Abstract
Sedan 1940-talet transmissionselektronmikroskop (TEM) har försett biologer med extremt högupplösta bilder av biologiska material. Men på grund av mödosamma och tidskrävande protokoll som även kräver erfarenhet av beredning av artefaktfria prover, TEM anses inte vara en användarvänlig teknik. Traditionell provberedning för TEM använt kemiska fixeringsmedel för att bevara cellstrukturer. Högtrycks frysning är cryofixation av biologiska prover under höga tryck för att producera mycket snabba kylningshastigheter, och därmed begränsar isbildning, vilket är till skada för integriteten i cellultra. Högtrycks frysning och fryssubstitution är för närvarande de metoder för val för att producera högsta kvalitet morfologi i sektioner för TEM harts. Dessa metoder minimera artefakter som normalt förknippas med konventionell behandling för TEM i tunna sektioner. Efter cryofixation det frusna vattnet i provet skall ersättas med vätskaorganiskt lösningsmedel vid låga temperaturer, en process som kallas fryssubstitution. Freeze substitution utförs vanligtvis under flera dagar i hängiven, dyrbar utrustning. En ny innovation gör processen vara klar i tre timmar, i stället för de vanliga två dagarna. Detta är vanligtvis följs av ytterligare flera dagars provberedning som innehåller infiltration och inbäddning i epoxihartser innan snittning. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar högtrycksfrysning och snabb frysa substitution som gör att växtprovet fixering bli genomförda inom timmar. Protokollet kan lätt anpassas för att arbeta med andra vävnader eller organismer. Växtvävnader är ett särskilt problem på grund av förekomsten av kolsyrat utrymmen och vattenfyllda vakuoler som hindrar isfritt frysning av vatten. Dessutom är processen för kemisk fixering särskilt länge i växter på grund av cellväggar som hindrar penetrering av kemikalierna till djupt i vävnaderna. Växtvävnader är därför particbundet utmanande, men detta protokoll är tillförlitlig och ger prov på högsta kvalitet.
Introduction
Vår kunskap om cellultra kommer främst från elektronmikroskopi, vilket kan lösa uppgifter i intervallet några nanometer 1. Trots att så kraftfull i upplösning TEM anses inte vara användarvänligt, som provberedning kräver tidskrävande och mödosamma protokoll, och kräver viss expertis från utövaren. Traditionell fixering av prover har kombinerat användningen av aldehyder och osmiumtetroxid innan vidare behandling som inkluderar uttorkning, ingjutning i plast och sedan sektione producera ultratunna sektioner som sedan färgas med tungmetaller. Det är dock känt att kemisk fixering kan producera artefakter inklusive proteinaggregering och förlust av lipider 1, och förändringar till membran som i slutändan drabbar flera cellulära fack 2. Dessa artefakter är till stor del hänföras till den långsamma hastigheten för fixering och dehydratisering vid rumstemperatur 3, 4, 5.
6, 7. HPF minskar en provets temperatur till det av flytande kväve, under mycket högt tryck (210 MPa eller 2.100 bar) i millisekunder. När den görs rätt HPF förhindrar bildning av stora iskristaller som kan orsaka stora skador på cellultra. HPF kan användas för att fixera prover av 100-200 um tjocklek vid typiska koncentrationer av biologiska lösta ämnen 7. Det finns många recensioner på fysik och principer som ligger till grund HPF, t.ex. 1, 7, 8.
Efter HPF tas prover inkuberas vid låg temperatur (-78,5 ° C till -90 &# 176; C) i närvaro av flytande organiska lösningsmedel som innehåller kemiska fixeringsmedel som osmiumtetroxid, vanligtvis för ett par dagar. Vid denna låga temperatur, är vattnet i provet ersättas med organiskt lösningsmedel, typiskt aceton eller metanol 1, 9. Således är denna process som kallas fryssubstitution (FS). Provet sedan gradvis värms och under denna tid är fast, oftast med osmiumtetroxid och uranylacetat 9. Tvärbindning vid låga temperaturer har fördelen att fastställande molekyler som är immobiliserade 1. FS därför producerar prover av överlägsen kvalitet jämfört med dem som fastställs genom konventionell kemisk fixering vid rumstemperatur, särskilt det resulterar i förbättrad ultra konservering, bättre bevarande av antigenicitet och minskad förlust av obundna cellulära komponenter 10, 11.
De flesta FS genomföres under långa tidsperioder, typiskt upp till flera dagar. Detta är särskilt true Växter proverna 12, 13, 14. En nyligen protokoll utvecklat av McDonald och Webb reducerar kraftigt tiden för FS från några dagar till några timmar 15. I sin snabbt förfarande fryssubstitution (QFS), är FS genomförs under 3 timmar, medan de supersnabba FS (SQFS) prover behandlas i 90 minuter. Kvaliteten på prover som produceras av dessa metoder är jämförbara med de som genereras av traditionella FS-protokoll. Vi har antagit QFS protokoll för efterföljande bearbetning av växtprover efter HPF. Detta har visat sig spara inte bara tid utan också pengar, som QFS och SQFS använder vanliga laboratorieutrustning i stället för de dyra kommersiellt tillgängliga FS maskiner.
Växt vävnader är ofta mycket svårt att förbereda sig för TEM. I genomsnitt växtceller är större än både bakteriella eller djurceller. Närvaron av hydrofoba vaxartad nagelband, tjocka cellväggar, stora vattenfyllda vakuoler som innehåller organiska syror, hydrolaser och fenol compounds som kan uppta upp till 90% av den totala cellvolymen 16, och närvaron av kolsyrat utrymmen allvarligt minskar värmeledningsförmågan hos systemet 17. Vidare när det gäller växter, provets tjocklek överstiger nästan alltid 20 pm, gränsen för användning av kemisk fixering. Vid dessa tjocklekar, den låga värmeledningsförmågan hos vattnet förhindrar en fryshastigheten mer än -10.000 ° C / sek i centrum av provet. Denna kurs krävs för att undvika skadlig hexagonal isbildning (iskristaller med lägre densitet och större än 10 till 15 nm) 8. Tillsammans utgör dessa innebär utmaningar för både ordentlig frysning av provet och efterföljande FS. Ändå är cryofixation den bästa metoden för att fastställa växtprover. Här ett protokoll för HPF-QFS av växtvävnadsprover presenteras. Den fokuserar på modell arter Arabidopsis thaliana, men har också använts med Nicotiana benthamiana. De typiska resultat visar att HPF-QFS producerar samples av jämförbar kvalitet med traditionella HPF-FS på en bråkdel av tiden. Med lämpliga justeringar, kan detta protokoll också kan användas för andra relativt tjocka biologiska prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS! QFS proceduren kräver extrem försiktighet och försiktighet av användaren och vi lyfta fram dessa säkerhetsåtgärder här som försiktig och Obs förekommande fall.
1.Preparation för HPF Run
- Innan provberedning, slå på högtrycks frys efter tillverkarens instruktioner.
OBS! HPF enhet som används i detta protokoll är en Wohlwend Compact 02 enhet (figur 1 A), och det tar cirka ett till ett och en halv timme av startproceduren innan HPF körs kan påbörjas.- Inkoppling av Wohlwend Compact 02 Högtrycks Frys.
- Slå på instrumentet genom att vrida huvudbrytaren från "0" till "1".
- Släpp tryckluft till maskinen.
- Släpp flytande kväve till maskinen.
- Tryck på "SYSTEM DRY UPP" knappen.
- Efter 30 minuter, tryck på "SYSTEM DRY UPP "igen.
- Tryck på "ON / OFF" för att slå på instrumentet.
- Tryck på "NITROGEN" knappen.
- Låt maskinen svalna i 20 minuter även om "DRIVE IN" knappen redan har upplyst.
- Den "DRIVE IN"-knappen tänds.
- Tryck på "DRIVE IN" knappen.
- Tryck på knappen "AUTO".
- De "SYSTEM READY"-knappen tänds.
- Placera temperatur och tryck sond in i tryckkammaren och lås med sprinten.
- Tryck på "JET AUTO" knappen. Detta steg kontrollerar att tryckökningen och temperatursänkning är som önskat; huvudsak en provkörning. Skarpa droppar i temperatur och kraftiga påtryckningar väntas (Figur 1B).
- Utför två fler JET cykler.
- Inkoppling av Wohlwend Compact 02 Högtrycks Frys.
2 Förberedelse för Receiving Frysta Prover
- Fyll en isolerad låda innehållande cryovial hållare med flytande kväve (se varningar), så att innehavarna är helt täckt (Figur 1C).
OBS: Använd skyddsutrustning inklusive cryogloves och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve. - Placera lämpligt antal injektionsflaskor innehållande FS mediet i aluminium slanghållarna i flytande kväve (Figur 1C) de. Med detta protokoll upp till fyra skivor som båda innehåller ett enda prov kan placeras i en enda cryovial.
OBS: Flaskorna bör märkas med ett vasst instrument som en diamant spets skriftlärd och mycket mjuk blyertspenna.- För fixativ under QFS använda 1% OSO4 och 0,1% uranylacetat i aceton 9. Bered lösningen i stora volymer, befria alikvoter av 1,5 ml i cryovials och lagra fryst i flytande kväve.
OBS: Följ varningar för hantering OSO4 och uranylacetat.
NOTERA: OSO4 OBS! Cryovials används för att hålla prover för QFS bör ha en hård O-ring för att säkerställa att rören förblir förseglade under QFS för att undvika läckage av OSO4.
- För fixativ under QFS använda 1% OSO4 och 0,1% uranylacetat i aceton 9. Bered lösningen i stora volymer, befria alikvoter av 1,5 ml i cryovials och lagra fryst i flytande kväve.
- Förbered jäst pasta genom att blanda bagerijäst med en ungefär lika stor volym av 10% metanol med en tandpetare eller ett liknande instrument tills pastan är mjuk. Den jäst pasta fungerar som ett extracellulärt kryoskyddande och används för att fylla utrymmet runt provet i provhållaren. Den mängd pasta beror på det antal prov; för 10 prover eller färre den pasta (1 ml) kan blandas i ett mikrocentrifugrör.
3 Högtrycks Frysning av prov
- Ta ett löv (eller annan vävnad) av intresse från anläggningen och försiktigt placera den på en bit Dental vax eller annan skärytan. Använd en stans av 2,0 mm eller önskad storlek för att skära ett prov ut av bladet. Hantera provet försiktigt med en pincett och arbeta så snabbt som möjligt.
- Att arbeta under ett dissekera mikroskop, placera bladskiva i 0,2 mm sidan av typ A provbärare och täcker helt i jäst pasta. Se till att skivan är helt fylld och pastan är i nivå med kanten på hållaren genom att jämna ut pastan med en fin pensel (Figur 2).
- Placera hållaren i provhållare. Täck provet med typ B provbärare, plan yta ner.
OBS: Den provhållare skall vara torr och i rumstemperatur. - Ta provet i provhållaren, sätt in det i maskinen och initiera en fryscykel genom att trycka på "JET AUTO" knappen, som ska fylla i en sekund eller två.
- Att arbeta så snabbt som möjligt, ta bort hållaren från maskinen och placera spetsen håller sample i flytande kväve i isolerad låda ovanpå HPF maskin. Doppa spetsarna av två par pincett i flytande kväve för att kyla dem.
OBS: Efter frysning, bör bärarna endast hanteras med flytande kväve kylda pincett. Varma (rumstemperatur) pincett är ofta orsaken till misslyckandet i cryotechniques. - Öppna en cryovial innehåller FS media, och placera locket på sidan av lådan. Med hjälp av ett par av flytande kväve kylda pincett, försiktigt ta ut skivan ur provhållaren, se till att skivan är alltid i flytande kväve eller ånga. Att arbeta i flytande kväve ånga, håll FS rör med en förkyld pincett och använda den andra för att placera hållaren på FS flaskan. Skruva på locket på FS flaskan igen. Inte fälla någon flytande kväve i flaskan.
OBS: När du överför prover för att kryokärl för QFS, se till att inget flytande kväve är fångade i flaskorna. Flytande kväve expanderar 700 gånger under uppvärmningen och alla Trapped flytande kväve kan orsaka explosioner under denna tid. - Upprepa steg från 3,1 till 3,7 tills alla önskade Proverna fryses. Flera bladskivor som innehåller samma typ av prov kan placeras i samma flaska. Observera att provhållare måste torkas och bringas till rumstemperatur mellan frysning körningar. För att göra detta snabbt, värm den med en hårtork, och övervaka dess temperatur genom beröring.
4 Förberedelser för Freeze Substitution
- Helt doppa aluminiumuppvärmningsblocket i flytande kväve under 10 min eller tills bubbelkokning upphör. Medan detta pågår, placera ett skikt av torr is (1-2 cm) i botten av behållaren används som FS kammaren (Figur 3). En frigolit behållare eller ishink kan användas för FS, tillsammans med krossad torris eller pellets.
- Snabbt infoga cryovials innehåller proven tillsammans med temperaturgivare i mitten rader av uppvärmningsblocket. Se till att locken påflaskorna är tätt skruvas på så att läcka FS media inte under FS. Börja spela in temperaturen.
- Gör temperatursonden genom att placera ett termoelement genom toppen av en köldkärlet så att den når botten av röret. Täta locket på röret med harts, så att ingen vätska läcker ut. Fyll röret med 1,5 ml aceton vid början av varje QFS körning.
- Använda isolerade cryogloves eller stora pincett, hälla ut allt det flytande kvävet från värmeblocket. Se till att inte hälla ut cryovials.
OBS: Använd skyddsutrustning inklusive cryogloves och skyddsglasögon vid hantering av flytande kväve. - Placera blocket innehållande flaskorna på skiktet av torr is i QFS kammaren. Se till att blocket är placerat så att rören ligger horisontellt, men med en svagt uppåtgående lutning. Det bör inte finnas något läckage om rätt cryovials används.
- Förpacka QFS kammaren med torris så att FS rören täcks, även om det inte är nödvändigt atttäcka toppen av blocket. Placera locket på kammaren.
5. Quick FS
OBS: Utför QFS springa i ett dragskåp i händelse av att något läckage av OSO4 sker oavsiktligt trots andra försiktighetsåtgärder.
- Placera QFS kammare på en plattform rotationsskakapparat i ett dragskåp och roterar med 125 rpm i 120 min. Under denna tid temperaturen hos blocket bör öka gradvis till omkring -80 ° C. Den agitation säkerställer blandning av komponenterna för bättre FS.
OBS: Placeringen av shaker i dragskåp och läget för dragskåpets dörr ska vara samma i hela QFS förfarandet och för varje QFS kör för konsekvent uppvärmning av prover. - Avlägsna torris från kammaren och fortsätta skakning under ytterligare en timme.
OBSERVERA: temperaturen bör öka till omkring -15 ° C till -20 ° C. - Ta prover och temperaturgivare från QFS kammaren och placera påskakanordning vid rumstemperatur i ytterligare 10 till 15 min, tills de når rumstemperatur. Sluta spela in temperaturen.
- Under FS, stäng av HPF maskinen.
- Stäng kran av det flytande kvävet tanken medan HPF maskinen fylls med kväve.
- Tryck på "NITROGEN" knappen.
- Vänta tills den röda "KOLV NER" Lampan slocknar.
- Tryck på "ON / OFF" knappen.
- Tryck på "SYSTEM DRY UPP" knappen.
- Skär av tillförseln av tryckluft till maskinen.
- Efter minst 12 h (för att säkerställa torkning av fukt), stäng av maskinen genom att vrida huvudbrytaren från "1" till "0".
6. Post FS Processing
- Ta försiktigt bort FS media med plast överföringspipetter och plats i lämplig behållare för giftigt avfall.
OBS: OSO4 och uranylacetat är farliga kemikalieroch bör hanteras i dragskåp iklädd lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive slutna toed skor, skyddsrock och handskar. - Tvätta prov fyra gånger med 100% aceton. Samla de två första tvättarna och placera i avfallsbehållaren giftigt.
- Med fin pincett, ta vävnadsprover från hållarna. Håll prover vått med aceton som detta sker, och arbeta mycket försiktigt för att undvika att bryta prover.
OBS: Det är inte ovanligt och det kan faktiskt vara bra att ha jäst pasta faller bort från proverna på denna punkt. Den jäst pasta är vanligtvis mycket mörkbrun medan bladvävnaden är fortfarande gröna. - Samla prover i kryokärl innehåller aceton. Fortsätt med provberedning (infiltration och inbäddning) för TEM enligt vanliga protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultat som presenteras nedan har erhållits med en Wohlwend Compact 02 för HPF (Figur 1A). En stor fördel med detta instrument är lätt att använda av proven bärare och dess innehavare. Vid användning av andra instrument, rekommenderar McDonald att två användare bör utföra förberedelserna och HPF, ett prov förbereder proven medan den andra gör frysning och transfer till FS cryovials 9. Men Wohlwend prov bärare och hållare är tillräckligt enkelt för en användare att manipulera självständigt (Figur 2A, B, E, F och G). Det bör nämnas dock att man bör göra några provkörningar för att bli bekant med HPF instrumentet innan du arbetar med värdefulla prover. En erfaren användare bör kunna fixa flera (10 eller fler) prov på en timme. Däremot kan de principer som presenteras i detta protokoll användas med någon av de kommersiellt tillgängliga HPF maskiner.
Kanskeden mest kritiska delen av HPF-QFS förfarandet är provberedning för laddning i provhållaren (figur 2C). Även om detta kanske inte är intuitivt, det är steg i protokollet över vilken forskaren har mest kontroll. HPF Maskinen är robust och med korrekt användning och underhåll ska ge de förväntade förändringar i tryck och temperatur med lite variation mellan prover. Om ett prov är dåligt hanteras under beredning då inga andra steg kommer att lösa in den skada detta skulle medföra. Växtvävnader är relativt lätt att manipulera under detta skede av processen, eftersom de inte odlas i medium och deras celler väggar ger cellerna god styrka. Det är dock viktigt att proverna hanteras snabbt för att undvika ultra ändringar som resulterar från avlägsnandet från moderplantan och begränsa stressen och skadade svar. Den minsta provbärare som kan rymma ett prov bör användas för att säkerställa en effektiv och konsekvent HPF (Figure 2C). Slutligen bör provbäraren fyllas men inte överfulla (figur 2D). Den fyllda provbäraren lätt in i HPF maskin för frysning (Figur 2 H och I).
De första stegen i QFS protokollet kan vara en utmaning för en nybörjare, så det rekommenderas att två personer ska arbeta tillsammans tills användarna är bekväma med det förfarande (Figur 3A-E). Försiktighet bör iakttas vid all hantering av flytande kväve och fixativ osmiumtetroxid och uranylacetat. En typisk kurva för temperaturförändringar under QFS visas i figur 2J. Temperaturen ökar snabbt från -196 ° C, temperaturen för flytande kväve, till cirka -80 ° C. Det är vid temperaturer av omkring -78 ° C till -90 ° C som fryssubstitution tros ske 9. En utmanande steg i QFS protokoll är avlägsnande av torris efter 2 timmar av FS. Viddetta steg kan misskötsel av prover producera en spik i temperaturer. För detta bör uppvärmningsblocket vara snabbt lyftas ut ur QFS kammaren med hjälp av en cryoglove och torris snabbt hälls ut i ett annat kärl.
HPF har använts för att fixa olika växtvävnader inklusive Nicotiana benthamiana blad och Arabidopsis blad och embryon. Det är en utmaning att fixa prover från mogna blad på grund av de stora central vakuoler i de flesta celler. Yngre blad innehåller mindre vakuoler men trichomes är oftast ganska tätt packade. Närvaron av trichomes kan göra det svårt att packa proverna med jäst pasta utan vård måste vidtas för att se till att detta är korrekt gjort för att minimera mängden luft instängd mellan bladytan och pastan. Den instängda luften kommer att hindra värmeöverföring under HPF och sänka kvaliteten på fixering. Detta är sant för varje prov.
Efter HPF och QFS prover kan förberedas för viewing under TEM genom att infiltrera och bädda med harts. Tunna sektioner av 65-100 nm kan sedan framställas genom sektionering. Typiska resultat visas i Figur 4. Bilderna som visas är alla från Arabidopsis bladprover. Plasmamembran är vanligen släta och pressas mot cellväggen, ett tecken på god fixering (figur 4A, C och E). Andra organeller inklusive kloroplaster (Figur 4A, D, F och H) och tylakoider (Figur 4B), mitokondrier (Figur 4D och F), Golgi (Figur 4 G), mikrotubuli (Figur 4E) och ribosomer (särskilt figur 4C) är också klart synliga och den stora centrala vakuoler förblir intakt (Figur 4A). Dålig hantering under HPF-QFS ger artefakter inklusive iskristall-inducerad skada (Figur 4D) och plasmolys (figur 4H). Bly fällning kan också bildas under färgning av avsnitts (Figur 4F).
Figur 1: Wohlwend Compact 02 högtrycks Frys (A) Wohlwend Compact 02 HPF maskin som används för cryofixation med den bifogade dataterminal.. Prover införas i maskinens framsida (liten cirkel) för frysning. En temperaturkurva kan genereras på datorskärmen för varje körning, som önskas av användaren. (B) En typisk temperaturtryckkurva för ett HPF körning. De gula och lila linje avser temperatur och tryck, respektive. Notera de branta sluttningarna av båda kurvorna. Det höga trycket bibehålls under ca 400 msek. Varje intervall på x-axeln representerar 50 msek. Data samlades in med EasyScopeII för DSIM12 programvara. (C) Den isolerade låda och lock som används för lagring of frysta prover direkt efter frysning kan lämpligen placeras ovanpå HPF maskinen. Den är fylld med flytande kväve. De runda aluminiumbehållare håller cryovials.
Figur 2: Förbereda vävnadsprov för HPF. (A) Den provhållare för Compact 02 HPF maskin i sitt stängda läge. (B) Den preparathållare är öppen. (C) Ett prov löv i 0,2 mm och en typ A provbärare. Den andra sidan av detta lufttrafikföretag är 0,1 mm djup. (D) Prov blad täckt av jäst pasta. Observera att transportören är full men inte överfulla. (E) Provet bärare i preparathållaren. (F) Provet är täckt med typ B bäraren. Denna bärare har en plan yta och på den andra sidan en väl somär 0,3 mm djup. Här den plana ytan används för att sandwich-provet. (G) Provhållaren är stängd och klar för insättning i HPF maskinen. (H) Öppningen på framsidan av HPF instrumentet in i vilken provhållaren kommer att införas för frysning . (I) Temperatur och tryck sond / hållare insatt i HPF maskinen. (J) En kurva typisk temperatur under en QFS run (data som samlats in med EasyLog programvara). Temperaturen registrerades varje sekund. Piggen vid början av körningen beror på elektroniken i den använda sonden och återspeglar inte en mätning verklig temperatur.
Figur 3:. Utrustning som används på QFS QFS kan utföras på något isolerad behållare såsom en frigolitlåda eller en ishink (A) <./ Strong> Ett skikt av torris 1-2 cm djup täcker botten av QFS kammaren, här en styrofoam boxen. (B) Ett värmeblock med 13 mm hål används för att hysa prover under QFS. Temperatursonden med digital datalogger placeras i uppvärmningsblocket. (C) Efter kylning av uppvärmningsblocket i flytande kväve proven placeras i blocket, är det flytande kvävet hälls ut, och hela aggregatet placeras i QFS kammaren . med torris (D) Den QFS kammaren är fylld med torris så att proven är täckta; det finns ingen nackdel att täcka hela uppvärmningsblocket med torris. (E) Lådan är täckt och förflyttas sedan på en roterande skakapparat i ett dragskåp där proven omröres hela QFS förfarandet.
Figur4:.. Arabidopsis lämnar utarbetats av HPF-QFS Resultat som erhållits för prover som utarbetats av HPF-QFS och avbildas av TEM på en Zeiss Libra 200 HT FE MC (A) Ett medium hög förstoring bild som visar en kloroplast (CH) med cellväggar och cytoplasman av angränsande celler. De vakuoler (V) innehåller elektrontätt material. Skala bar = 0,5 pm. (B) En hög förstoring bild av en kloroplast. Scale bar = 100 nm. (C) En hög förstoring bild av cellväggen mellan intilliggande celler. En grenad plasmodesma är synlig (pil). Notera den släta plasmamembranet pressas mot cellväggen genom vakuolen. Cytoplasman är tätt packade med ribosomer. V är vacuole. Den tonoplast är jämn och kontinuerlig. Skala bar = 200 nm. (D) En låg förstoring bild som visar områden med god fixering i kloroplast (CH) nära områden av is skador (asterisk). Skala bar = 0,5 pm. (E) En hög förstoring av en cell wall och mikrotubuli. Skala bar = 100 nm. (F) Bild visar god bevara kloroplaster (CH) och mitokondrier (M). Stor svart fällning är från färgning sektioner med bly citrat. Scale bar = 1 um. (G) Hög förstoring vy av Golgi (GA). Skala bar = 200 nm. (H) Dåligt bevarade prov som visar brist på detaljer i kloroplaster och plasmolys (svart pil). Scale bar = 1 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Framgången för det protokoll som presenteras här beror mycket på användaren. Först avancerade förberedelser som krävs för att säkerställa att alla nödvändiga material är lätt tillgängliga och i tillräcklig mängd för att fylla en hel HPF-QFS sikt. För det andra måste användaren arbeta snabbt, flytta från steg-för-steg på ett effektivt sätt som minimerar provhantering, vilket minimerar ändringar i det nativa tillståndet av vävnaden. När proverna fryses och innan de är uttorkad är det viktigt att de förvaras kallt, så man måste vara försiktig för att undvika all hantering som oavsiktligt kan värma upp provet, till exempel hantering med en behandskade hand istället för förkyld pincett. Hastighet och öka effektiviteten med förtrogenhet med protokollet, så övningskörningar rekommenderas innan du försöker fixa sina prover av intresse. För det tredje måste användaren vara medvetna om farorna med de kemikalier som används i FS mediet samt farorna med att arbeta med flytande kväve och torris. Ett dragskåp är nödvändig för utarbetandet av FS medium och för QFS förfarandet. För alla andra åtgärder, nödvändig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, labbrock, är stängda tå skor och skyddsglasögon rekommenderas.
Fördelarna med att använda cryofixation istället för kemiska fixeringsmedel vid rumstemperatur för framställning av prover för TEM, inklusive växter, har länge varit kända 10. En studie som jämför ultra av rot tips av Nicotiana och Arabidopsis fastställts av HPF eller kemiska fixeringsmedel fann att HPF-FS-metoden gav långt överlägsna resultat 5. I vävnad utarbetats av HPF-FS var plasmalemma och andra cellmembran smidigare, det plasmalemma var tätt mot cellväggen, och i allmänhet organ inklusive mikrotubuli var bättre bevarad än när prover fixerades med konventionella metoder. En annan studie av soja rotknölar slutsatsen att "Kemisk fixering av buffrad glutaraldehydbevaras inte ultrasoja rotknölar i ett tillstånd som medger sambanden mellan struktur och funktion. "Och den fortsätter att säga att det enda tillgängliga alternativet är HPF-FS 2. Plasmodesmata är membranbundna kanaler som ansluter växtceller till sina grannar, men vars understruktur är svår att lösa även under TEM. Cryofixation genom HPF eller med en gasol jet frys följt av FS valdes över kemisk fixering i studier som syftar till att belysa de fina detaljerna i plasmodesmal struktur 18. Trots dessa tidiga fynd, TEM studier konventionellt fixerade vävnader är fortfarande norm i växtforskning. Detta kan bero på en enkel anslutning till traditionella metoder eller till synes oöverkomliga kostnaderna för HPF-FS utrustning kopplad till den långa preparativ tid för närvarande används FS protokoll.
Förfarandet för QFS är en ny innovation för att påskynda provberedning för TEM 15. QFS har varitanvändes för att framställa hela C. elegans och N. benthamiana lämnar efter cryofixation 15. Dessa är relativt tjocka prover som fastställs av HPF, och beredning av Nicotiana prover från HPF-FS har traditionellt använt mycket långa FS gånger 12, 13, 14. För detta protokoll har vi använt blad från modellväxten Arabidopsis. Den logiska grunden för långa FS tider för Nicotiana och andra växtprover är att utbyte av lösningsmedel och vatten sannolikt skulle bromsas av de stora vakuoler i cellerna. Emellertid förväntas det att glaskristallisation av en väl fryst prov bör resultera i minimal skada på cellerna (15 och refs. Däri). Om is skada inträffar är det mest sannolikt orsakas av frysning i sig och inte QFS. En ännu kortare protokoll för FS har rapporterats 15. Denna supersnabba FS (SQFS) använder bara 90 min för FS. I detta protokoll är proverna i uppvärmningsblocket roteras vid 100 rpm i avsaknad av torra ice utan att täcka SQFS kammaren. Detta tillåter proven att nå -80 ° C snabbt. Proverna avlägsnades sedan från värmeblocket och fick nå rumstemperatur på vipparmen. SQFS har framgångsrikt använts för att dehydratisera celler odlade i kultur och E. coli-celler. Vi har ännu inte försökt använda SQFS med växtprover på grund av tjockleken av de växtvävnader.
Protokollet för cryofixing och uttorkande växtprover från tandem HPF och QFS utgör en betydande förbättring jämfört med nuvarande protokoll. Tiden för provberedning innan harts infiltration nu reducerad till några få timmar i stället för flera dagar. Förutom att utveckla QFS metoden 15, har McDonald också nyligen publicerat protokoll för snabb infiltration av växtvävnader med harts efter SQFS utan torris 19. Växtvävnader är vanligtvis infiltrerade långsamt med harts genom flera långa inkubationer, inklusive över natten. Dessa nya protocols resultera i ännu kortare provhandläggningstider: 6 tim från att frysa till snittning. Alltså i framtiden, bör kombinationen av HPF-QFS och snabb infiltration ersätta dagens protokoll för växtprovberedning för TEM. Dessutom använder QFS förfarande gemensamma laboratorieutrustning som är billig och kan användas för flera ändamål, även om en kommersiell QFS Kit är för närvarande tillgänglig via Electron Microscopy Sciences (http://www.emsdiasum.com). Båda alternativen innebär en enorm besparing över kostnaden för att köpa en dedikerad frys substitution enhet som kan kosta betydligt mer än $ 50.000.
Det bör noteras att de tillämpningar av prov som har beretts av HPF och FS sträcka sig längre än rutin TEM-analys. Prover framställda på detta sätt behåller sin antigenicitet och kan därför användas i antikroppsbaserade metoder, inklusive immunogold märkning 17, 19. Dessa prover kan också användas för avancerade tredimensionella strukturella analyservia elektron tomografi 20. HPF-FS prover kan även användas med korrelativ ljus och EM 21, 22. Sålunda fortsatte förbättringar i förfarandena för cryofixing och sedan uttorkande prover kommer att gynna en mängd olika utredare som arbetar i olika system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Den vänlighet och generositet Dr Kent McDonald av UC Berkeley är mycket uppskattat. Vi tackar en anonym granskare för mycket användbara förslag. Den Burch-Smith lab stöds av startpeng från University of Tennessee.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wohlwend HPF Compact 02 High Pressure Freezing Machine | Technotrade International, Inc | HPF02 | With integrated oscilloscope to display freezing and pressure curves; PC (not included) is required for display of freezing parameters |
| Holder for DN 3 x 0.5 mm aluminum apecimen carriers | Technotrade International, Inc | 290 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type A | Technotrade International, Inc | 241-200 | |
| Specimen carriers, P=1,000, DN 3 x 0.5 aluminum, type B | Technotrade International, Inc | 242-200 | |
| Storage Dewar 20.5 L, MVE Millennium 2000 XC20 | Chart | ||
| Baker's yeast | The older the better, to avoid excessive gas (CO2) production | ||
| Tooth picks | |||
| Thermocouple data logger EL-USB-TC | OMEGA Engineering Inc. | OM-EL-USB-TC | Replacement battery purchased separately |
| Temperature probe | Electron Microscopy Sciences | 34505 | |
| Heater block 12/13 mm | |||
| Rotary shaker | Fisher Scientific | 11-402-10 | |
| Leaf punch - Harris Uni-core 2.00 | Ted-Pella Inc. | 15076 | |
| Pink dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72660 | |
| Cryogenic vials 2 ml | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Methanol | |||
| Blow dryer | |||
| Dry ice | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Acetone | |||
| Forceps | Several pairs |
References
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochemistry and cell biology. 130, 877-889 (2008).
- Studer, D., Hennecke, H., Muller, M. High-pressure freezing of soybean nodules leads to an improved preservation of ultrastructure. Planta. 188, 155-163 (1992).
- Bowers, B. aM. M. Ch 2. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. 2, Plenum Press. 13-42 (1988).
- Mollenhauer, H. H. Ch 3. Artifacts in Biological Electron Microscopy. Crang, R. F. E., Klomparens, K. L. , Plenum Press. 43-64 (1988).
- Kiss, J. Z., Giddings, T. H., Staehelin, L. A., Sack, F. D. Comparison of the ultrastructure of conventionally fixed and high pressure frozen/freeze substituted root tips of Nicotiana and Arabidopsis. Protoplasma. 157, 64-74 (1990).
- Moor, H. Cryotechniques in Biological Electron Microscopy. Steinbrecht, R. A., Zierold, K. , Springer Verlag. 175-191 (1987).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods in cell biology. 88, 151-164 (2008).
- Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure theory and practice. Journal of electron microscopy. 13, 165-174 (1989).
- McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods in molecular biology. 117, 77-97 (1999).
- Hippe-Sanwald, S. Impact of freeze substitution on biological electron microscopy. Microscopy research and technique. 24, 400-422 (1993).
- Kiss, J. Z., McDonald, K. Electron microscopy immunocytochemistry following cryofixation and freeze substitution. Methods in cell biology. 37, 311-341 (1993).
- Segui-Simarro, J. M., Austin 2nd, J. R., White, E. A., Staehelin, L. A. Electron tomographic analysis of somatic cell plate formation in meristematic cells of Arabidopsis preserved by high-pressure freezing. The Plant cell. 16, 836-856 (2004).
- Kobayashi, K., Otegui, M. S., Krishnakumar, S., Mindrinos, M., Zambryski, P. INCREASED SIZE EXCLUSION LIMIT encodes a putative DEVH box RNA helicase involved in plasmodesmata function during Arabidopsis embryogenesis. The Plant cell. 19, 1885-1897 (2007).
- Austin, J. R., 2nd,, Staehelin, L. A. Three-dimensional architecture of grana and stroma thylakoids of higher plants as determined by electron tomography. Plant physiology. 155, 1601-1611 (2011).
- McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of microscopy. 243, 227-233 (2011).
- Taiz, L. The Plant Vacuole. The Journal of experimental biology. , 172-1113 (1992).
- Wilson, S. M., Bacic, A. Preparation of plant cells for transmission electron microscopy to optimize immunogold labeling of carbohydrate and protein epitopes. Nature protocols. 7, 1716-1727 (2012).
- Ding, B., Turgeon, R., Parthasarathy, M. V. Substructure of freeze-substituted plasmodesmata. Protoplasma. 169, 28-41 (1992).
- McDonald, K. L. Rapid Embedding Methods into Epoxy and LR White Resins for Morphological and Immunological Analysis of Cryofixed Biological Specimens. Microscopy and microanalysis. 20, 152-163 (2014).
- McDonald, K. L., Auer, M. High-pressure freezing, cellular tomography, and structural cell biology. BioTechniques. 41, 137, 139-141 (2006).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PloS one. 5, e9014 (2010).
- McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of microscopy. 235, 273-281 (2009).
