Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Met het tempo van de wetenschappelijke vooruitgang snel te accelereren, zijn nieuwe methoden nodig voor experimentele neurowetenschappen om snel en eenvoudig te manipuleren genexpressie in de hersenen van muizen. Hier beschrijven we een techniek voor het eerst geïntroduceerd door Passini en Wolfe voor directe intracraniële levering van viraal gecodeerde transgenen in de neonatale hersenen van muizen. In zijn meest elementaire vorm, de procedure vereist slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Echter, kan het protocol ook worden aangepast voor gebruik met stereotaxisch frames om consistentie voor onderzoekers nieuwe om de techniek te verbeteren. De werkwijze berust op het vermogen van adeno-geassocieerd virus (AAV) vrij van de cerebrale ventrikels in het hersenparenchym bewegen terwijl het ependymale bekleding nog onrijpe tijdens de eerste 12-24 uur na de geboorte. Intraventriculaire injectie van AAV op deze leeftijd resultaten wijdverspreide transductie van neuronen in de gehele hersenen. Expressie begint binnen enkele dagen na de injectie en blijft voor de lifetime van het dier. Virale titer kan worden aangepast aan de dichtheid van getransduceerde neuronen controle, terwijl co-expressie van een fluorescent proteïne een onmisbare label van getransduceerde cellen. Met de stijgende beschikbaarheid van virale kern faciliteiten voor zowel off-the-shelf, voorverpakte reagentia en aangepaste virale voorbereiding te bieden, biedt deze aanpak een tijdige methode voor het manipuleren van genexpressie in de hersenen van muizen, dat is snel, gemakkelijk, en veel minder duur dan traditionele kiembaan engineering.
Traditionele methoden voor het wijzigen van neurale genexpressie vereisen tijdrovende en dure kiembaan manipulaties. Alternative de novo benaderingen zoals in utero elektroporatie of lentivirale stereotaxische injectie geven snellere resultaten en minder duur maar heeft het nadeel dat complexe chirurgische ingreep 1-3. Verder transgenexpressie een beperkt ruimtelijk bereik van deze methodes. Hierin beschrijven we een snelle, gemakkelijke en economische methode voor grootschalige neuronale manipulatie via intraventriculaire injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) in de neonatale hersenen van muizen. De werkwijze werd eerst beschreven door John Wolfe en Marco Passini in 2001, waar ze voorgesteld kleine deeltjesgrootte van AAV stond het diffunderen in de cerebrospinale vloeistof bij het passeren van de laterale ventrikels via onrijpe ependymale barrière en in het hersenparenchym 4, 5. Intraventriculaire injectie van AAV in de ferste 24 uur na de geboorte opbrengsten wijdverspreide virale transductie van neurale subsets verspreid over elk gebied van de hersenen, van de reukkwabben de hersenstam 6,7. Viraal afgeleverd transgenen tot expressie worden gebracht en actief binnen dagen na injectie en aanhouden tot een jaar na transductie. Zo, dit veelzijdige manipulatie maakt studies variërend van vroege postnatale ontwikkeling van de hersenen tegen veroudering en degeneratie in de volwassene.
Bij de aanpassing van de techniek om onze specifieke experimentele behoeften, hebben we vooral gericht op AAV8 serotype want het is de meest efficiënte transductie neuronen 6. We zien dat de virale titer kan worden verdund tot de dichtheid van getransduceerde neuronen voor experimenten testen cel-intrinsieke gevolgen van genetische manipulatie controleren. Daarnaast hebben we aangetoond dat twee virussen kunnen worden gecoördineerd geïnjecteerd om expressiepatronen die eenzijdig gericht afzonderlijke of overlappende sets van neuronen produceren, afhankelijk van de gekozen serotypenvirale verpakking. Ons werk vergroot de veelzijdigheid van deze techniek voor gebruik in een groot aantal experimentele neurologie instellingen.
We hebben een veelzijdige werkwijze beschreven voor het manipuleren neuronale genexpressie middels AAV als middel voor grootschalige plaatsing in de neonatale muizenhersenen. Vergeleken met andere vormen van neuronale transgenese zoals in utero elektroporatie 1 of stereotaxische intracraniale injectie 2,3, neonatale virale injectie is relatief eenvoudig. De basis procedure kan worden uitgevoerd in een paar minuten met slechts een ijsemmer en een microliter spuit. Optimale overleving en transgene ex…
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |