Abstract
Siden 1940-tallet transmisjonselektronmikroskopi (TEM) har levert biologer med ultra-høyoppløselige bilder av biologisk materiale. Likevel, på grunn av arbeidskrevende og tidkrevende protokoller som også krever erfaring i utarbeidelse av artefakt frie prøver, TEM er ikke betraktet som en bruker-vennlig teknikk. Tradisjonelle prøveopparbeidelse for TEM brukt kjemiske fiksativ å bevare cellulære strukturer. Høytrykks frysing er cryofixation av biologiske prøvene under høyt trykk for å produsere svært raske kjøling priser, og dermed begrense isdannelse, som er skadelig for integriteten til mobil ultrastructure. Fryse substitusjon høytrykks frysing og er i dag de metoder av valget for å produsere den høyeste kvalitet morfologi i harpiks seksjoner for TEM. Disse metodene minimalisere gjenstander som normalt forbindes med konvensjonell behandling for TEM av tynne seksjoner. Etter cryofixation det frosne vann i prøven er erstattet med flytendeorganisk løsningsmiddel ved lave temperaturer, en prosess som kalles fryse substitusjon. Freeze substitusjon er vanligvis utført over flere dager i dedikerte, kostbart utstyr. En fersk innovasjon gjør at prosessen skal være ferdig i tre timer, i stedet for de vanlige to dager. Dette er vanligvis etterfulgt av flere dager med prøveopparbeidelse som inkluderer infiltrasjon og innstøping i epoxyresiner før seksjonering. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer høytrykks frysing og hurtigfrys substitusjon som gjør at anlegget prøven fiksering skal gjøres i løpet av timer. Protokollen kan lett tilpasses for å arbeide med andre vev eller organismer. Plantevev er av spesiell interesse på grunn av tilstedeværelsen av karbonisert mellomrom og vannfylte vakuoler som hindrer isfritt frysing av vann. I tillegg er prosessen med kjemisk fiksering særlig lenge i planter på grunn av celleveggene som hindrer inntrengning av kjemikaliene til dyp i vev. Plantemateriale er derfor particsig utfordrende, men denne protokollen er pålitelig og produserer prøver av høyeste kvalitet.
Introduction
Vår kunnskap om celle ultrastructure kommer hovedsakelig fra elektronmikroskopi, som kan løse detaljer i størrelsesorden noen få nanometer en. Til tross for å være så kraftig i oppløsning TEM ikke anses brukervennlig, som prøveopparbeidelse krever tidkrevende og arbeidskrevende protokoller, og krever litt kompetanse fra utøveren. Tradisjonell festing av prøvene har kombinert bruk av aldehyder og osmiumtetroksyd før ytterligere behandling som omfatter dehydrering, innstøping i harpiksen og deretter seksjonering for å produsere ultra-tynne seksjoner, som deretter farget med tungmetaller. Imidlertid er det kjent at kjemisk fiksering kan produsere gjenstander inkludert protein aggregering og tap av lipider 1, og endringer i membraner som til slutt berører flere cellulære avdelinger to. Disse gjenstander er i stor grad tilskrives den langsomme rate av fiksering og dehydrering ved romtemperatur 3, 4, 5.
6, 7. HPF reduserer en prøvens temperatur til den for flytende nitrogen, under høyt trykk (210 MPa eller 2100 bar) i millisekunder. Når gjort riktig HPF hindrer dannelse av store iskrystaller som kan forårsake store skader på celle ultrastructure. HPF kan brukes til å løse prøver av 100-200 mikrometer tykkelse ved typiske konsentrasjoner av oppløste stoffer biologiske 7. Det er mange vurderinger på fysikk og prinsipper som ligger til grunn HPF, f.eks 1, 7, 8.
Etter HPF, blir prøvene inkubert ved lav temperatur (-78,5 ° C til -90 &# 176, C) i nærvær av flytende organiske løsningsmiddel inneholdende kjemisk fiksativ som osmiumtetroxyd, vanligvis i noen dager. Ved denne lave temperatur, blir vannet i prøven erstattet av det organiske oppløsningsmiddel, vanligvis aceton eller metanol 1, 9. Dermed er denne prosess kalt fryse substitusjon (FS). Prøven blir deretter gradvis oppvarmet og i løpet av denne tiden er fast, vanligvis med osmiumtetroxyd og uranyl-acetat 9. Kryssbinding ved lave temperaturer har den fordel at feste molekyler som er immobilisert en. FS derfor produserer prøver av overlegen kvalitet i forhold til de som er faste ved konvensjonell kjemisk fiksering ved romtemperatur, i særdeleshet det resulterer i forbedret ultra bevaring, bedre bevaring av antigenisitet og redusert tap av ubundne cellulære komponenter 10, 11.
De fleste FS blir utført over lange tidsperioder, typisk opp til flere dager. Dette er spesielt true for planter prøver 12, 13, 14. En fersk protokoll utviklet av McDonald og Webb sterkt reduserer tiden for FS fra flere dager til noen timer 15. I deres hurtigfrys substitusjon (QFS) prosedyre, er FS utført over 3 timer, mens i de super raske FS (SQFS) prøver blir behandlet i løpet av 90 minutter. Kvaliteten av prøver fremstilt ved disse metodene er sammenlignbare med de som er gitt av tradisjonelle FS protokoller. Vi har tatt i QFS protokoll for nedstrøms bearbeiding av planteprøver etter HPF. Dette har vist seg å ikke bare spare tid, men også penger, som QFS og SQFS bruke sunn lab utstyr i stedet for de dyre kommersielt tilgjengelige FS maskiner.
Plantemateriale er ofte svært utfordrende å forberede TEM. I gjennomsnitt, planteceller er større enn enten bakterie-eller dyreceller. Nærværet av hydrofobe voksaktig hårstråene, tykke cellevegger, store vannfylte vakuoler som inneholder organiske syrer, hydrolaser og fenoliske compounds som kan oppta inntil 90% av det totale cellevolum 16, og tilstedeværelsen av karbonisert mellomrom sterkt reduserer varmeledningsevnen av systemet 17.. Videre, i tilfelle av planter, prøvetykkelse nesten alltid overskrider 20 mikrometer, den grense for bruk av kjemisk fiksering. Ved disse tykkelser, den lave varmeledningsevne av vann hindrer en frysehastighet mer enn -10 000 ° C / sek i sentrum av prøven. Den hastigheten som kreves for å unngå skadelig sekskantede isdannelse (iskrystaller med en lavere tetthet og større enn 10 til 15 nm) 8. Sammen utgjør disse gi utfordringer til både riktig frysing av prøven og påfølgende FS. Likevel er cryofixation den beste metoden for å fikse planteprøver. Her en protokoll for HPF-QFS av plante vevsprøver er presentert. Den fokuserer på modellen arter Arabidopsis thaliana, men har også blitt brukt med Nicotiana benthamiana. Den typiske resultater viser at HPF-QFS produserer SAmples av tilsvarende kvalitet til tradisjonelle HPF-FS på en brøkdel av tiden. Med riktige justeringer, kan denne protokoll også brukes til andre forholdsvis tykke biologiske prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: QFS prosedyren krever ekstrem forsiktighet og varsomhet av brukeren, og vi fremheve disse sikkerhetsreglene her som forholdsregler og merknader der det er aktuelt.
1.Klargjøring for HPF Run
- Før du begynner prøveopparbeidelse, slå på høytrykks fryser etter produsentens anvisninger.
MERK: HPF enhet som brukes i denne protokollen er en Wohlwend Compact 02 enhet (figur 1A), og det tar ca 12:59-og-en-halv time med oppstartsprosedyren før HPF løper kan starte.- Slå på Wohlwend Compact 02 Høytrykks Fryser.
- Slå på instrumentet ved å slå av hovedbryteren fra "0" til "1".
- Slipp trykkluft til maskinen.
- Slipp flytende nitrogen til maskinen.
- Trykk på "SYSTEM tørke opp" knappen.
- Etter 30 min, trykk på "SYSTEM tørke opp "-knappen igjen.
- Trykk på "ON / OFF"-knappen for å slå på instrumentet.
- Trykk på "Nitrogen" knappen.
- La maskinen kjøle seg ned i 20 min selv om "Drive in" knappen har allerede opplyst.
- Den "Drive in" knappen lyser.
- Trykk på "Drive in" knappen.
- Trykk på "AUTO"-knappen.
- "System KLAR" knappen tennes.
- Plasser temperatur-og-trykkonde inn i trykkammeret, og låse den med stiften.
- Trykk på "JET AUTO" knappen. Dette trinnet sjekker at trykkøkning og temperatursenkning er som ønsket; egentlig en prøvetur. Skarpe fall i temperatur og sterk økning i trykket forventes (figur 1B).
- Gjennomføre to JET sykluser.
- Slå på Wohlwend Compact 02 Høytrykks Fryser.
2. Forberedelse til Receiving Frosne Samples
- Fyll en isolert boks som inneholder cryovial holdere med flytende nitrogen (se Sikkerhetsadvarsler), slik at innehaverne er helt dekket (figur 1C).
MERK: Bruk PPE inkludert cryogloves og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. - Plasser passende antall hetteglass som inneholder FS medium inn i aluminium tube holdere i flytende nitrogen (figur 1C). Med denne protokollen opptil fire plater som hver inneholder en enkelt prøve kan plasseres i en enkelt cryovial.
MERK: Hetteglassene skal være merket med et skarpt instrument som en diamant-tipped skriftlærde og veldig myk blyant.- For fiksativ under QFS bruke 1% Oso 4 og 0,1% uranyl acetat i aceton 9. Forbered løsningen i store volum, dispensere porsjoner på 1,5 ml til cryovials og lagre frosset i flytende nitrogen.
MERK: Følg Sikkerhetsadvarsler for håndtering Oso 4 og uranyl acetat.
MERK: Oso 4 MERK: cryovials brukes til å holde prøver for QFS bør ha en hard O-ring for å sikre at rørene forbli forseglet under QFS for å unngå lekkasje av oso 4.
- For fiksativ under QFS bruke 1% Oso 4 og 0,1% uranyl acetat i aceton 9. Forbered løsningen i store volum, dispensere porsjoner på 1,5 ml til cryovials og lagre frosset i flytende nitrogen.
- Forbered gjærpasta ved blanding av gjær med et omtrent like stort volum av 10% metanol med en tannpirker eller annet slikt instrument inntil pastaen er glatt. Den gjærpasta fungerer som et ekstracellulært kryobeskyttende middel, og blir brukt til å fylle rommet rundt prøven i prøvebæreren. Mengden av lim avhenger av antall prøver; for 10 prøver eller færre av lim (1 ml) kan bli blandet i et mikrosentrifugerør.
3. Høytrykks Frysing av prøver
- Ta et blad (eller andre vev) av interesse fra anlegget og forsiktig plassere den på et stykke dental voks eller andre skjæreflate. Bruk en punch på 2,0 mm eller ønsket størrelse å kutte en prøve av bladet. Håndter prøven forsiktig med en pinsett og jobbe så raskt som mulig.
- Arbeid under et dissekere mikroskop, plasserer bladet plate i 0,2 mm siden av Type A prøven transportør og dekke helt i gjær lime. Kontroller at platen er helt fylt og lim er på nivå med kanten av holderen ved å jevne ut pastaen med en fin pensel (figur 2).
- Sett buret i prøveholderen. Dekk prøven med prøvebærer Type B, flat overflate ned.
MERK: prøveholder må være tørr, og ved romtemperatur. - Ta prøven i prøveholder, sett den inn i maskinen og starte en frysesyklus ved å trykke på "JET AUTO"-knappen, som skal fullføre i et sekund eller to.
- Arbeider så raskt som mulig, fjerne holderen fra maskinen og plasser spissen holder SAMPle i flytende nitrogen i den isolerte boks på toppen av HPF maskinen. Fordyp tips av to par tang i flytende nitrogen for å kjøle dem.
MERK: Etter frysing, bør bærere bare behandles med flytende nitrogen kjølt tang. Varm (romtemperatur) tang er ofte årsaken til svikt i cryotechniques. - Åpne en cryovial inneholder FS media, og legg lokket på siden av boksen. Ved hjelp av et par av flytende nitrogenavkjølt tang, platen forsiktig fjerne fra prøveholderen, noe som sikrer at platen alltid er i flytende nitrogen eller damp. Arbeid i flytende nitrogen damp, hold FS røret med en forhåndskjølt pinsett og bruke den andre til å plassere holderen i FS hetteglasset. Skru lokket på FS hetteglasset tilbake på. Ikke klem noe flytende nitrogen i hetteglasset.
MERK: Når du overfører prøver å cryovials for QFS, sikrer at ingen flytende nitrogen er fanget i hetteglassene. Flytende nitrogen utvider 700-fold under oppvarming og noen Trapped flytende nitrogen kan forårsake eksplosjoner i løpet av denne tiden. - Gjenta trinn 3.1 til 3.7 til alle ønskede prøvene er frosset. Multiple blad plater inneholdende den samme type prøve kan plasseres i den samme beholderen. Merk at prøveholder må være tørket og brakt til romtemperatur mellom frysing går. For å gjøre dette raskt, varme den med en hårføner, og overvåke temperatur ved berøring.
4. Forberedelse til Freeze Innbytte
- Fullstendig dyppe aluminiumvarmeblokken i flytende nitrogen i 10 min eller inntil kjernekoking stopper. Mens dette foregår, plasserer et lag av tørr is (1-2 cm) i bunnen av beholderen som brukes som FS kammeret (figur 3). En styrofoam beholder eller is bøtte kan brukes for FS, sammen med knust tørris eller pellets.
- Raskt sette inn cryovials inneholder prøvene sammen med temperatur sonde inn i de midterste radene i varmeblokk. Pass på at lokkene påampuller er tett skrudd på, slik at FS media ikke lekker ut under FS. Begynner innspillingen temperaturen.
- Gjør temperatursonden ved å plassere et termoelement gjennom toppen av en cryovial slik at den når bunnen av røret. Forsegl lokket av røret med harpiks, slik at ingen væske lekker ut. Fyll røret med 1,5 ml aceton ved begynnelsen av hver QFS løp.
- Med isolerte cryogloves eller store tang, helle ut all flytende nitrogen fra varmeblokk. Pass på å ikke helle ut cryovials.
MERK: Bruk PPE inkludert cryogloves og vernebriller ved håndtering av flytende nitrogen. - Plasser blokken som inneholder ampullene og til laget av tørris i QFS kammeret. Kontroller at blokken er plassert slik at rørene blir liggende horisontalt men med en svak oppadgående helling. Det bør ikke være noen lekkasje hvis riktige kryorør anvendes.
- Pakk QFS kammer med tørris, slik at FS rørene er dekket, selv om det ikke er nødvendig ådekke toppen av blokken. Sett lokket på kammeret.
5. Hurtig FS
MERK: Utfør QFS ballen en avtrekkshette i tilfelle at enhver lekkasje av OSO 4 utilsiktet oppstår til tross for andre forholdsregler.
- Plasser QFS kammer på en plattform roterende shaker i en avtrekkshette og roterer med 125 rpm i 120 min. I løpet av denne tid temperaturen av blokken bør øke gradvis til omtrent -80 ° C. Omrøringen sørger for blanding av komponentene for bedre FS.
MERK: Plasseringen av shaker i avtrekksskap og plassering av avtrekksskap døren skal være den samme gjennom hele QFS prosedyre og for hver QFS kjøre for å sikre konsekvent oppvarming av prøver. - Fjern tørris fra kammeret og fortsetter rysting i en time.
MERK: temperaturen øke til omtrent -15 ° C til -20 ° C. - Ta prøvene og temperaturføler fra QFS kammeret og legg påristeapparat ved romtemperatur i ytterligere 10-15 minutter, inntil de når romtemperatur. Stoppe innspillingen av temperaturen.
- Under FS, slå av HPF maskinen.
- Steng kranen av den flytende nitrogentanken mens HPF maskinen blir fylt med nitrogen.
- Trykk på "Nitrogen" knappen.
- Vent til de røde "STEMPEL DOWN" lys slukkes.
- Trykk på "ON / OFF" knappen.
- Trykk på "SYSTEM tørke opp" knappen.
- Skjær av tilførselen av trykkluft til maskinen.
- Etter minimum 12 timers (for å sikre tørking av fuktighet), slå av maskinen ved å vri hovedbryteren fra "1" til "0".
6. Post FS Processing
- Fjern forsiktig FS media med plast Overføringspipetter og plass i egnet beholder for giftig avfall.
MERK: Oso 4 og uranyl acetat er farlige kjemikalierog bør håndteres i avtrekksskap mens iført egnet personlig verneutstyr (PVU) inkludert lukket-toed sko, frakk og hansker. - Vask prøver fire ganger med 100% aceton. Samle de to første vasker og plasser i den giftige avfallsbeholder.
- Ved hjelp av fine tang, fjerne vevsprøver fra holderne. Hold prøver våt med aceton som dette er gjort, og jobber veldig forsiktig for å unngå å bryte prøver.
MERK: Det er ikke uvanlig, og det kan faktisk være nyttig å ha gjær lim falle bort fra prøvene på dette punktet. Gjær lim er vanligvis svært mørk brun mens bladet vev er fortsatt grønne. - Samle prøvene i cryovials inneholder aceton. Fortsett med prøveopparbeidelse (infiltrasjon og embedding) for TEM i henhold til vanlige protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene som presenteres nedenfor er innhentet ved hjelp av en Wohlwend Compact 02 for HPF (figur 1A). En stor fordel med dette instrumentet er den enkle bruken av prøven bærere og dets eiere. Ved bruk av andre instrumenter, anbefaler McDonald at to brukere skal utføre prøveopparbeidelse og HPF, en forbereder prøvene mens den andre gjør frysing og overføring til FS cryovials ni. Imidlertid Wohlwend prøve bærere og holderen er lett nok for en enkelt bruker for å manipulere uavhengig av hverandre (figur 2A, B, E, F og G). Det bør nevnes imidlertid at man bør utføre noen prøvekjøringer for å bli kjent med HPF instrument før du arbeider med verdifulle prøver. En erfaren bruker bør kunne fikse flere (10 eller flere) prøver i en time. Imidlertid, kan de prinsipper som er presentert i denne protokollen kan brukes med hvilken som helst av de kommersielt tilgjengelige HPF maskiner.
Kanskjeden mest kritiske del av HPF-QFS Prosedyren er den prøvepreparering for lasting inn i prøvebæreren (figur 2C). Selv om dette kanskje ikke er intuitive, er det trinn i protokollen over som forskeren har de mest kontroll. HPF Maskinen er robust, og med riktig bruk og vedlikehold skal produsere de forventede endringer i trykk og temperatur med liten variasjon mellom prøvene. Hvis prøven er dårlig håndtert under utarbeidelse da ingen andre trinnet vil innløse skaden så forårsaket. Plant vev er relativt lett å manipulere under denne fasen av prosessen som de ikke er dyrket i medium og cellene vegger gir cellene god styrke. Det er likevel viktig at prøver behandles raskt for å unngå ultra endringer som resulterer fra fjerning fra den overordnede anlegg og for å begrense belastning og såret responser. Den minste prøvebærer som kan huse en prøve bør brukes for å sikre effektiv og konsekvent HPF (figure 2C). Endelig bør prøvebærer skal fylles, men ikke overfylte (figur 2D). Den fylte prøvebæreren enkelt settes inn i HPF maskin for frysing (figur 2 H og I).
De første trinnene i QFS protokollen kan være utfordrende for en nybegynner, så det anbefales at to personer bør arbeide sammen til brukerne er komfortable med prosedyren (figur 3A-E). Forsiktighet bør utvises til enhver tid ved håndtering av flytende nitrogen og fiksativ osmiumtetroksyd og uranyl acetat. En typisk kurve for temperaturendringer under QFS er vist i figur 2J. Temperaturen øker raskt fra -196 ° C, temperaturen i flytende nitrogen, til omkring -80 ° C. Det er ved temperaturer på omkring -78 ° C til -90 ° C for at fryse substitusjon antas å forekomme 9. Ett utfordrende trinn i QFS protokollen er fjerning av tørris etter 2 timer med FS. Pådette trinnet, kan mishandling av prøvene produsere en økning i temperaturene. For dette bør varmeblokk bli raskt løftes ut av kammeret ved hjelp av en QFS cryoglove og tørris raskt helles ut i en sekundær beholder.
HPF har blitt brukt til å fikse ulike plantemateriale inkludert Nicotiana benthamiana blader og Arabidopsis blader og embryoer. Det er utfordrende å løse prøver fra eldre bladene på grunn av den store sentrale vakuoler i de fleste celler. Yngre Bladene inneholder mindre vacuoles men trichomes er vanligvis ganske tettpakket. Tilstedeværelsen av trichomes kan gjøre det vanskelig å pakke prøvene med gjær lim, men forsiktighet må tas for å sikre at dette blir riktig gjort for å minimere mengden av luft fanget mellom bladet overflaten og lime. Den innestengte luft vil hindre varmeoverføring under HPF og redusere kvaliteten på fiksering. Dette gjelder for hvilken som helst prøve.
Etter HPF og QFS prøver kan være forberedt på VIewing under TEM ved å infiltrere og innstøping med harpiks. Tynne snitt av 65-100 nm kan da bli fremstilt ved seksjonering. Typiske resultater er vist i figur 4. De viste bilder er tatt fra Arabidopsis blad prøver. Plasma-membraner er vanligvis glatt og trykkes mot celleveggen, et tegn på god fiksering (figur 4A, C og E). Andre organ inkludert kloroplaster (figur 4A, D, F og H) og thylakoids (Figur 4B), mitokondrier (Figur 4D og F), Golgi (figur 4 G), mikrotubuli (figur 4E) og ribosomer (spesielt figur 4C) er også klart synlige og den store sentrale vacuoles forblir intakt (figur 4A). Dårlig håndtering under HPF-QFS resulterer i gjenstander inkludert iskrystall-indusert skade (figur 4D) og plasmolyse (figur 4H). Lead bunnfall kan også dannes under farging av seksjons (figur 4F).
Figur 1: Wohlwend Compact 02 Høytrykks Fryser (A) Wohlwend Compact 02 HPF maskin som brukes for cryofixation med den vedlagte dataterminal.. Prøvene blir satt inn i forsiden av maskinen (liten sirkel) for frysing. En temperaturkurve kan genereres på dataskjermen for hvert løp, som ønsket av brukeren. (B) En typisk temperatur press kurve for en HPF løp. De gule og lilla linjer representerer temperatur og trykk, henholdsvis. Legg merke til de bratte skråningene av begge kurver. Det høye trykk opprettholdes i omtrent 400 msek. Hvert intervall på x-aksen representerer 50 msek. Data ble samlet inn med EasyScopeII for DSIM12 programvare. (C) Den isolerte boksen og deksel brukes til lagring of frosne prøvene umiddelbart etter frysing kan være beleilig plassert på toppen HPF maskinen. Det er fylt med flytende nitrogen. De runde aluminiumsbeholdere holder cryovials.
Figur 2: Forberede vevsprøve for HPF. (A) Et prøveholder for Compact 02 HPF maskinen i sin lukkede konfigurasjon. (B) Et prøveholder er åpen. (C) En bladprøve på 0,2 mm brønn på en Type A prøvebærer. Den andre siden av denne bæreren er 0,1 mm dyp. (D) Dette blad prøven dekket i gjærpasta. Legg merke til at bæreren er full, men ikke overfylte. (E) Prøveholder i prøveholderen. (F) Prøven dekkes med Type B bærer. Denne transportør har en flat overflate, og på den andre siden en brønn somer 0,3 mm dypt. Her den flate overflaten blir brukt til å sandwich-prøven. (G) Et prøveholderen er lukket og klar for innsetting i HPF maskinen. (H) for åpning på forsiden av HPF instrumentet inn i hvilket prøveholder vil bli satt inn for frysing . (I) Den temperatur og trykk probe / holderen er satt inn i maskinen HPF. (J) En typisk temperaturkurve for en QFS løp (data innsamlet med EasyLog programvare). Temperaturen ble spilt hvert sekund. Den pigg ved begynnelsen av kjøringen er på grunn av elektronikken i sonden som brukes, og gjenspeiler ikke en ekte temperaturmåling.
Figur 3:. Utstyr som brukes i QFS QFS kan utføres i en hvilken som helst isolert beholder slik som et Styrofoam-boks eller en is bøtte (A) <./ Strong> Et lag av tørris 1-2 cm dypt dekker bunnen av QFS kammeret, her en styrofoam-boksen. (B) En varmeblokk med 13 mm hull benyttes for å huse prøvene under QFS. Temperaturføler med digitale datalogger er plassert i varmeblokk. (C) Etter avkjøling av varmeblokken i flytende nitrogen prøvene blir plassert i blokken, blir flytende nitrogen strømmet ut, og hele sammenstillingen er plassert i kammeret QFS . med tørr is (D) QFS kammeret er fylt med tørris, slik at prøvene er dekket; er det ingen ulempe å dekke hele varmeblokk med tørris. (E) Boksen dekkes og deretter flyttet til den rotasjonsrister i et avtrekksskap, hvor prøvene blir agitert i hele QFS prosedyren.
Figur4:.. Arabidopsis blader utarbeidet av HPF-QFS Resultater innhentet for prøver utarbeidet av HPF-QFS og fotografert av TEM på en Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) En middels høy forstørrelse bilde som viser en kloroplast (CH) med cellevegger og cytoplasma av tilstøtende celler. De vakuoler (V) inneholder elektron tett materiale. Skala bar = 0,5 mikrometer. (B) En høy forstørrelse bilde av en kloroplast. Skala bar = 100 nm. (C) En høy forstørrelse bilde av celleveggen mellom tilstøtende celler. En forgrenet plasmodesma er synlig (pil). Legg merke til den jevne plasmamembranen presset mot celleveggen ved vakuole. Cytoplasma er tettpakket med ribosomer. V er vakuole. Den tonoplast er glatt og kontinuerlig. Skala bar = 200 nm. (D) en liten forstørrelse bilde som viser områder av god fiksering i kloroplast (CH) nær regioner av is skade (stjerne). Scale bar = 0,5 mikrometer. (E) En høy forstørrelse av en celle wall og mikrotubuli. Scale bar = 100 nm. (F) Bilde viser god bevaring av kloroplaster (CH) og mitokondrier (m). Stor svart bunnfall er fra flekker seksjoner med bly citrate. Scale bar = 1 mikrometer. (G) Høy forstørrelse visning av Golgi (GA). Scale bar = 200 nm. (H) Dårlig bevart prøve som viser mangel på detaljer i kloroplaster og plasmolyse (svart pil). Scale bar = 1 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Suksessen av protokollen som presenteres her er svært avhengig av brukeren. Først er avansert forberedelse nødvendig for å sikre at alle nødvendige materialer er lett tilgjengelig og i tilstrekkelig mengde for å fullføre en hel HPF-QFS løp. For det andre må brukeren arbeide raskt, beveger seg fra trinn-til-trinn på en effektiv måte som minimerer prøvehåndtering, og dermed minimere endringer i den opprinnelige tilstand av vevet. Når prøvene er frosset, og før de er dehydrert er det viktig at de holdes kaldt, så forsiktighet må tas for å unngå håndtering som utilsiktet kan varme opp prøven, for eksempel håndtering med en hansker hånd i stedet for forhåndskjølt tang. Hastighet og effektivitet øker med kjennskap til protokollen, slik praksis kjører anbefales før du prøver å fikse ens prøver av interesse. For det tredje må brukeren være klar over farene ved kjemikaliene som brukes i FS medium samt farene ved å arbeide med flytende nitrogen og tørris. En avtrekkshette som er nødvendig for fremstilling av FS-medium og for QFS prosedyren. For alle andre tiltak, nødvendig personlig verneutstyr, inkludert hansker, laboratoriefrakk, er lukket-toe sko og vernebriller anbefales.
Fordelene med å bruke cryofixation i stedet for kjemiske fiksativ ved romtemperatur for fremstilling av prøver for TEM, inkludert planter, har lenge vært kjent 10. En studie som sammenlignet ultrastructure av rotspissene av Nicotiana og Arabidopsis løst av HPF eller kjemiske fiksativ fant at HPF-FS-metoden ga langt bedre resultater fem. I vev utarbeidet av HPF-FS den plasmalemma og andre cellulære membraner var jevnere, den plasmalemma var flush mot celleveggen, og generelt organeller inkludert mikrotubuli ble bedre bevart enn da prøvene ble løst av konvensjonelle metoder. En annen studie av soyabønner rot knuter konkluderte med at «Kjemiske fiksering av bufret glutaraldehydikke bevare ultrastructure av soyabønner rot knuter i en tilstand som gjør at korrelasjonen mellom struktur og funksjon. "Og det fortsetter å si at den eneste tilgjengelige alternativet er HPF-FS to. Plasmodesmata er membranbundne kanaler som kobler planteceller til sine naboer, men hvis understellet er vanskelig å løse selv under TEM. Cryofixation av HPF eller med en propan jet fryser fulgt av FS ble valgt over kjemisk fiksering i studier som tar sikte på å belyse de fine detaljene i plasmodesmal struktur 18. Til tross for disse tidlige funnene, TEM-studier på konvensjonelt faste vev er fortsatt normen i plantevitenskap. Dette kan skyldes en enkel tilslutning til tradisjonelle metoder, eller til den tilsynelatende prohibitive kostnader for HPF-FS utstyr koplet til den lange preparativ tid for tiden brukes FS protokoller.
Prosedyren for QFS er en nylig innovasjon i påskynde prøveopparbeidelse for TEM 15. QFS har værtbrukes til å forberede hele C. elegans og N. benthamiana forlater etter cryofixation 15. Disse er relativt tykke prøver å bli løst av HPF, og utarbeidelse av Nicotiana prøver av HPF-FS har tradisjonelt brukt svært lange FS ganger 12, 13, 14. For denne protokollen har vi brukt blader fra modell anlegg Arabidopsis. Begrunnelsen for lange FS ganger for Nicotiana og andre planteprøver er at utveksling av løsemidler og vann vil trolig bli bremset av de store vakuoler i cellene. Imidlertid er det (i dette 15 og refs.) Forventet at devitrification av en brønn-frosne prøven bør resultere i minimal skade på cellene. Hvis det oppstår skade is det er mest sannsynlig forårsaket av frysing i seg selv og ikke den QFS. En enda kortere protokoll for FS har blitt rapportert 15. Denne superraske FS (SQFS) bruker bare 90 min for FS. I denne protokoll, blir prøvene i varmeblokken roteres ved 100 rpm i fravær av tørt ice uten å dekke SQFS kammeret. Dette tillater at prøvene for å nå -80 ° C raskt. Prøvene blir deretter fjernet fra varmeblokken og tillatt å nå romtemperatur i vippe. SQFS har blitt brukt til å dehydrere celler dyrket i kultur og E. coli-celler. Vi har ennå ikke forsøkte å bruke SQFS med planteprøver på grunn av tykkelsen på plantevev.
Protokollen for cryofixing og deretter dehydrerende planteprøver ved tandem HPF og QFS representerer en betydelig forbedring i forhold til dagens protokoller. Tiden for før-harpiks infiltrasjon prøvepreparering, er nå redusert til noen få timer i stedet for i flere dager. I tillegg til utvikling av QFS metode 15, har McDonald også nylig publisert protokoller for rask infiltrasjon av plantemateriale med harpiks følgende SQFS uten tørris 19. Plantemateriale er vanligvis sakte infiltrert med harpiks ved flere lange inkubasjoner, inkludert over natten. Disse nye protoCols resultere i enda kortere utvalgets behandling ganger: 6 hr fra frysepunktet til seksjonering. Dermed i fremtiden bør kombinasjonen av HPF-QFS og rask infiltrasjon erstatte gjeldende protokoller for plante-prøveopparbeidelse for TEM. I tillegg benytter fremgangsmåten QFS vanlig laboratorieutstyr som er billig og kan brukes til flere formål, selv om en kommersiell QFS sett er for tiden tilgjengelig gjennom Elektronmikros Sciences (http://www.emsdiasum.com). Enten alternativet representerer en enorm besparelse over kostnaden ved å kjøpe et dedikert fryse substitusjon enhet som kan koste godt over $ 50.000.
Det bør bemerkes at anvendelser av prøvene utarbeidet av HPF og FS strekke seg utover rutine TEM analyse. Prøver fremstilt på denne måte beholder sin antigenisitet og kan derfor brukes i antistoffbaserte tilnærminger, inkludert en immunmerking 17, 19. Disse prøvene kan også anvendes for avanserte tredimensjonale strukturanalyservia electron tomography 20. HPF-FS prøver kan også brukes med correlative lys og EM 21, 22. Således, videre forbedring i fremgangsmåten for cryofixing og deretter dehydratiserende prøvene vil være fordelaktig for en lang rekke forskere som arbeider i ulike systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Godhet og sjenerøsitet av Dr. Kent McDonald av UC Berkeley er verdsatt. Vi takker en anonym anmelder for svært nyttige forslag. Den Burch-Smith lab støttes av oppstart midler fra University of Tennessee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L.
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V.
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
