Summary
Denne metode skaber en konkret, velkendt miljø for musen til at navigere og udforske under mikroskopiske billeddannelse eller encellede elektrofysiologiske optagelser, som kræver fast fiksering af dyrets hoved.
Abstract
Det er almindeligt anerkendt, at brugen af generel anæstesi kan underminere relevansen af elektrofysiologiske eller mikroskopiske data fra et levende dyr hjerne. Desuden langvarige opsving fra anæstesi begrænser hyppigheden af gentagne optagelse / imaging episoder i longitudinelle studier. Derfor er nye metoder, som ville give stabile optagelser fra ikke-bedøvede opfører mus forventes at fremme områderne cellulære og kognitive neurovidenskab. Eksisterende løsninger spænder fra blotte fysiske tilbageholdenhed til mere sofistikerede metoder, såsom lineære og sfæriske løbebånd anvendes i kombination med computer-genereret virtuel virkelighed. Her er en ny metode, der er beskrevet, hvor en hoved-fikseret mus kan flytte rundt en luft-løftet mobil homecage og udforske sine omgivelser under stress-fri betingelser. Denne metode giver forskerne at udføre adfærdsmæssige test (f.eks læring tilvænnings eller roman objekt anerkendelse) samtidig medto-foton mikroskopisk billedbehandling og / eller patch-clamp optagelser, alt sammen kombineret i et enkelt eksperiment. Denne video-artiklen beskriver anvendelsen af den vågne dyrehoved fikseringsindretning (mobil homecage), viser de procedurer, animalske tilvænning, og et eksempel på en række mulige anvendelser af fremgangsmåden.
Introduction
En spændende nyere tendens i neurovidenskab er at udvikle eksperimentelle tilgange til molekylær og cellulær sondering af neuronale netværk i hjernen på vågen, opfører gnavere. Sådanne tilgange holder lover at kaste nyt lys over neurofysiologiske processer, der ligger til grund for motorik, sansemotorisk integration, perception, indlæring, hukommelse, samt skade progression, neurodegeneration og genetiske sygdomme. Desuden optagelse fra vågen dyrets hjerne lover i udvikling af nye terapeutiske midler og behandlinger.
Der er en voksende bevidsthed om, at anæstesi, som har været almindeligt anvendt i neurofysiologiske forsøg, kan påvirke de grundlæggende mekanismer af hjernens funktion, der kan føre til fejlagtig fortolkning af eksperimentelle resultater. Således udbredte bedøvelsesmiddel ketamin hurtigt øger dannelsen af nye dendritiske Torner og forbedrer synaptisk funktion 1; en anden almindeligt anvendt anesthetic isofluran ved kirurgisk anæstesi niveauer helt undertrykker spontan kortikale aktivitet hos nyfødte rotter og blokerer spindel-burst svingninger i voksne dyr 2. På nuværende tidspunkt er kun et begrænset antal metoder gør det muligt forsøg i ikke-bedøvede mus ved hjælp af to-foton mikroskopisk billedbehandling eller patch-clamp optagelser. Disse fremgangsmåder kan opdeles i frit bevægelige og hoved-faste præparater.
Den unikke tiltrækningskraft et frit bevægelige forberedelse dyr er at det giver vurdering af naturlig adfærd, herunder hele kroppen bevægelser under navigation. En måde at billedet i hjernen på en frit bevægelig gnaver er at fastgøre en miniaturiseret hovedmonteret mikroskop eller fiberscope 3-5. Men miniaturiserede enheder tendens til at have begrænset optisk ydeevne i forhold til objektiv-baserede to-foton mikroskopi, og ikke let kan kombineres med hele celle patch-clamp optagelser 6.
Den existing løsninger til head-fastsættelse af en vågen gnaver har primært påberåbt enten fysisk tilbageholdenhed 7,8 eller på at træne dyr til at udstille frivillig nakkestøtte 9. En anden populær metode er at tillade dyrets lemmer til at bevæge sig ved at placere den på, fx en kugleformet løbebånd 10; denne tilgang er ofte kombineret med computer-genereret virtuel virkelighed. Elektrofysiologiske eksperimenter på head-faste mus har for det meste brugt ekstracellulære optagelser og blev brugt til at studere central regulering af hjerte-kar-funktion 11, effekter af anæstesi på neuronal aktivitet 12, det auditive reaktion i hjernestammen 13 og informationsbehandling 14. De banebrydende intracellulære / hel-celle optagelser i vågen opfører dyr blev udført i 2000'erne og har fokuseret på neurale aktivitet relateret til perception og bevægelse 15-20. Omkring samme tid blev de første mikroskopiske billeddiagnostiske undersøgelser på vågne mus publeret, hvor to-foton mikroskopi blev brugt i den sensoriske cortex fysisk fastholdes rotter 7 og på mus, der kører på en kugleformet løbebånd 21.
Efterfølgende in vivo mikroskopi og elektrofysiologi undersøgelser viste, at et hoved fiksering præparat med held kan kombineres med adfærdsmæssige paradigmer baseret på forben bevægelser, lugt anerkendelse, piske og slikke 8,22-25. Mus placeret på den sfæriske løbebånd kan trænes til at navigere den virtuelle visuelle miljø genereret af en computer 10,26. Intracellulære / ekstracellulære optagelser viste i et head-fast dyr navigere sådan virtuelt miljø, kan aktivering af hippocampus sted celler påvises 27. I et virtuelt visuelt miljø, mus demonstrere normal bevægelse-relaterede theta rytme i det lokale potentiale felt og theta-fase præcession under aktiv bevægelse 27. For nylig, den rumlige og tidsmæssige Aktivitety mønstre af neuronale populationer blev registreret optisk mus under arbejdet beslutningstagere hukommelse opgaver i et virtuelt miljø 28.
Trods have aktiveret banebrydende forskning, den sfæriske løbebånd design har flere iboende begrænsninger. Først dyret kræves for at flytte på et ubegrænset overflade af en roterende luft-løftet kugle, der udgør ingen håndgribelige forhindringer såsom vægge eller barrierer. Denne begrænsning er kun delvist kompenseret af computer-genereret "virtual reality", fordi det visuelle er nok mindre effektive på mus og rotter sammenlignet med den taktile sanseindtryk (f.eks whisker-touch eller slikke), som disse arter naturligvis afhængige på. For det andet kan stor krumning af kugleoverfladen være ubehageligt for laboratoriemus anvendes til at gå på et fladt gulv i deres bure. Endelig, det store diameter af bolden (mindst 200 mm for mus og 300 mm for rotter) gør den lodrette størrelse af den sfæriskeløbebånd enhed relativt stor. Dette gør det vanskeligt at kombinere sfærisk løbebånd med størstedelen af kommercielt tilgængelige mikroskopi opsætninger, og kræver ofte at bygge en ny setup omkring løbebåndet ved hjælp af skræddersyede mikroskop rammer.
Her er en ny metode, der er beskrevet, hvor en hoved-fikseret mus kan flytte rundt en luft-løftet mobil homecage der har et fladt gulv og materielle vægge, og udforske det fysiske miljø under stress-fri betingelser. Denne artikel viser procedurerne i mus uddannelse og hoved fiksering og giver repræsentative eksempler, hvor to-foton mikroskopi, iboende optisk billedbehandling og patch-clamp optagelser udføres i hjernen af vågen opfører mus.
Protocol
Alle de procedurer, der præsenteres her blev udført i henhold til lokale retningslinjer for pleje af dyr (Den finske lov om dyreforsøg (62/2006)). Dyret licens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) blev opnået fra kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Voksne mus (alder 1-3 måneder, vægt 20-40 g) blev holdt i gruppe-boliger bure i den certificerede dyr anlægget af universitetet i Helsinki og forsynet med mad og vand ad libitum.
1.. Kraniel Window Implantation
Kranie vindue er implanteret i henhold til offentliggjorte protokoller 29-31 med mindre modifikationer, som kort beskrevet nedenfor:
- Sterilisere instrumenter, før du starter kranie vindue implantation. Opretholde sterile betingelser under operationen for at minimere risikoen for postoperative komplikationer.
- Indgivelse af en smertestillende (ketoprofen, 2,5 mg / kg) 30 minutter før kirurgi og 24 timer efter kirurgi. Enesthetize musen anvendelse af en blanding af ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injiceret intraperitonealt. Regelmæssigt overvåge anæstesidybden ved pote klemme. Brug en varmepude til at opretholde dyrets kropstemperatur på 37,0 ° C. For at reducere kirurgi-induceret inflammation og hjerneødem, administrere dexamethason (2 mg / kg) ved subkutan injektion.
- Påfør øje smøremiddel til at beskytte øjnene fra at få tørt. Barbere musens hoved og rense barberede område. Skær huden ved hjælp af kirurgiske sakse og tænger langs linien fra harmoniske til panden. Fjern eventuelle bindevæv fastgjort til kraniet.
- Langsomt og forsigtigt bore et lille godt på venstre frontal knoglen ved hjælp af en højhastigheds kirurgisk boremaskine. Skru en mini bolt (se Materialer) ind i boret godt. Udfør ikke mere end en-og-en-halv hele omdrejninger af skruen.
BEMÆRK: Undgå de områder, der er placeret direkte over de overfladiske kortikale fartøjer. Forstyrrelse af disse Vessels kan føre til massiv blødning. - For at udføre kraniotomi, bore et cirkulært vindue (3-3,5 mm i diameter) i højre parietal knogle. En dråbe af cortex-buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCI, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 og 2 mM MgSO4 i destilleret H2O suppleret med penicillin 100 enheder / ml og streptomycin 100 ug / ml) og forsigtigt fjerne del af knoglen placeret inde i den cirkulære vindue.
BEMÆRK: at udtrykke et fluorescerende protein i en bestemt underpopulation af celler, udføre intrakranial injektion af adeno-associeret virus (AAV) vektor eller andre virale vektorer på dette tidspunkt i proceduren. - Placer en runde dækglas (# 1.5 tykkelse kode) på kranie vindue. Fastgør dækglasset til kraniet med polyacryl lim. Placer en metalholder på toppen af dækglasset og ordne det med blandingen af dental cement og polyacryl lim.
BEMÆRK: Den ovenfor beskrevne procedure er optimeret til kranielle vindueranvendes i optiske billeddannelse eksperimenter. For at forberede en "omvendt" kranie vindue egnet til elektrofysiologiske eksperimenter, skal du bruge en anden procedure. Først lim metal holderen til kraniet. Bor et cirkulært vindue i indehaverens åbning som eksemplificeret i videoen. Alternativt gøre en mindre craniotomy (mindre end 0,5 mm i diameter) over regionen af interesse at forhindre eller minimere hjernen bevægelse 32.. Opdater kortikale buffer eller placere en dråbe af silikone lim på kranie vindue, og luk den med en runde dækglas. - Efter endt operation, dyret i en opvarmet bur med let tilgængelig mad og vand. Retur dyret til gruppen-boliger bur, efter at det er helt restitueret fra anæstesi. Re-administrere smertestillende ved afsløre eventuelle tegn på smerte, herunder modvilje mod at bevæge sig, æde eller drikke, vægttab, savlen, pilorektion eller unormale respiratoriske lyde.
2.. Animal Håndtering
- Tag musen fra sit bur og bare holde den i 5-10 min. Vær rolig, mens håndtering af dyr, undgå at rykvise bevægelser og lyde.
- Efter håndtering, returnere musen til sit bur.
- Gentag proceduren for håndtering af 2-3x med ulige intervaller mellem håndtering episoder, for at gøre musen komfortabel med experimentalist.
- Tag en lille blød klud og pak dyret 2-3x med ulige mellemrum.
- Dyr bør forblive rolig og vænne sig til at blive pakket. Hvis musen er spændt og nervøs, gentag procedurerne for håndtering og indpakning.
3.. Animal Training
- Start træning af dyret i den mobile homecage den næste dag efter tilvænning til håndtering og indpakning er afsluttet.
- Optag dyrets veje dagligt før og under træning.
BEMÆRK: Hvis der under træningen, at dyret mister over 10% af sin vægt, det bør udelukkes fra teksperimenterer han. - Justere den lodrette placering af hovedet fikseringsarm af den mobile homecage enhed for at svare til størrelsen af den uddannede dyr. Slut luftindtag enheden til standardlaboratorieudstyr trykluft udløb (typisk enten en gas tank eller en luft-pumpe, der tilvejebringer et tilstrækkeligt højt tryk og hastigheden af luftstrømmen, dvs ca 5 bar og 300 l / min.)
- Pak dyret i en klud.
- Sæt metal holderen, som er fastgjort til dyrets hoved, ind i hovedet fiksering arm og fastgør den ved at stramme skruerne. Tænd for luftstrømmen og sørg for, at luftstrømmen er optimal for fri flotation af den luft-løftet homecage. Slip dyret ind i den mobile homecage ved at fjerne klud.
- For at vænne dyret til støj, giver en konstant udsættelse for omgivende lyde (ved hjælp af for eksempel radioen eller indspillet musik og tale), under alle træningspas samt under forsøgene.
- Dnder den første træning, holde rummet lys på for den første time, derefter slukke lyset indtil slutningen af træningen.
- Efter 2 timer på træning i den mobile homecage, slipper dyret fra hoved fiksering og returnere den til dens bur med en forsyning af vand og mad. Lad det i mindst 2 timer under hvile forhold.
- Rengør mobil homecage efter hver træning ved hjælp af en 70% ethanol opløsning, og skyl den med vand fra hanen. Soak-vandet op med papir håndklæde og tørre den mobile homecage inden næste brug.
- Udfør fortløbende uddannelsesforløb for 2 timer, med rumbelysning slukket, mens dyret er under uddannelse.
- Udfør træningen to gange dagligt.
- Efter 8 til 12 træningssessioner bruge dyret i en eksperimentel session for op til 2 timer ad gangen.
BEMÆRK: Under langvarige træningssessioner, der varer mere end 1-2 timer, overveje at give musen wed drikkevand, som kan leveres enten manuelt eller ved hjælp af en pipette holder fastgjort til den mobile homecage rammen. Alternativt kan vandet leveres til ad libitum brug af dyret ved at placere tyktflydende dråber hydro-gel direkte på væggene i den mobile homecage.
NB: Husk at veje dyrene hver dag før træning at udelukke enhver kronisk stress effekter. Udeluk et dyr fra eksperimentet, hvis på noget tidspunkt, det viser stressreaktioner såsom frysning, vokalisering, eller stress-induceret diarré.
4.. Ansøgninger
- To-foton Imaging i Awake Mouse bevæger sig rundt i Mobile Homecage
- Saml mobil homecage. Kontroller positioner af broen og hoved fikseringsarm.
- Pak uddannet dyr i en klud. Placer dyret i den mobile homecage. Clamp metalholder den i hovedet fiksering arm. Fjern klud.
- Rengør implanterede dækglas fra støv meden 70% ethanol opløsning og lad det tørre.
- Placer en dråbe af fordybelse væske på låget klassen. Fortrinsvis bruge en viskøs opløsning, fordi vandet vil fordampe hurtigt.
- Placer den mobile homecage enhed med den uddannede dyr under mikroskop (medmindre du har en anden, identisk enhed, som er stationær i mikroskopi setup).
- Udfør billeddannelse ved hjælp af enten et skræddersyet eller en kommercielt tilgængelig laser-scanning mikroskop imaging system er udstyret med en femtosekund pulserende infrarød laser.
- Find regionen af interesse ved hjælp af den brede felt tilstand af fluorescens mikroskop. Brug lange pass filtre til at vurdere hjernens vasculature og vælge en passende målområde efter at have undersøgt det mønster af blodkar.
- Til billedet kortikal vaskulatur, indsprøjte en 1% opløsning af 70.000 MW Texas Red-konjugeret dextran (eller dens analog), enten i halen vene, mens dyret er immobiliseret i klud eller retro transorbitalt mensdyr er placeret i den mobile homecage. Tune to-foton laser til 860 nm og bruge båndpasfilter (590-650 nm) for at samle det udsendte lys. Brug emission filter 515 til 560 nm for at vurdere de fine detaljer i neuronal morfologi eller neuronal aktivitet anvendelse af for eksempel transgene mus, der udtrykker YFP eller Ca2 + - følsom fluorescerende protein GCaMP3 i en subpopulation af neuroner under Thy1 promotoren.
- Brug en passende software til billedbehandling erhvervelse.
- Efter billedbehandling, slipper dyret fra hoved fiksering arm ved at løsne skruerne. Sende dyret tilbage til sit bur og lad det hvile i mindst 2 timer, før du starter den næste imaging session.
- Opbevar koordinaterne for hver region af interesse (ROI) for efterfølgende reimaging. Billede samme ROI'er over tid, og justere koordinaterne hver gang at maksimere billedet overlap.
- Analyser billederne og tredimensionale rekonstruktioner ved en passende softwer (f.eks ImageJ osv.).
- Intrinsic Optical Imaging i Awake Mouse bevæger sig rundt i Mobile Homecage
- Saml mobil homecage under billedet erhvervelse kamera af en iboende optisk billeddannelse setup.
- Pak uddannet dyr i en klud. Placer dyret i den mobile homecage. Clamp metal holderen ind i hovedet fiksering arm.
- Rengør implanterede dækglas fra støv med en 70% ethanol opløsning og lad det tørre.
- Placer en dråbe glycerol på implanterede glas og dække det med en 8 mm runde dækglas.
- Placer en manipulator med air-slag rør modsat den kontralaterale vibrissa.
- Juster placeringen af high-speed kamera og fokusere den på kortikale kar.
- Brug grønt lys (filter 546BP30) uden et kamera filter til at erhverve fartøjer kortet.
- Fokus dybere ind i cortex, cirka 400 mikrometer under den kortikale overflade.
- Til billedet than blodets iltning niveau-afhængig (BOLD) optisk signal, placere 590LP filter foran kameraet og belyse cortex med rødt lys (filter 630BP30).
- Juster belysningen af kortikale overflade, således at det er jævnt fordelt i regionen af interesse, undgå overeksponering. Juster belysningsintensiteten således at området af interesse ligger inden for 70-90% segment af kameraets dynamikområde.
- Brug LongDaq billede erhvervelse software til at indsamle billeder fra kameraet.
- Brug billede erhvervelse frekvens på 1 til 10 Hz (dvs. mellem 1 og 10 frames per sekund) til forsøg med lavfrekvent stimulation (0,05 Hz).
- Sluk lyset i værelset for at undgå enhver interferens med iboende optisk signal.
- Tillad mindst 30 min for musen for at tilpasse sig til den mobile homecage.
- Billede baseline aktivitet i løbet af en 6-min episode uden stimulation.
- For at optage evoked cortical aktivitet, stimulerer vibrissa i en 10 sek ON/10 sek OFF (0,05 Hz stimulation) med en høj frekvens (25 Hz) tog af luft pust for den samlede periode på 6 min.
- Efter billede erhvervelse, slip musen fra hovedet fikseringsarm og returnere det til sit bur.
- Brug ikke ekstra filtrering af data for frekvens, fordi amplituden for stimulation reaktioner tendens til at være forholdsvis høj i vågne dyr, hvilket resulterer i fremragende signal støjforhold.
- Konverter de opnåede sæt af billeder til *. Tif stak filer og analysere dem yderligere hjælp, fx open source FIJI software (ImageJ). Fratræk baseline spontan aktivitet fra de rammer, der er opnået i løbet af vibrissa stimulation ved hjælp af billedet Calculator værktøj. Alternativt, filtrer data i frekvensdomænet ved anvendelse af passende software.
- Patch-clamp optagelser i Awake Mouse Flytning Omkring Mobile Homecage
- Saml mobil homecage.
- Pak uddannet dyr i en klud. Administrere trimethoprim (5 mg / kg) og sulfadoxin (25 mg / kg) for at forhindre bakteriel infektion. Placer dyret i den mobile homecage. Clamp metal holderen ind i hovedet fiksering arm.
- Rengør og sterilisere den implanterede dental cement "loft" og dække glasset med en 70% ethanol opløsning eller 0,5% chlorhexidindigluconat og lad det tørre.
- Langsomt og forsigtigt fjerne dækslet glas fra metal holderen.
- Opdater kortikale buffer suppleret med penicillin, streptomycin og rengør kranie vinduet fra vragrester med en steril hæmostatisk tampon.
- Placer jordelektrode i det kortikale buffer.
- Placer elektrofysiologi hovedtrin i en mikromanipulator.
- Fabrikere pipetter fra borosilikatglas, der tager sigte på spidsen modstand spænder fra 6,5 til 8.5MΩ. Fyld patch-pipetten med en intracellulær opløsning. Sammensætningen af patch-pipetten løsning er denfølgende (i mM): 8 KCI, 111 K-gluconat, 0,5 CaCl2, 2 NaOH, 10 glucose, 10 HEPES, 2 Mg-ATP og 5 BAPTA, pH blev justeret til 7,2 med KOH. Membranpotentialet værdier skal korrigeres for en beregnet liquid junction potentialet på -12 mV 33.
- Target regionen af interesse ved hjælp af stereotaksiske koordinater, og hurtigt bevæge elektroden ind i hjernen og samtidig opretholde stærk positiv pres på pipettespidsen. Efter dura mater penetration og pipetten positionering måle spidsen modstand og kassere de elektroder, der viser en stigning i styrke på mere end 10-15%, for at forbedre succesraten for de efterfølgende trin.
- Reducer det positive tryk til det halve for at undgå kvældning af det omgivende hjernevæv. Yderligere skridt svarer til den standard "blind patch" protokol. For at finde en neuron til at optage fra, sænk spidsen ind i hjernen på en trinvis måde, indtil en neuron er påvist i et tæt proximity pipettespidsen, som indikeret ved en karakteristisk tidsmæssig sekvens af elektrode impedans ændringer. En vigtig indikator for tilstedeværelsen af et neuron er en monoton stigning i elektrode modstand på tværs af flere på hinanden følgende frem trin af pipette (typisk en stigning på 20% i pipetten modstand på tværs af tre 2-um trin).
- Til dannelse af en gigaseal kontakt med målrettet neuron anvende et negativt tryk og hyperpolarisering af pipetten.
- Anvend en kort impuls af et større negativt tryk til cellen for at etablere helcelle-konfiguration. Træk elektroden med 2-3 um at holde en god tætning.
- Optag spontane eller fremkaldte aktivitet i en ønsket periode, op til 20-40 min.
- Efter optagelsen fjerne pipetten fra hjernen.
- Opdater kortikale buffer eller placere en dråbe af silikone lim på kranie vinduet, derefter lim en runde dækglas på toppen af metal holderen.
- Slip Animal fra hovedet fikseringsarm ved at løsne skruerne. Sende dyret tilbage til sit bur i mindst én dag før den næste optagelse.
- Analyser af data med, fx den FitMaster software.
- Tilvænning-dishabituation olfaktoriske test i Awake mus bevæger sig rundt i Mobile Homecage
- Vedhæfte en ren bomuld stykke (2 x 2 cm) dyppet i vand fra hanen til den indvendige side af væggen i den mobile homecage hjælp af en to-sidet tape. Opdel mobile homecage væg i fire zoner ved at placere farvemarkeringerne på den udvendige side af væggen, således at det stykke bomuld er placeret i midten af "target zone". Fastgør dyr i headholder arm mod væggen segment modsat den "target" zone og gør det muligt at tilpasse sig til den mobile homecage i 30 min.
- Tag et andet stykke af ren bomuld og våd det med et par dråber af den 1% vanille ekstrakt. Udskift ren bomuld på mobil homecage væggen med den ene bærer Vanilla lugt. Præsenter lugten i 5 min. Spor bevægelserne af mobile homecage under lugten præsentation periode. Anslå omfanget af interesse for lugten ved at måle den samlede tid, som dyret tilbringer vender "target" zone i forhold til den samlede tid for mobil homecage bevægelse.
- Gentag 5-min programsession tre gange med duften af vanille, med en 5 min inter-session interval. Brug et frisk stykke af "vanilla" bomuld i hver session.
- Præsenter dyret med et socialt betydelig lugt under den sidste, femte session. Fugt en ren stykke bomuld med få dråber urin (opnået på den foregående dag fra et dyr af det modsatte køn), og placere den i midten af målzonen i 5 min.
- Novel lugt anerkendelse i vågen mus bevægelse omkring den mobile homecage
- Opdel væggen i fire zoner ved at placere farvemarkeringerne på den udvendige side af den mobile homecage væg. AttACH to rene bomuld stykker (2 x 2 cm) dyppet i vand fra hanen til den indvendige side af væggen i midten af zonerne modsatrettede hinanden (udpeget som target zone 1 og målzone 2). Fastgør dyr i headholder arm står over for en mur segment uden for målzonerne og lade den tilpasse sig til den mobile homecage i 30 min.
- Udskift begge bomuld stykker med de friske dem:. Placere en bomuld stykke våd med 1% vanille ekstrakt til at målrette zone 1 og en anden våd med vand fra hanen til at målrette zone 2 Optag video af de mobile homecage bevægelser for 10 minutter i løbet af lugten præsentation session. Beregn lugten deltage som den procentdel af den tid, som dyret bruger vender målzone 1 i forhold den samlede tid brugt over zone 1 og 2.
- Efter en 10 min interval, placeres et andet par applikatorer på homecage væggen for den efterfølgende periode på 10 min. Placer "vanilla" bomuld i target zone 1 og bomuld applikator våd med 1% banan eXtract i målzonen 2. Lav en videooptagelse af de mobile homecage bevægelser. Beregn præference til romanen lugt, som den procentdel af tiden, at dyret tilbringer mod væggen segment med romanen lugt (målzone 2) i forhold til den akkumulerede tid vender zone 1 og 2.
Representative Results
Metoden præsenteres her er beregnet til mikroskopisk billeddannelse eller encellede elektrofysiologiske optagelser i vågen tilstand, head-fast, men ellers frit bevægelige og opfører mus. Dyret kan bevæge sig i to dimensioner i en reel (i modsætning til virtuel), konkret og velkendt miljø, mens dyrenes kranium sidder fast til hovedet fiksering arm. Habituating musene luft-løftet mobile homecage består af 4-6 dage to gange dagligt 2-timers træning (fig. 1). De uddannede dyr kan derpå anvendes i forsøgene straks. En typisk undersøgelse omfatter en række billeddiagnostiske sessioner eller patch-clamp indspilningerne, der er placeret med intervaller spænder fra få timer til flere dage eller uger. Vigtigt er det, kan både optiske og elektrofysiologiske optagelser udføres samtidig med kognitive eller adfærdsmæssige stimuli og udlæsninger inden for et enkelt eksperiment.
For at evaluere den mekaniske stabilitetmus hoved fiksering i den mobile homecage blev billedsekvenser af kortikale fartøjer mærket med fluorescerende-konjugeret dextran og kortikale dendritter udtrykker YFP indsamlet mens forsøgsdyrene var navigere den mobile homecage (Figur 2). Den maksimale forskydninger af hjernen under dyrets bevægelse ikke overstiger typisk 1-1,5 mikrometer. Disse forskydninger skete i de vandrette retninger og meget sjældent resulteret i en påviselig skift af afbildningsplanet, overflødiggør enhver korrektion af bevægelse. Stabil hoved fiksering i mobile homecage muliggør kvantificering af de enkelte dendritiske Torner i vågne dyr med samme pålidelighed som i bedøvede mus. Kan overvåges dendritiske rygsøjlen tæthed, morfologi og omsætningen i longitudinelle studier med flere billeddiagnostiske sessioner udføres med mellemrum lige fra et par timer til flere dage eller uger.
Anvendeligheden af de mobile homecage til funktionel optisk billeddannelse blev testet i somatosensoriske cortex vågne mus under anvendelse af to fremgangsmåder: i) to-foton mikroskopi på Thy1-GCaMP3 transgene mus og ii) iboende optisk signal billeddannelse i vildtypemus. Ca 2 + billeddannelse blev udført i lag 2/3, der indeholder cellelegemer mange fluorescensmærkede neuroner, såvel som deres dendritter og axoner (figur 3). Afbildninger af fluorescens-over-tid fra udvalgte områder af interesse (ROI) er vist i figur 3, viser spontan neuronal aktivitet (målt som forbigående stigninger i GCaMP3 fluorescens) under musens aktive navigation i den mobile homecage. Optisk billeddannelse baseret på iboende signaler tillader kortlægge den rumlige fordeling af funktionelle domæner. Figur 4 illustrerer bølgeagtige ændringer i blodets iltning niveau (afspejler regionale neuronal aktivering), der formerer sig langs somatosensoriske cortex som reaktion på vibrissa stimulation på hyppigheden af 0,05 Hz.
For at teste gennemførligheden af patch-clamp optagelser med mobil homecage, vi brugte 2-3 måneder gamle C57BL/6J-mus. Layer 2/3 neuroner i somatosensoriske cortex blev registreret fra helt celle konfiguration ved hjælp strømtang tilstand. Patch-clamp-optagelse i hjernen af vågen mus hoved fast på mobil homecage i det væsentlige svarede til blinde patch-fastspænding i hjernen skiver. Ca. 50% af forsøg resulterede i vellykket gigaseal formation, hvoraf mere end 70% viste stabil helcelle-konfiguration optagelse. Ingen begivenheder for at miste gigaseal kontakt på grund af mekaniske forskydning af celler blev observeret. Figur 5 illustrerer en 60-sek fragment af en repræsentativ 10-min lange strøm-clamp optagelse korreleret med episoder af musens aktiv (drift) og passive (hviler) stater.
Figur 1.. Metoden til hoved fiksering af vågen mus i den mobile homecage. A) Oversigt over luft-løftet mobil homecage design og illustrationer af det generelle koncept. B) Diagram over en typisk eksperimentel tidslinje. Undersøgelsen begynder med implantation af kranie vindue to uger inden habituating musen til håndtering og indpakning, som er efterfulgt af otte to gange dagligt træningssessioner. Den typiske Undersøgelsen omfatter en række billeddiagnostiske sessioner eller patch clamp indspilningerne, der er placeret med intervaller spænder fra få timer til flere dage eller uger. Både optisk og elektrofysiologiske målinger kan ske parallelt med kognitive eller adfærdsmæssige stimuli og udlæsninger inden for et enkelt eksperiment. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Eksempel på to-foton mikroskopisk billeddannelse på vågne mus bevæger sig rundt i mobil homecage. A, B) Kortikal vaskulatur, mærket med 70 kDa Texas Red-konjugeret dextran. Diameteren af de enkelte segmenter fartøjets måles ved at plotte over tid profil linjer trukket tværs karhulrummet i perioder med musens hviler og kører (A). Hastigheden af blodgennemstrømningen i arterier og vener måles ved linje-scanning langs linjer trukket parallelt med karvæggen (B). C, D) fine detaljer i neuronal morfologi visualiseret i hjernen hos transgene mus, der udtrykker YFP i subpopulationen af neuroner under Thy1 promotor. Tredimensional rekonstruktion af pyramidale neuroner i musens somatosensoriske cortex (C). Billederne af en dendritiske branch erhvervet i en vågen, opfører mus er tilstrækkelig stabil til kvantificering af de enkelte dendritiske rygsøjlen morfologi (D). E) Kvantificering af hjernens bevægelse forårsaget af musebevægelser. Større amplitude forskydninger korrelerer med perioder med musens kørende. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.. Eksempel på neuronal befolkning aktivitet i vågen Thy1-GCaMP3 musen bevæger sig rundt på mobil homecage. A) To-foton billede af kortikale lag II / III-neuroner. ROIs, for eksempel nervecellelegemer, dendritter og axoner er vist i gult. B) bf / F spor af GCaMP3 fluorescens fra ROIs vist i A (tid sriet indspillet på 1,5 sek / ramme). C) indzoomet region filmede ved 65 msek / ramme. D) fluorescens fra gul ROIs i C plottet over tid, viser de forbigående stigninger (rød) i GCaMP3 fluorescens, der svarer til handling potentielle-induceret Ca 2 + tilstrømning episoder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4.. Eksempel på kortlægning af rumlige fordeling af funktionelle responser i cortex af en vågen mus ved hjælp af imaging de iboende optiske signaler. A) Bright felt baggrund af de overfladiske blodkar gennem kranie vindue. B) Magnitude kort over baseline aktivitet i mobil homecage løbet af en 6-min episode. C) Magnitude kort over neuronal aktivitet formerings langs somatosensoriske cortex som reaktion på vibrissa stimulation ved en frekvens på 0,05 Hz. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5.. Eksempel på hel-celle patch-clamp optagelse i cortex af en vågen mus bevæger sig rundt på mobil homecage. A) Strøm-clamp optagelse fra en neuron i mus kortikale lag 2/3. A 0,5 sek, 100 pA nuværende injektion (angivet under trace) resulterer i en byge af aktionspotentialer. Cellen viste spike frekvens tilpasning karakteristisk for pyramideneuroner. B) Kontinuerlig strøm-clamp optagelsefra samme neuron korreleret med musen 'bevægelsesaktiviteten (vist i pink over trace). Repræsentant spontan aktivitet af laget 2/3 neuron i perioder med musens hvile (C) og kører (D). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6.. Animal vægttab og motorisk aktivitet af head-fixed/non-fixed mus under træning i den mobile homecage. A) Animal vægt (middel + SD,%) før træningssessioner. Bemærk, at vægttab er helt vendes ved 7-8 th træningssession. B) bane musens horisontale bevægelse i forhold til den mobile homecage,der blev ekstrapoleret fra sporet bevægelse af den mobile homecage løbet 8. træningssession. C) Bælte bevægelser af en ikke-head-fast mus udforske runde bur i løbet af 8. træningssession. D) varighed head-fast (cirkel), og løstsiddende (trekant) mus bevægelse under 1-4 th dags træning (middelværdi + SD,%). Bemærk, at på dag 4, head-faste mus viser hverken frysning (som på dag 1) eller overdreven motorisk aktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
