellen zoals microtubuli werden beter behouden dan wanneer monsters werden vastgesteld door conventionele methoden. Een andere studie van soja wortelknolletjes concludeerde dat "Chemische fixatie door gebufferd glutaaraldehydeniet de ultrastructuur van soja wortelknolletjes te bewaren in een staat die de correlatie tussen structuur en functie. toelaat "En het blijft om te zeggen dat het enige beschikbare alternatief is HPF-FS 2. Plasmodesmata zijn membraangebonden kanalen plantencellen verbinden met hun buren, maar waarvan de onderbouw is moeilijk zelfs onder TEM te lossen. Cryofixatie door HPF of met een propaan jet vriezer gevolgd door FS werd verkozen boven chemische fixatie in studies gericht op het ophelderen van de fijne details van plasmodesmal structuur 18. Ondanks deze vroege bevindingen, TEM studies op conventioneel vastgelegd weefsels zijn nog steeds de norm in de fabriek wetenschappen. Dit kan komen door een eenvoudige hechting traditionele methoden of de schijnbaar hoge kosten van HPF-FS apparatuur gekoppeld met de lange tijd preparatieve Voor gangbare FS protocollen.
De procedure voor QFS is een recente innovatie in het versnellen van de monstervoorbereiding voor TEM 15. QFS is geweestgebruikt voor het bereiden gehele C. elegans en N. benthamiana verlaat na Cryofixatie 15. Dit zijn relatief dikke stalen door HPF vast te stellen, en de voorbereiding van Nicotiana monsters door HPF-FS is van oudsher gebruikt om zeer lange FS keer 12, 13, 14. Voor dit protocol hebben we gebruik gemaakt van de bladeren van de modelplant Arabidopsis. De reden voor FS lange tijd voor Nicotiana en andere plantaardige monsters dat uitwisseling van oplosmiddelen en water zal worden afgeremd door de grote vacuolen van de cellen. Er wordt verwacht dat ontglazing van een goed bevroren monster moet resulteren in minimale schade aan de cellen (15 en refs. Daarin). Als ijs schade ontstaat het wordt waarschijnlijk veroorzaakt door het bevriezen zelf en niet de QFS. Gerapporteerd nog dichter protocol voor FS 15. Deze super snelle FS (SQFS) gebruikt slechts 90 min voor FS. In dit protocol worden de monsters in het verwarmingsblok geroteerd bij 100 rpm in afwezigheid van droge ice, zonder voor SQFS kamer. Hierdoor kan de monsters bereikt -80 ° C snel. De monsters worden vervolgens verwijderd uit de verwarming blok en op kamertemperatuur laten komen op de wip. SQFS is met succes gebruikt om cellen in kweek en E. dehydrateren coli-cellen. We hebben nog niet geprobeerd SQFS gebruiken plantmonsters door de dikte van de plantenweefsels.
Het protocol voor cryofixing en vervolgens ontwateren plantenmonsters door tandem HPF en QFS vertegenwoordigt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de huidige protocollen. De tijd voor monstervoorbereiding voor hars infiltratie wordt nu gereduceerd tot enkele uren in plaats van enkele dagen. Naast de ontwikkeling van de QFS methode 15, heeft McDonald ook onlangs gepubliceerde protocollen voor de snelle infiltratie van plantaardige weefsels met hars volgende SQFS zonder droogijs 19. Plantaardige weefsels worden meestal langzaam geïnfiltreerd met hars door een aantal lange incubatie, inclusief overnachting. Deze nieuwe protocols resulteren in nog kortere monster doorlooptijden: 6 uur bevriezen tot snijden. Dus in de toekomst, moet de combinatie van HPF-QFS en snelle infiltratie huidige protocollen voor planten-monstervoorbereiding voor TEM vervangen. Bovendien, de QFS procedure worden gewone laboratorium apparatuur die is goedkoop en kan worden gebruikt voor meerdere doeleinden, hoewel commerciële QFS kit is beschikbaar via Electron Microscopy Sciences (http://www.emsdiasum.com). Ofwel optie betekent een enorme besparing op de kosten van de aanschaf van een speciale bevriezen substitutie-eenheid die kan kosten meer dan $ 50.000.
Opgemerkt zij dat de aanvragen van monsters bereid door HPF en FS gerekend routine TEM analyse. Monsters die op deze wijze behouden hun antigeniciteit en kunnen daarom worden gebruikt in antilichaam-gebaseerde benaderingen, waaronder immunogoud labeling 17, 19. Deze monsters kunnen ook worden gebruikt voor geavanceerde driedimensionale structurele analysesvia electron tomography 20. HPF-FS monsters kunnen ook worden gebruikt met correlatieve licht EM 21, 22. Aldus voortdurende verbeteringen in de procedures voor cryofixing en vervolgens dehydrateren monsters gunstig diverse onderzoekers die in diverse systemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De vriendelijkheid en vrijgevigheid van Dr Kent McDonald van UC Berkeley worden zeer gewaardeerd. Wij danken een anonieme reviewer voor zeer nuttige tips. De Burch-Smith lab wordt ondersteund door het opstarten van fondsen van de universiteit van Tennessee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
