Abstract
Det er allment anerkjent at bruk av generell anestesi kan undergrave relevansen av elektrofysiologiske eller mikroskopiske data innhentet fra et levende dyr hjerne. Videre er den omstendelige gjenvinning fra anestesi begrenser frekvensen av gjentatte opptak / avbildnings episoder i langsgående studier. Derfor er nye metoder som ville tillate stabile opptak fra ikke-bedøvede oppfører mus ventes å avansere innen cellulære og kognitive nevrovitenskap. Eksisterende løsninger spenner fra ren fysisk tvang til mer avanserte metoder, som lineære og sfæriske tredemøller brukes i kombinasjon med datagenerert virtuell virkelighet. Her er en ny metode som er beskrevet der en head-fast mus kan flytte rundt en luft-løftet mobile homecage og utforske omgivelsene under stress-frie forhold. Denne metoden gjør det mulig for forskere å utføre atferdstester (f.eks, læring, tilvenning eller roman objekt gjenkjenning) samtidig medto-foton mikroskopisk avbildning og / eller patch-clamp opptak, alle kombinert i et enkelt eksperiment. Dette video-artikkelen beskriver bruken av våkne dyr hode fikseringsanordning (mobil homecage), demonstrerer fremgangsmåten av animalsk tilvenning, og eksemplifiserer en rekke mulige anvendelser av fremgangsmåten.
Introduction
En spennende ny trend i Neurosciences er å utvikle eksperimentelle tilnærminger for molekylær-og celle sondering av nevrale nettverk i hjernen av våken, oppfører gnagere. Slike tilnærminger holder lover å kaste nytt lys over nevrofysiologiske prosesser som ligger til grunn motorisk funksjon, sensorisk integrasjon, persepsjon, læring, hukommelse, samt skade progresjon, nevrodegenerasjon og genetiske sykdommer. Videre opptak fra våken dyrets hjerne holder løftet i utvikling av nye terapeutiske midler og behandlinger.
Det er en økende bevissthet om at anestesi, noe som har vært vanlig i nevrofysiologiske eksperimenter, kan påvirke de grunnleggende mekanismene for hjernens funksjon, som potensielt kan føre til feilaktige tolkning av eksperimentelle funn. Dermed blir mye brukt bedøvelse ketamin øker hurtig dannelse av nye dendrittutløperne og forbedrer synaptiske funksjon 1; En annen mye brukt anesthetic isofluran ved kirurgisk anestesi nivåer helt undertrykker spontan kortikal aktivitet i nyfødte rotter og blokkerer spindel-burst svingninger i voksne dyr 2. I dag er bare et begrenset antall tilnærminger aktiver eksperimenter i ikke-bedøvet mus ved hjelp av to-foton mikroskopisk bildebehandling eller patch-clamp opptak. Disse metodene kan deles inn i fritt bevegelige og hode-faste preparater.
Den unike attraktivitet av et fritt bevegelige dyr preparatet er at det tillater vurdering av naturlig atferd, inkludert hele kroppsbevegelser under navigasjon. En måte å bilde inne i hjernen til en fritt glidende gnager er å feste en miniatyrisert hodemontert mikroskop eller fiberskop 3-5. Men miniatyriserte enheter har en tendens til å ha begrenset optisk ytelse i forhold til objektiv-basert to-foton mikroskopi, og kan ikke være lett kombineres med hele cellen patch-clamp opptak seks.
Den exibrodd løsninger for hode-feste en våken gnager har stolt primært enten på fysisk tvang 7,8 eller på trening dyret til å stille frivillig hodestøttene ni. En annen populær metode er å la dyrets lemmer å flytte ved å plassere den på, for eksempel, en sfærisk tredemølle 10; denne tilnærmingen er ofte kombinert med datagenerert virtuell virkelighet. Elektrofysiologiske eksperimenter på hode-fast mus har for det meste brukt ekstracellulære innspillinger og ble brukt til å studere sentrale regulering av kardiovaskulær funksjon 11, effektene av anestesi på nerveaktiviten 12, hørsels respons i hjernestammen 13 og informasjonsbehandling 14. Den banebrytende intracellulære / hel-celle opptak i våken oppfører dyr ble utført på 2000-tallet, og har fokusert på nevral aktivitet knyttet til persepsjon og bevegelse 15-20. Rundt samme tid ble de første mikroskopiske imaging studier på våken mus pubblert, hvor to-fotonmikroskopi ble anvendt i det sensoriske cortex i rotter fysisk i setet 7, og på mus som kjører på en sfærisk tredemølle 21..
Påfølgende in vivo mikroskopi og elektrofysiologiske studier viste at et hode fiksering forberedelse kan med hell kombineres med atferds paradigmer basert på forbena bevegelser, lukt anerkjennelse, visping, og slikker 8,22-25. Mus plassert på sfærisk tredemølle kan trenes til å navigere i virtuelle visuelle miljøet generert av en datamaskin 10,26. Intracellulære / ekstracellulære opptakene viste at i en head-fast dyr navigerer slikt virtuelt miljø, kan aktivering av hippocampus sted celler oppdages 27. I en virtuell visuelle miljøet, mus viser normal bevegelse relaterte theta rytme i det lokale feltet potensial og theta-fase presesjon under aktiv bevegelse 27. Nylig, den romlige og tidsmessige activity mønstre av nevronale populasjoner ble registrert optisk mus i løpet av arbeidsminnet beslutning oppgaver i et virtuelt miljø 28.
Til tross for å ha slått banebrytende forskning, har den sfæriske tredemølle utformingen flere iboende begrensninger. Først er det dyret som kreves for å flytte på et ubegrenset overflaten av en roterende luft løftet ballen, noe som utgjør ingen konkrete hindringer som vegger eller hindringer. Denne begrensningen er bare delvis kompensert av datagenererte "virtuell virkelighet", for visuell inngang er kanskje mindre effektive på mus og rotter i forhold til det taktile sanseinntrykk (som whisker-trykks-eller slikke), hvor disse arter naturligvis avhengige på. For det andre kan en betydelig krumning av kulens overflate være ubehagelig for laboratoriemus som brukes til å vandre på et plant gulv i burene. Til slutt gjengir selve diameteren på ballen (minst 200 mm for mus og 300 mm for rotter) den vertikale størrelsen på sfærisktredemølle enhet relativt stor. Dette gjør det vanskelig å kombinere sfærisk tredemølle med de fleste kommersielt tilgjengelige mikros oppsett, og krever ofte å bygge et nytt oppsett rundt tredemølle ved hjelp av skreddersydde mikroskop rammer.
Her er en ny metode som er beskrevet der en head-fast mus kan flytte rundt en luft-løftet mobile homecage som har flatt gulv og konkrete vegger, og utforske det fysiske miljøet under stress-frie forhold. Denne artikkelen viser prosedyrene for musetrening og hodet fiksering, og gir representative eksempler der to-foton mikroskopi, iboende optisk bildebehandling og patch-clamp opptak er utført i hjernen av våken oppfører mus.
Protocol
Alle de prosedyrer som presenteres her ble utført i henhold til lokale retningslinjer for dyr omsorg (Den finske loven om forsøk med dyr (62/2006)). Dyret lisens (ESAVI/2857/04.10.03/2012) ble innhentet fra kommunen (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA). Voksne mus (alder 1-3 måneder, vekt 20-40 g) ble holdt i gruppe-boliger bur i den sertifiserte dyret anlegget ved Universitetet i Helsinki og utstyrt med mat og vann ad libitum.
En. Kraniell Vindu Implantasjon
Cranial vinduet er implantert i henhold til publiserte protokoller 29-31 med mindre modifikasjoner, som kort beskrevet nedenfor:
- Sterilisere instrumentene før du starter kranie vindu implantasjon. Oppretthold sterile forhold under en operasjon for å redusere risikoen for postoperative komplikasjoner.
- Administrere et analgetikum (Ketoprofen, 2,5 mg / kg) 30 minutter før operasjonen, og 24 timer etter kirurgi. Enesthetize musen ved hjelp av en blanding av ketamin (80 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) injisert intraperi-tonealt. Regelmessig overvåke anestesidybden ved pote klemming. Bruk en varmepute for å opprettholde dyrets kroppstemperatur ved 37,0 ° C. For å redusere kirurgi-indusert inflammasjon og cerebralt ødem, gi deksametason (2 mg / kg) ved sub-kutan injeksjon.
- Påfør øye smøremiddel for å beskytte øynene fra å bli tørr. Barbere musa hode og rengjør det barberte området. Kutt i huden ved hjelp av kirurgisk saks og pinsett langs linjen fra Scruff til pannen. Fjern eventuelle bindevev festet til skallen.
- Sakte og forsiktig bore et lite godt på venstre frontal bein ved hjelp av en høyhastighets kirurgisk drill. Skru et mini bolt (se Materials) inn i boret brønn. Utfør ikke mer enn en-og-en-halv omdreininger på skruen.
MERK: Unngå de områdene som er plassert rett over de overfladiske kortikale fartøy. Forstyrrelse av disse vesSels kan føre til massive blødninger. - For å utføre kraniotomi, bore et sirkulært vindu (3-3,5 mm i diameter) i høyre issebeinet. Påfør en dråpe av cortex buffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2, og 2 mM MgSO 4 i destillert H2O supplert med penicillin 100 enheter / ml og streptomycin 100 ug / ml) og forsiktig fjerne en del av benet som ligger inne i den sirkulære vinduet.
NB: For å uttrykke et fluorescerende protein i en bestemt undergruppe av celler, utføre intrakranial injeksjon av adeno-assosiert virus (AAV) vektor eller andre virale vektorer på dette punkt i fremgangsmåten. - Plasser en runde glass dekkglass (# 1.5 tykkelse kode) på kranie vinduet. Fest dekk til skallen med polyakryl lim. Plasser en metallholderen på toppen av dekkglass og fikse det med en blanding av dental sement og polyacrylic lim.
MERK: Fremgangsmåten er beskrevet ovenfor er optimalisert for kranie vinduerbrukes i optiske bildebehandling eksperimenter. For å fremstille en "invertert" cranial vinduet er egnet for elektrofysiologiske eksperimenter, brukes en annen fremgangsmåte. Først limer metallholderen til skallen. Bor et sirkulært vindu i innehaverens åpning som eksemplifisert i videoen. Alternativt kan en mindre kraniotomi (mindre enn 0,5 mm i diameter) over området av interesse for å forhindre eller minimalisere hjerne bevegelsen 32.. Oppdater kortikale buffer eller plassere en dråpe silikon på kranie vinduet, og lukk den med en rund glass dekkglass. - Etter fullføring av operasjonen, plasseres dyret i en oppvarmet bur med lett tilgjengelige mat og vann. Returner dyret til gruppen-boliger bur bare etter det blir helt frisk fra anestesi. Re-administrere smertestillende ved oppdage eventuelle tegn på smerte, inkludert motvilje mot å bevege seg, spise eller drikke, vekttap, spyttsekresjon, bustepels eller unormale lyder respiratoriske.
2. Animal Håndtering
- Ta musen fra buret sitt og bare holde det for 5-10 min. Være rolig mens håndtering av dyr, unngå å lage jerky bevegelser og lyder.
- Etter håndtering returnere musen til buret sitt.
- Gjenta behandlingen prosedyren 2-3x med ulik intervaller mellom håndtering episoder, for å gjøre musa komfortabel med experimentalist.
- Ta en liten myk fille og pakk dyret 2-3x med ulik intervaller.
- Animal bør forbli rolig og bli vant til å være innpakket. Hvis musen er spent og nervøs, gjentar håndtering og innpakning prosedyrer.
Tre. Animal Training
- Begynn opplæring av dyr i den mobile homecage neste dag etter tilvenning til håndtering og pakking er fullført.
- Spill dyrets veie daglig før og under trening.
MERK: Hvis du under trening, mister dyret over 10% av vekten sin, det bør utelukkes fra than eksperimenter. - Justere den vertikale posisjonen av hodet fiksering arm av den mobile homecage enhet for å samsvare med størrelsen av trenet dyret. Kople til luftinntaket av apparatet til den standard laboratorie trykksatt luftutløp (vanligvis enten en gasstank eller en luft-pumpe som gir et tilstrekkelig høyt trykk og hastighet av luftstrømmen, det vil si omtrent 5 bar og 300 l / min).
- Pakk dyret i en fille.
- Sett metallholderen, som er festet til dyrets hode, inn i hodet fiksering arm og godt fikse det ved å stramme skruene. Slå på luftstrømmen og sørge for at luftstrømmen er optimal for fri stiftelse av luft-løftet homecage. Slipp dyret inn i mobil homecage ved å fjerne fille.
- For å tilvenne dyret til støy, gir en konstant eksponering til lyder fra omgivelsene (ved anvendelse av for eksempel radio eller innspilt musikk og tale) ved alle trenings såvel som under forsøkene.
- DUrering første treningsøkt, holde rommet lys på den første timen, deretter slå av lyset fram til slutten av treningsøkten.
- Etter to timers trening i mobil homecage, slipper dyret fra hodet fiksering og returnere den til buret sitt med en tilførsel av vann og mat. La den stå i minst to timer under liggeforhold.
- Rengjør mobilen homecage etter hver treningsøkt ved hjelp av en 70% etanol løsning og skyll den med vann fra springen. Sug opp vannet med engangs papirhåndkle og tørk mobil homecage før neste gangs bruk.
- Utfør sammenhengende treningsøkter for 2 timer, med rommet lyset slått av mens dyret er under opplæring.
- Utfør treningsøkten to ganger daglig.
- Etter 8 til 12 trening, brukes dyret i en eksperimentell sesjon i opp til 2 timer ved en tid.
MERK: Under langvarige treningsøkter som varer mer enn 1-2 timer, bør du vurdere å gi musen wed drikkevann, som kan leveres enten manuelt eller ved hjelp av en pipette holder festet til det mobile homecage rammen. Alternativt kan vann tilføres for ad libitum bruk av dyret ved å plassere viskøse dråper av hydro-gel direkte på veggene av den mobile homecage være.
MERK: Husk å veie dyrene hver dag før trening for å utelukke eventuelle kroniske stress effekter. Ekskluder et dyr fra eksperimentet hvis, på ethvert tidspunkt, demonstrerer det stressreaksjoner som frysing, stemmebruk, eller stress-indusert diaré.
4. Søknader
- To-foton Imaging i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage
- Monter mobil homecage. Sjekk posisjoner av broen og hodet fiksering arm.
- Pakk trent dyr i en fille. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen i hodet festearmen. Fjern fille.
- Rengjør implantert cover glass fra støv meden 70% etanol løsning og la den tørke.
- Plasser en dråpe av fluid nedsenking på deksel klasse. Fortrinnsvis brukes en viskøs løsning, fordi vann vil fordampe raskt.
- Plassere mobil homecage enheten med trent dyr under mikroskopet (med mindre du har en annen, identisk enhet, som står stille i mikros setup).
- Utfør bildebehandling ved hjelp av enten en skreddersydde eller en kommersielt tilgjengelig laser-scanning mikroskop imaging system utstyrt med en femtosecond pulset infrarød laser.
- Finn regionen av interesse ved bruk av den brede feltmodus for fluorescensmikroskop. Bruk lange pass filter for å vurdere hjernens blodkar og velg et passende målområdet etter å ha undersøkt mønsteret av blodkar.
- Slik bilde kortikal vaskulatur, injiserer en 1% oppløsning av 70000 MW Texas Red-konjugert dekstran (eller dens analog), enten inn i halevenen, mens dyret er immobilisert i det rag, eller retro-orbitale mensdyret er plassert i den mobile homecage. Tune to-foton laser til 860 nm og bruke band pass filter (590-650 nm) til å samle lyset. Bruk 515-560 nm utslipp filter for å vurdere de fine detaljene i neuronal morfologi eller nerveaktiviten utnytte, for eksempel transgene mus som uttrykker YFP eller Ca 2 + - sensitive fluorescerende protein GCaMP3 i en undergruppe av nerveceller under Thy1 arrangøren.
- Bruk en passende programvare for bildeopptak.
- Etter bildebehandling, slipper dyret fra hodet fiksering arm ved å løsne skruene. Returner dyret til buret sitt og la den hvile i minst 2 timer før du starter neste bildebehandling økten.
- Oppbevar koordinatene for hver region av interesse (ROI) for påfølgende reimaging. Bilde samme ROIs over tid, og justere koordinater hver gang for å maksimalisere bildeoverlapper hverandre.
- Analysere bildene og lage tredimensjonale rekonstruksjoner ved hjelp av en passende prog.vareer (f.eks ImageJ, etc.).
- Intrinsic Optisk Imaging i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage
- Monter mobil homecage under bildet oppkjøpet kamera av en iboende optisk avbildning oppsett.
- Pakk trent dyr i en fille. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen inn i hodefikser arm.
- Rengjør implantert cover glass fra støv med en 70% etanol løsning og la den tørke.
- Plasser en dråpe glyserol på implantert glass og dekke den med et 8 mm runde dekkglass.
- Plasser en manipulator med luft-blow tube motsatt til kontralaterale vibrissa.
- Justere posisjonen til høyhastighetskamera og fokusere den på kortikale vaskulatur.
- Bruk grønt lys (filter 546BP30) uten kamera filter for å skaffe kartet til fartøyene.
- Fokus dypere inn i hjernebarken, ca 400 mikrometer under kortikale overflaten.
- Til bilde than blod oksygenenivåavhengig (BOLD) optisk signal, plasserer 590LP filter foran kameraet og belyse cortex med rødt lys (filter 630BP30).
- Juster belysning av kortikale overflate slik at det blir jevnt fordelt gjennom regionen av interesse, å unngå overeksponering. Juster belysningsintensitet, slik at området av interesse faller innenfor 70-90% delen av kameraets dynamiske område.
- Bruk LongDaq image oppkjøpet programvare for å samle inn bilder fra kameraet.
- Bruk image oppkjøpet frekvens på 1 til 10 Hz (dvs. mellom 1 og 10 bilder per sekund) for eksperimenter med lav frekvens stimulering (0,05 Hz).
- Slå av lyset i rommet for å forhindre interferens med de iboende optiske signal.
- La det være minst 30 min for musen for å tilpasse seg den mobile homecage.
- Bilde grunnlinjen aktivitet under en 6-minutters episode uten stimulering.
- For å ta opp fremkalt cortical aktivitet, stimulere vibrissa i en 10 sek ON/10 sek OFF-modus (0,05 Hz stimulering) med en høy frekvens (25 Hz) tog av luft puffs for den totale perioden med 6 min.
- Etter image oppkjøpet, slipper du muse fra hodet fiksering arm og returnere den til buret sitt.
- Bruk ikke ytterligere data filtrering for frekvens, fordi amplitudene av stimuleringsrespons har en tendens til å være forholdsvis høy i våken dyr, noe som resulterer i utmerket signal-til-støy-forhold.
- Konverter de oppnådde sett med bilder til *. Tif stabelen filer og analysere dem ytterligere hjelp, for eksempel, den åpen kildekode FIJI programvare (ImageJ). Trekk fra baseline spontan aktivitet fra rammene fremstilt under vibrissa stimulering ved hjelp av bilde Calculator verktøyet. Alternativt kan filterdata i frekvensdomenet ved hjelp av passende programvare.
- Patch-clamp Recordings i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage
- Monter mobil homecage.
- Pakk trent dyr i en fille. Administrer trimethoprime (5 mg / kg) og sulfadoxine (25 mg / kg) for å forhindre bakterieinfeksjon. Plasser dyret i den mobile homecage. Klem metallholderen inn i hodefikser arm.
- Rengjør og steriliser implantert dental sement "cap" og cover glass ved hjelp av en 70% etanol løsning eller 0,5% klorheksidin digluconate og la den tørke.
- Sakte og forsiktig fjerne dekkglass fra metallholderen.
- Oppdater kortikale buffer supplert med penicillin, streptomycin og rense skallen vindu fra rusk med en steril hemostatic tampong.
- Plasser jordelektroden inn i det kortikale buffer.
- Plasser elektrofysiologi heads i en micromanipulator.
- Dikte pipetter fra borsilikatglass, med sikte på spissen motstand som strekker seg fra 6,5 til 8.5MΩ. Fyll lappen pipette med en intracellulær løsning. Sammensetningen av plasteret pipette løsning erfølgende (i mM): 8 KCl, 111 K-glukonat, 0.5 CaCl 2, 2 NaOH, 10 glukose, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, og 5 BAPTA, ble pH justert til 7,2 med KOH. Membranpotensialet verdier må korrigeres for en beregnet flytende krysset potensial på -12 mV 33.
- Target regionen av interesse å bruke stereotaksiske koordinater, og raskt flytte elektroden inn i hjernen og samtidig opprettholde sterk positiv press på pipettespissen. Etter dura mater penetrasjon og pipetten posisjonering, måle spissen motstand og forkaste de elektroder som viser en økning i motstand på mer enn 10 til 15%, for å forbedre den suksessraten av de etterfølgende trinn.
- Reduser positivt trykk til det halve for å unngå svelling av det omkringliggende hjernevev. Ytterligere tiltak er lik standard "blind flekk" protokollen. For å finne et nevron å ta opp fra, senke tuppen inn i hjernen i en stegvis inntil en nervecelle er oppdaget i en nær proximity av pipettespissen, som angitt med en karakteristisk tidsmessige sekvens av elektrode-impedans-endringer. Den viktig indikator på tilstedeværelsen av en neuron er en monoton økning i elektrodemotstanden på tvers av flere etterfølgende trinn fremover i pipetten (vanligvis en 20% økning i pipetten motstand over tre 2-mikrometer trinn).
- For å danne en gigaseal kontakt med målrettet neuron, anvende et negativt trykk, og hyperpolarisering av pipetten.
- Påfør en kort puls på et større undertrykk i cellen for å etablere den hel-cellekonfigurasjonen. Trekk elektroden med 2-3 mikrometer for å holde en god tetning.
- Record spontan eller fremkalt aktivitet i løpet av en ønsket tidsperiode, opp til 20 til 40 min.
- Etter innspilling, fjerne pipetten fra hjernen.
- Oppdater kortikale buffer eller plassere en dråpe silikon på kranie vinduet, deretter lim en runde glass dekkglass på toppen av metallholderen.
- Slipp animal fra hodet fiksering arm ved å løsne skruene. Retur dyret til buret i minst en dag før den neste registrering.
- Analysere data med, f.eks, den Fitmaster programvare.
- Tilvenning-dishabituation Olfactory Test i Awake Mouse Flytte Rundt Mobile Homecage
- Fest et rent bomullsstykke (2 x 2 cm) dyppet i vann fra springen til den indre side av veggen av den mobile homecage ved hjelp av en to-sidig tape. Del den mobile homecage veggen i fire soner ved å plassere fargemerker på yttersiden av veggen, slik at den del av bomull er plassert i midten av "target-sone". Løser dyret i headholder armen som vender mot veggsegment motsatt til "mål"-sonen og tillate den å tilpasse seg til den mobile homecage i 30 min.
- Ta et annet stykke av ren bomull og fukte den med noen dråper av 1% vanilje ekstrakt. Erstatte ren bomull på mobil homecage vegg med den som bærer Vanilla lukt. Presentere lukten for 5 min. Spore bevegelsene til mobil homecage løpet lukten presentasjonsperioden. Estimer nivået av interesse for lukten ved å måle den akkumulerte tid som dyret bruker vender "mål"-sonen i forhold til den totale tiden for mobile homecage bevegelse.
- Gjenta 5-min applikasjonssesjonen tre ganger ved hjelp av lukt av vanilje, med en 5 min inter-sesjon intervall. Bruk en frisk stykke "vanilla" bomull i hver økt.
- Presentere dyret med en samfunnsmessig betydning lukt under siste, femte sesjon. Fukt et rent stykke bomull med noen dråper urin (fremstilt på den foregående dagen fra et dyr av motsatt kjønn) og plassere den på midten av målsonen i 5 min.
- Novel lukt anerkjennelse i våken mus bevegelse rundt mobil homecage
- Fordel veggen i fire soner ved å plassere fargemerker på yttersiden av den mobile homecage veggen. AttACH to rene bomullsstykker (2 x 2 cm) dyppet i vann fra springen til innersiden av veggen i midten av sonene mot hverandre (betegnet som målsone 1 og målsonen 2). Fest dyr i headholder arm overfor en vegg segment utenfor av pulssoner og la den til å tilpasse seg den mobile homecage for 30 min.
- Bytt begge bomulls stykker med de ferske som:. Sted en bomulls stykke våt med 1% vanilje ekstrakt å målrette sone 1 og en annen våt med vann fra springen å målrette sone to Record video av de mobile homecage bevegelser for 10 min i løpet av lukt presentasjon økten. Beregn lukten deltar som prosentandelen av tiden som dyret bruker overfor målsonen en relativ akkumulert tid brukt overfor soner en og to.
- Etter en 10 minutters intervall, plassere et annet par av applikatorene på homecage veggen for den etterfølgende 10 minutters periode. Plasser "vanilla" bomull i målsonen en og bomull applikator våt med en% banan eXtract i målsonen to. Gjør et videoopptak av mobil homecage bevegelser. Beregn preferanse til romanen lukt som prosentandel av tiden som dyret bruker mot veggen segmentet med romanen lukt (målsonen 2) i forhold til akkumulert tid vender soner en og to.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tweezers, Stainless Steel, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For patch pipette production |
| Camera | Foscam | FI8903W | Night visibility |
| Carprofen | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310104001001008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Eyes-lubricant | Novartis | Viscotears | For eyes protection during operation and as viscose solution for immersion |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micro motor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Four-winged metal holder | Neurotar | ||
| Head Holder for Mice | Narishige | SG-4N | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Kwik-Sil | WPI | ||
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Micro dressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microelectrode puller | Narishige | PC-10H | Vertical puller for glass pipette production |
| Micromanipulator | Sensapex | ||
| Mini bolt | Centrostyle | Ref. 00343 s/steel M1.0x4.5 | |
| Mobile Homecage | Neurotar | ||
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| Nonwoven swabs, 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | 1.5 thickness | |
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329, 959-964 (2010).
- Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2013).
- Helmchen, F., Fee, M. S., Tank, D. W., Denk, W. A miniature head-mounted two-photon microscope. high-resolution brain imaging in freely moving animals. Neuron. 31, 903-912 (2001).
- Piyawattanametha, W., et al. In vivo brain imaging using a portable 2.9 g two-photon microscope based on a microelectromechanical systems scanning mirror. Optics letters. 34, 2309-2311 (2009).
- Sawinski, J., Wallace, D. J., Greenberg, D. S., Grossmann, S., Denk, W., Kerr, J. N. D. Visually evoked activity in cortical cells imaged in freely moving animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 19557-19562 (2009).
- Fee, M. S. Active stabilization of electrodes for intracellular recording in awake behaving animals. Neuron. 27, 461-468 (2000).
- Greenberg, D., Houweling, A., Kerr, J. Population imaging of ongoing neuronal activity in the visual cortex of awake rats. Nat Neurosci. 11 (7), 749-751 (2008).
- Fujiwara-Tsukamoto, Y., et al. Reinforcing operandum: rapid and reliable learning of skilled forelimb movements by head-fixed rodents. Journal of Neurophysiology. 108, 1781-1792 (2012).
- Scott, B. B., Brody, C. D., Tank, D. W. Cellular Resolution Functional Imaging in Behaving Rats Using Voluntary Head Restraint. Neuron. 80, 371-384 (2013).
- Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat Neurosci. 13, 1433-1440 (2010).
- Parry, T. J., McElligott, J. G. A method for restraining awake rats using head immobilization. Physiolog & behavior. 53 (5), 1011-1015 (1993).
- Brecht, M., Schneider, M., Sakmann, B., Margrie, T. W. Whisker movements evoked by stimulation of single pyramidal cells in rat motor cortex. Nature. 427 (6976), 704-710 (2004).
- Van Looij, M. A. J., Liem, S. -S., van der Burg, H., van der Wees, J., De Zeeuw, C. I., van Zanten, B. G. A. Impact of conventional anesthesia on auditory brainstem responses in mice. Hearing research. 193, 75-82 (2004).
- Hentschke, H., Schwarz, C., Antkowiak, B. Neocortex is the major target of sedative concentrations of volatile anaesthetics: strong depression of firing rates and increase of GABAA receptor-mediated inhibition. The European journal of neuroscience. 21, 93-102 (2005).
- Margrie, T. W., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv: European journal of physiology. 444, 491-498 (2002).
- Crochet, S., Petersen, C. C. H. Correlating whisker behavior with membrane potential in barrel cortex of awake mice. Nat Neurosci. 9, 608-610 (2006).
- Houweling, A. R., Brecht, M. Behavioural report of single neuron stimulation in somatosensory cortex. Nature. 451, 65-68 (2008).
- Poulet, J. F. A., Petersen, C. C. H. Internal brain state regulates membrane potential synchrony in barrel cortex of behaving mice. Nature. 454, 881-885 (2008).
- Bryant, J. L., Roy, S., Heck, D. H. A technique for stereotaxic recordings of neuronal activity in awake, head-restrained mice. Journal of neuroscience methods. 178, 75-79 (2009).
- De Kock, C. P. J., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16446-16450 (2009).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56, 43-57 (2007).
- Hentschke, H., Haiss, F., Schwarz, C. Central signals rapidly switch tactile processing in rat barrel cortex during whisker movements. Cerebral cortex. 16, 1142-1156 (2006).
- Stüttgen, M. C., Rüter, J., Schwarz, C. Two psychophysical channels of whisker deflection in rats align with two neuronal classes of primary afferents. J. neuroscience. 26, 7933-7941 (2006).
- Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67, 1048-1061 (2010).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (20), 8473-8478 (2011).
- Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation. Nature. 461, 941-946 (2009).
- Chen, G., King, J. A., Burgess, N., O’Keefe, J. How vision and movement combine in the hippocampal place code. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 378-383 (2013).
- Harvey, C. D., Coen, P., Tank, D. W. Choice-specific sequences in parietal cortex during a virtual-navigation decision task. Nature. 484 (7392), 62-68 (2012).
- Holtmaat, A., et al. Long-term , high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 19-22 (2009).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging. J. Vis. Exp. (12), (2008).
- Portera-Cailliau, C., Trachtenberg, J. T., de Paola, V., Svoboda, K., Wilbrecht, L., Holtmaat, A. Imaging Neocortical Neurons through a Chronic Cranial Window. Cold Spring Harbor Protocols. 2012, (2012).
- Garaschuk, O., Milos, R. -I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1 (1), 380-386 (2006).
- Barry, P. H. JPCalc, a software package for calculating liquid junction potential corrections in patch-clamp, intracellular, epithelial and bilayer measurements and for correcting junction potential measurements. Journal of neuroscience methods. 51 (1), 107-116 (1994).
- Golshani, P., Gonçalves, J. T., Khoshkhoo, S., Mostany, R., Smirnakis, S., Portera-Cailliau, C. Internally mediated developmental desynchronization of neocortical network activity. The Journal of neuroscience. 29 (35), 10890-10899 (2009).
- Polack, P. -O., Friedman, J., Golshani, P. Cellular mechanisms of brain state-dependent gain modulation in visual cortex. Nat Neurosci. 16 (9), 1331-1339 (2013).
- Schwarz, C., et al. The head-fixed behaving rat--procedures and pitfalls. Somatosensor., & motor research. 27, 131-148 (2010).
