Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.
Med tempoet i videnskabens fremskridt accelererer hurtigt, er der behov for nye metoder til eksperimentel neurovidenskab til hurtigt og nemt manipulere genekspression i musen hjernen. Her beskriver vi en teknik, først introduceret af Passini og Wolfe til direkte intrakraniel levering af viralt kodede transgener i den neonatale mus hjernen. I sin mest basale form, den procedure kræver kun en ice bucket og en mikroliter sprøjte. Dog kan protokollen også tilpasses til anvendelse med stereotaksiske rammer for at forbedre sammenhængen for forskere nye til teknikken. Metoden bygger på evnen af adeno-associeret virus (AAV) at bevæge sig frit fra de cerebrale ventrikler i hjernen parenkym mens ependymal foring er stadig umoden i den første 12-24 timer efter fødslen. Intraventrikulær injektion af AAV i denne alder resulterer i udbredt transduktion af neuroner i hele hjernen. Udtryk begynder inden for få dage efter injektion og fortsætter til lifetime af dyret. Viral titer kan justeres til at kontrollere tætheden af transducerede neuroner, mens co-ekspression af en fluorescerende protein giver en afgørende etiket transducerede celler. Med den stigende tilgængelighed af virale core faciliteter til at give både off-the-shelf, færdigpakkede reagenser og brugerdefinerede viral forberedelse, denne fremgangsmåde giver en rettidig metode til at manipulere genekspression i musehjernen der er hurtig, nem, og langt billigere end traditionel germlinie teknik.
Traditionelle metoder til modificering neurale genekspression kræver tidskrævende og dyre germline manipulationer. Alternative de novo tilgange såsom i livmoderen elektroporation eller stereotaktisk lentiviral injektion give hurtigere resultater, og er billigere, men har den ulempe, at den kræver komplekse kirurgisk indgreb 1-3. Endvidere transgenekspression har et begrænset geografisk område med disse metoder. Heri beskriver vi en hurtig, nem og økonomisk metode til udbredt neuronal manipulation via intraventrikulær injektion af adenoassocieret virus (AAV) i neonatale mus hjernen. Metoden blev første gang beskrevet af John Wolfe og Marco Passini i 2001, hvor de foreslog lille partikelstørrelse AAV gjort det muligt at diffundere i den cerebrale spinalvæske, når det passerer fra de laterale ventrikler via umoden ependymal barrieren og ind i hjernen parenkym 4 5. Intraventrikulær injektion af AAV i fFØRSTE 24 timer efter fødsel udbytter udbredt viral transduktion af neurale delmængder spænder hver region af hjernen fra olfaktoriske pærer på hjernestammen 6,7. Viralt leveret transgener udtrykkes og aktiv inden for få dage efter injektion, og vare i op til et år efter transduktion. Således er denne alsidige manipulation muliggør undersøgelser spænder fra tidlig postnatal udvikling hjerne til aldring og degeneration i voksen.
Ved at tilpasse teknikken til vores specifikke eksperimentelle behov, har vi primært fokuseret på AAV8 serotype fordi det er den mest effektive til at transducere neuroner 6. Vi viser, at virustiter kan fortyndes til at kontrollere tætheden af transducerede neuroner til eksperimenter testcelle-iboende konsekvenser af genmanipulation. Derudover viser vi, at to vira kan co-injiceres til frembringelse af ekspressionsmønstre, der orienteres mod distinkte eller overlappende sæt af neuroner, afhængigt af de serotyper, der er valgt tilviral pakning. Vores arbejde udvider alsidigheden af denne teknik til brug i en bred vifte af eksperimentelle neuroscience indstillinger.
We have described a versatile procedure for manipulating neuronal gene expression using AAV as a vehicle for widespread delivery into the neonatal mouse brain. Compared with other methods of neuronal transgenesis such as in utero electroporation1 or stereotaxic intracranial injection2,3, neonatal viral injection is relatively easy and simple. The basic procedure can be performed in minutes with only an ice bucket and a microliter syringe. Optimal survival and transgene expression can be attained by …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Robert A. and Rene E. Belfer Family Foundation, NIA R21 AG038856 (JLJ), BrightFocus Foundation Alzheimer’s Disease research grant A2010097 (JLJ), and NIA Biology of Aging Training grant T32 AG000183 (support for SDG).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
ICR outbred mice | Harlan | Hsd:ICR (CD-1) | This strain is also known as CD-1 |
FVB inbred mice | The Jackson Laboratory | 1800 | 5-6 weeks of age |
Nestlets | Lab Supply | NESTLETS | |
Shepherd shacks | Lab Supply | SS-mouse | |
High fat rodent chow | Purina Mills | PicoLab Mouse diet 20, #5058 | This is our standard breeder chow |
High fat rodent chow (alternative) | Harlan Laboratories | Teklad Global 19% protein rodent diet #2019S | If low phytoestrogen, autoclavable diet is needed |
Injection syringe | Hamilton | 7653-01 | 10 ml syringe |
Injection needles | Hamilton | 7803-04, RN 6PK PT4 | 32 gauge, for standard P0 injections |
Metal plate for cryoanesthesia | McMaster Carr | 8975K439 | Raw aluminum plate, 6” x 12”, 0.25” thick, will need to be cut into 3 equal pieces and edges sanded by local machine shop |
Small animal stereotaxic device with digital readout | David Kopf Instruments | Model 940 | |
Universal syringe holder with needle support foot | David Kopf Instruments | Model 1772-F1 | |
Neonatal frame | Stoelting | 51625 | Officially called a mouse and neonatal rat adaptor |
Biohazard disposal bags with sterile indicator | VWR | 14220-030 | Important! – Check with local veterinary and environmental safety staff to learn your institute’s protocol for biohazard waste disposal |